МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

ОБРАЗОВАНИЯ РФ

КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА ФИЗИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ И ВАЛЕОЛОГИИ

Крюкова Ольга Сергеевна

Генотоксические эффекты у детей - подростков

из Чебулинского района Кемеровской области

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Научный руководитель :

к.б.н., доцент Дружинин В.Г.

Работа допущена к защите Работа защищена

«___» ______ 2001г. «___» ______ 2001г

Зав. Кафедрой ______ с оценкой

Члены ГАК _____________

Кемерово - 2001

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ . . . . . . . . 3

ГЛАВА 1. Обзор литературы. Хромосомный мутагенез и

факторы его вызывающие . . . . . . 6

1.1. Хромосомы человека и основные типы структурных

мутаций хромосом . . . . . . . 6

1.1.1. Денверская система классификации хромосом . . 7

1.1.2. Основные типы хромосомных перестроек . . . 10

1.1.3. Механизмы возникновения хромосомных перестроек . 15

1.1.4. Принципы учета хромосомных аберраций на стадии

метафазы и общие рекомендации к нему . . . . 20

1.2. Спонтанный хромосомный мутагенез . . . . 24

1.3. Специфичность и особенности химического мутагенеза 25

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ . . . . 29

2.1. Характеристика обследованных групп . . . . 29

2.2. Культивирование крови, приготовление препаратов

хромосом и анализ цитогенетических нарушений . . 30

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ . . . 32

ВЫВОДЫ . . . . . . . . . 38

ЛИТЕРАТУРА . . . . . . . . 39

ВВЕДЕНИЕ

Прогресс генетики человека, как и любой другой фундаментальной медико-биологической дисциплины, может в ближайшем будущем существенно расширить подходы и методы решения задач практической педиатрии и, прежде всего, вопросов профилактики не только наследственных заболеваний, но и различных форм патологии мультифакториального генеза [Бочков, 1995].

Проблема донозологической диагностики заболеваний (или риска их возникновения) имеет особую значимость для промышленных регионов, где неблагоприятному техногенному воздействию подвержены большие группы населения, в том числе - детского. Данные эпидемиологических и экологических исследований однозначно показывают, что к числу таких регионов относится территория Кемеровской области, причем неблагоприятному воздействию загрязнителей окружающей среды подвергаются не только жители промышленных городов, но и население сельскохозяйственных районов.

Известно, что в человеческой популяции существует широкий наследственный полиморфизм порога резистентности к токсическому воздействию факторов среды. Это выражается в дифференциации риска возникновения патологии у разных людей, проживающих в сходных экологических условиях. Так как в сложившихся социально-экономических условиях сложно представить возможность быстрого и коренного улучшения экологических параметров среды, то следует искать иные пути решения проблемы профилактики заболеваемости и прежде всего для тех форм, которые этиологически

связаны с воздействием токсических факторов. В этой связи, изучение адаптивных возможностей организма человека в условиях интенсивного загрязнения среды обитания следует проводить на всех уровнях организации: популяционном, организменном, клеточном и молекулярном. Для каждого из этих уровней характерны собственные методические подходы; в частности, клеточный уровень предполагает использование цитогенетического метода, позволяющего выявить степень напряжения генетических систем и, следовательно, оценивать адаптивные резервы на клеточном уровне. Кроме того, цитогенетический метод позволяет экспертировать качество окружающей среды в части загрязнения ее мутагенными факторами химического и лучевого происхождения.

Анализ индивидуальной резистентности к мутагенному воздействию позволяет выявить людей, имеющих повышенный риск возникновения заболеваний различной этиологии. Следует отметить, что отсутствие к настоящему времени научно обоснованной схемы рекомендаций для лиц, относящихся к группам высокого токсико-генетического риска затрудняет использование данных цитогенетического контроля в практической медицине. Вместе с тем, создание, апробация и внедрение такой схемы имеет важное значение, т.к. позволит проводить реальные профилактические и реабилитационные мероприятия в тех случаях, где это действительно необходимо.

На протяжении ряда лет в лаборатории генетики кемеровского государственного университета проводится мониторинг генотоксических эффектов, наблюдаемых в группах детского и подросткового населения Кемеровской области. Представленная дипломная работа включает в себя результаты цитогенетического обследования подростков, проживающих на территории одного из сельскохозяйственных районов области - Чебулинского, осуществленного в рамках этого мониторинга.

Цель работы: изучить степень и характер генотоксического воздействия факторов среды на подростков, проживающих в Чебулинском районе Кемеровской области.

В соответствии с целью в работе решались конкретные задачи:

1, Оценить частоту и качественный спектр хромосомных мутаций в лимфоцитах крови девочек-подростков - жителей сел Усманка и Дмитриевка Чебулинского района.

2. Сопоставить собственные результаты цитогенетического анализа с данными цитогенетического мониторинга подростков пос. Крапивинский Кемеровской области.

3. Оценить вероятные источники загрязнения окружающей среды генотоксическими агентами на территории Чебулинского района.

ГЛАВА 1. Обзор литературы. Хромосомный мутагенез и факторы его вызывающие.

1.1. Хромосомы человека и основные типы структурных мутаций человека.

Использование культуры лейкоцитов для изучения хромосом человека начато работами Г.К. Хрущева и соавт. (1931), А.Г. Андерса и М.С. Навашина (1936). Хсу (Hsu, 1952) и Хьюгес (Hughes, 1952) независимо предложили использование гипотонического раствора для обеспечения разбрасывания хромосом, т.е. их отделение друг от друга в метафазах. Использование гипотонического раствора совместно с колхицином (Hsu, Pomerat, 1953) дало возможность получать и накапливать хорошие метафазные пластинки. Благодаря анализу хромосом клеток из культуры фибробластов было показано, что число хромосом у человека равно 46 (Tjio, Levan,1956; Ford, Hamerton, 1956).

Современная цитогенетика в первую очередь опирается на изучение хромосом в лейкоцитах человека. Культура лимфоцитов обладает целым рядом преимуществ по сравнению с другими объектами, используемыми в тест-системах. Большим достоинством исследований по структурной изменчивости хромосом в культуре лейкоцитов человека является возможность не только качественного, но и количественного учета, что обеспечивает наглядную четность выводов и объективности результатов анализа. Лейкоциты крови нормальных людей в культуре, в основном свободные от структурных мутаций, подвергаются различным экспериментальным обработкам для выяснения характера и степени мутагенности того или иного воздействия. Вместе с тем кровь может быть взята у людей, которые подвергались в то или иное время воздействию мутагенных факторов. В этом случае, регистрирую характер и число мутаций, можно вскрыть последствия от таких воздействий, изучая структурные мутации хромосом в метафазах (Дубинина, 1977).

В исследованиях по цитогенетике человека было показано, что основные закономерности индуцированного мутагенеза хромосом, качественная характеристика типов структурных изменений и особенности их проявления по разным фазам клеточного цикла в принципе одинаковы с ранее изученным индуцированным мутагенезом в клетках растений и животных. Тоже касается и спонтанного мутагенеза. Для учета структурных мутаций хромосом необходимо знание кариотипа соматических клеток человека и всех основных категорий структурных мутаций хромосом.

1.1.1. Денверская система классификации хромосом.

Обычно классификация хромосом строиться на учете размера каждой из хромосом в кариотипе, по положению центромеры и по другим особенностям. Решениями конференций по хромосомам человека в Денвере США (Denver conference, 1960), в Лондоне (London conference, 1966) сведены обширные материалы из многочисленных литературных источников в систему, имеющую в настоящее время общепризнанный характер. Согласно этой системе, 22 пары аутосом были перенумерованы от 1 до 22-й номере уменьшения их длинны, пара половых хромосом обозначена символами Х и У. Кариотип мужчины - ХУ, женщины - ХХ. 22 пары аутосом разделены на семь групп, обозначаемых буквами от А до G. Каждая группа хромосом характеризуется следующими особенностями (рис 1):

Группа А содержит 3 пары длинных хромосом (1-3), каждую из которых можно легко индивидуализировать. Хромосомы 1,3 являются метацентриками, аромосома 2 - субметацентрична;

Группа В содержит две пары хромосом (4-5). Они короче хромосом из группы А и являются субметацентриками;

Группа С содержит 6 пар аутосом (6-12), все хромосомы с субмедиальным расположением центромеры, средних размеров, их трудно индивидуализировать. К этой группе по размеру относится Х-хромосома, которая отличается тем, что заканчивает синтез ДНК позднее других;

Группа D содержит 3 пары хромосом (13-15). Хромосомы средних размеров имеют почти терминальное расположение центромеры - акроцентрики. Все они имеют спутники, морфологически похожи;

Группа Е состоит из 3 пар коротких хромосом (16-18). Хромосомы 16-й пары являются метацентриками. Хромосомы 17-й и 18-й пары, похожи между собой и являются субметацентриками;

Группа F имеет 2 пары коротких метацентрических хромосом (19-20), которые неотличимы друг от друга;

Группа G состоит из 2-х пар хромосом (21-22). Это очень короткие акроцентрические хромосомы со спутниками, трудно различимы, хотя несколько отличаются по величине и морфологии. К ним примыкают У-хромосома, которая несколько длиннее и имеет на длинном плече вторичную перетяжку (Дубинина, 1977).

В настоящее время для более тонкой дифференциации каждой из хромосом человека разработаны новые методы. Однако для исследования спонтанного хромосомного мутагенеза достаточно применения методики рутинной окраски хромосом, в результате которой все хромосомы перечисленных выше групп в исследуемой метафазной пластинке равномерно окрашиваются и хорошо идентифицируются.

1.1.2. Основные типы хромосомных перестроек.

Все хромосомные аберрации, возникающие в соматических клетках человека и регистрируемые на стадии метафазы, разделяются на две основные группы: аберрации храматидного типа и аберрации хромосомного типа. Согласно наиболее распространенному мнению, аберрации хромосомного типа отражают повреждение хромосомы в пресинтетической стадии (G1 - фаза), когда хромосома реагирует как однонитчатая структура, тогда как аберрации хроматидного типа возникают при повреждении хромосомы на стадии ее двух нитей (фаза S и G2) (Buckton K., Evans H., 1973).

Аберрации хромосомного типа.

Исследования соматических клеток в метафазе показало, что цитологически можно различить 7 видов хромосомных аберраций. Типы аберраций, указанных на рисунке 2 в пунктах а - д, образуются в одной хромосомы и могут быть названы внутрихромосомными обменами, а аберрации, указанные в пунктах е и ж, сопровождаются обменом участками между различными хромосомами и называются межхромосомными обменами.

а) Ацентрические фрагменты (терминальные делеции) представляют собой спаренные хроматиды, которые располагаются параллельно друг другу, но не имеют центромеры.

б) Малые фрагменты (интерстициальные, изодиаметрические делеции) - спаренные хроматиды меньшего размера, чем ацентрические фрагменты, имеющие характерный вид спаренных хроматиновых шариков.

в) Ацентрические кольца - спаренные хроматиды в форме кольца, не содержащие центромеры. Различия между малыми фрагментами и кольцами часто бывают произвольными, поскольку они основаны лишь на длине не достигающего интерстициального участка хромосомы.

г) Центрические кольца - спаренные хроматиды в форме кольца, имеющие центромеру.

д) Перецентрические инверсии - результат инверсии сегмента, содержащего центромеру, с последующим его включением в ту же хромосому.

е) Симметрические межхромосомные обмены (реципроктные транслоказы) - аберрации, возникающие в результате обмена между двумя хромосомами, причин дистальные участки двух хромосом транслоцируются от одной к другой.

ж) Асимметричные межхромосомные отмены (дицентрические, полицентрические аберрации). Возникают в результате обмена между двумя или несколькими хромосомами, происходящие таким образом, что проксимальные участки хромосом соединяются, образуя дицентрическую или полицентрическую структуру с сопутствующим ацентрическим пробелом.

Аберрации хроматидного типа.

Аберрации хроматидного типа представлены на рисунке 3. К ним относятся хроматидные разрывы (фрагменты хроматид) и хроматидные обмены. Фрагменты могут быть концевыми интерстициальными и точковыми. Если произошли изохроматидный разрыв и поврежденные концы сестринских хроматид соединились, то из-за притяжения сестринских хроматид на остальной части они остаются лежать параллельно и потому имеют вид дуги. Хроматидные фрагменты, малоудалённые от места повреждения, необходимо дифференцировать от ахроматических пробелов, представляющих собой неокрашенные участки хромосом (частки локальной деспирализации хромосом). О фрагментах говорят в трех ситуациях:

1. Фрагмент сдвинут по длине. 2. Перевернут. 3. Сдвинут по оси.

Обмены хроматидного типа крайне многообразны. Они могут быть между хроматидами одной хромосомы, двух и более хромосом. Кроме того, различают полные и неполные, симметричные и ассиметричные обмены. Все это создает возможность образование большого числа форм обменов. При межхромосомных обменах образуются фигуры три-, квадри-, и мультирадианов, или неправильных форм. Структура обменной аберрации зависит от величины обмениваемых участков, гомологичности хромосом, идентичности плеч, симметричности (эуцентричности) и полноты (рецепроктности) обмена.

1.1.3. Механизмы возникновения хромосомных перестроек

Хромосомные перестройки - это обширный и гетерогенный класс наследственных изменений, включающий выпадение (потери). Добавления (удвоение, умножение) участков хромосом, а также их перемещения в пределах одной хромосомы или между хромосомами.

Исторически эксперименты и теоретически построения по индуцированному мутагенезу значительно опередили работы по выяснению природы генетического материала хромосом. Однако после 1953, когда в работе Д. Уотсона и Ф. Крика (D. Watson, F. Crick,1953) было сделано предположение о структуре молекулы ДНК, о полуконсервативном характере об репликации и о возможной молекулярной природе мутаций, открылась возможность для конкретных исследований как характера повреждений в ДНК, индуцируемых различными мутагенами, так и реальных механизмов репарации этих повреждений. В монографии Н.П. Дубинина (1978) приведены сведения о повреждениях ДНК различными мутагенами.

Обширный класс алкилирующих соединений может производить алкилирование (присоединение метильной или этильной группы) в некоторых позициях к азотистым основаниям (чаще всего к гуанину) или к фосфатным группам полинуклиотидной нити. Алкилированные азотистые основания за счет гидролиза выщепляются из цепочки ДНК, в следствии чего появляются апуриновые или апиримидиновые сайты. В таких сайтах далее может идти гидролиз нестабильных дезоксирибозидных остатков, и в результате возникают однонитевые разрывы в ДНК. Разрывы могут быть и следствием гидролиза после алкилирования фосфатных групп.

Бифункциональные алкилирующие соединения (серный и азотный иприт,митомицин C) своими двумя алкильными группами могут алкилировать сразу два гуанина из двух комплементарных нитей ДНК, образуя при этом внутримолекулярную сшивку.

Такие сшивки - типичный результат воздействия на ДНК также азотистой кислоты и ее солей.

Как видно, большинство первичных изменений в ДНК, вызываемых мутагенами, сами по себе еще не мутации, т.е. не являются изменениями в последовательности нуклеотидов. Эта последовательность может быть изменена только после прохождения поврежденной молекулы через этап репликации. Так, при репликации молекулы, в одну из нитей которой встроена молекула акридинового красителя, против этой поврежденной нити строиться комплементарная ей цепочка, содержащая лишний нуклеотид, вставленный против места, где в поврежденной цепи интеркалирована молекула акридина. Такая вставка нуклеотида, закрепляющаяся в обеих нитях молекулы после еще одной репликации - это уже мутация, обозначаемая как “сдвиг рамки считывания” (frame shift). Сшивки в молекуле ДНК обычно летальны, т.к. не позволяют осуществлять нормальную репликацию из-за невозможности расплетения нитей в месте сшивки. (Смирнов В.Г. 1991).

Однако в работах Р. Кимбола (R. Kimball, 1966) указывалось, что клетка способна к репарации повреждений в ДНК, вызванных действием мутагенов.

В большинстве случаев первичных повреждений после первой же репликации (если они не были репарированны до репликации) напротив них во вновь синтезированной нити ДНК появляется брешь. Ю.А. Митрофанов и Г.С. Олимпиенко (1980) именно состояние такого разрыва в одной из комплементарных нитей ДНК и считают потенциальным повреждением, которое при одних условиях может быть репарировано, а при других - превращается в двунитевый разрыв в молекуле ДНК (хроматидный разрыв).

A. Bender с соавторами ( Bender et al., 1973) считают, что при разрыве в одной из нитей двунитевой молекулы ДНК неповрежденная нить может разрезаться напротив разрыва ДНК-азой, специфичной для однонитевой ДНК.

Полагается, что такой механизм материализует идею резонансного мутагенеза - перенося повреждения с поврежденной нити на неповрежденную.

По мнению Смирнова В.Г. (1991) обменные перестройки при воздействии самыми разными мутагенами возникают благодаря одному и тому же механизму, характеризующемуся воссоединением концов появляющихся разрывов. Условием этого является тесная пространственная ассоциация между участками хроматид одной хромосомы или разных хромосом. При наличии такой ассоциации возникающие в хроматидах разрывы воссоединяются подобно тому, как это происходит при кроссинговере (Беляев И.Я., Акифьев А.П., 1988).

Разные исследователи неоднократно обращали внимание на сходство между процессом кроссинговера и образованием обменных перестроек при контакте хроматид. Впервые такую мысль высказали А.С. Серебровский и Н.П. Дубинин (1929), а затем “Обменную гипотезу” о механизме возникновения перестроек предложил С. Ривелл (S. Revell, 1955, 1974). Результаты, полученные И.Я. Беляевым и А.П. Акифьевым (1988), свидетельствуют о плодотворности сопоставления этих двух процессов.

Ассоциации, между участками хроматид одной хромосомы или разных хромосом, могут устанавливаться между районами хромосом, содержащими высокоповторяющиеся последовательности ДНК. Такие последовательности сосредоточены в гетерохроматиновых районах хромосом - в прицентромерном и интерколярном структурном гетерохроматине. Именно для гетерохромотиновых районов неоднократно описаны цитологически наблюдаемые ассоциации не гомологичных хромосом.

Образование хромосомных аберраций возможно не только на основе рекомбинации в районах локализации высокоповторяющихся не кодирующих последовательностей ДНК, но и на основе рекомбинации между повторяющимися генами, при наличии дубликаций в геноме.

Так же основой для возникновения хромосомных перестроек по рекомбинационному механизму может быть присутствие в геноме значительного числа копий различных мобильных элементов (Смирнов В.Г. 1991).

Вопрос о механизме возникновения хромосомных перестроек стал активно обсуждаться сразу же после установления возможности индуцировать, усилить мутационный процесс при воздействии такого возможного фактора, как различные виды ионизирующих излучений (Г.А. Карсон, Г.С. Филиппов, 1925; Н. Миллер, 1927; L. Stadler, 1928).

А. Стадлер (L. Stadler, 1928) и М.С. Навашин (1931) считали, что первичный эффект в действии Х-лучей на хромосомы - возникновение разрывов. Это положение легко в основу широко известной гипотезы о механизме возникновения индуцированных хромосомных перестроек, созданной в работе К. Сакса (K. Sax, 1938-1942) и Д. Ли (D. Lea 1963, D. Catcheside 1942). В зависимости от стадии клеточного цикла возникают либо хромосомные (при облучении в период G1 до фазы S), либо хроматидные (при облучении в фазах S и в начале G2) разрывы. Большая их часть затем вновь воссоединяется с восстановлением исходной структуры (реституция). Однако если разрывы в разных местах одной хромосомы (или хроматиды) или в разных хромосомах (или хроматидах) в один и тот же момент локализируется близко друг к другу, они могут воссоединится таким образом, что возникают хромосомные или хроматидные делеции (нехватки), транслокации, инверсии, вставки, образуются центромерные или бесцентромерные кольцевые хромосомы, бесцентромерные фрагменты. Отдельные фрагменты, появившиеся сразу в результате возникновения разрывов, могут сохраняться как таковые и без воссоединения с какими-либо другими.

Довольно скоро были получены убедительные данные о возможной модификации мутагенного эффекта излучений благодаря действию дополнительных факторов (температура, инфракрасный свет, понижение концентрации кислорода), из которых каждый сам по себе не оказывал влияние на спонтанный уровень мутационного процесса. Так в опытах К. Свенсона и А. Холлендера (C. Swenson, A. Hollaender, 1946) было показано, что обработка микроспор традесканции инфракрасным светом до или после облучения Х-лучами приводит к значительному увеличению частоты как хроматидных делеций, так и межхромосомных перестроек, причем в максимальной степени этот эффект инфрактасных лучей был выражен при температуре 12 градусов С и уменьшался при более низкой температуре.

Опыты такого рода заставили предположить, что ионизирующее излучение вызывает не только разрывы хромосом, но и некоторые предмутационные, потенциальные изменения в них, которые при дополнительном воздействии слабее действующих факторов могут реализоваться в дополнительные разрывы и перестройки (Смирнов А.Г. 1991).

1.1.4. Принципы учета хромосомных аберраций на стадии метафазы и общие рекомендации к нему.

Окрашенные препараты начинают анализировать под небольшим увеличением микроскопа, чем достигается общая оценка препарата, а именно митотическая активность и наличие метафазных пластинок. Для анализа хромосом требуется иммерсионный объектив.

При проведении метафазного анализа возможны два подхода к учету хромосомных аберраций: с кариотипированием метафазной пластинки и без кариотипирования. Первый подход наиболее точен, но он трудоемок и может быть применен в специальных исследованиях (например, при изучении распределения повреждений по группам хромосом, по длине отдельных хромосом). Второй подход наиболее употребителен и дешев при быстром решении вопроса (Priest, 1969). Так, например, при оценке мутагенности факторов внешней среды достаточно учитывать хромосомные аберрации без кариотипирования.

При анализе обмена наиболее полная информация включает ответы на следующие вопросы:

1) число вовлеченных в обмен хромосом и хроматид;

2) симметричность транслокаций (эу - или анэуцентричность);

3) реципроктность (полнота);

4) гомологичность вовлеченных в обмен хромосом и их идентификация;

5) сравнительная величина участников при транслокации между гомологичными хромосомами.

При анализе каждой аберрации необходимо помнить об одном факте: гомологичные участки сестринских хроматид взаимно притягиваются независимо от их перемещения.

Распознавание парных ацентрических фрагментов обычно не вызывает затруднений. Они могут быть очень маленькими, еле заметными и очень длинными палочнообразными структурами, лежащими, как правило, параллельно друг другу за счет притяжения сестринских хроматид. Полагают, что они представляют собой концевые делеции. Иногда можно наблюдать очень длинные фрагменты, образовавшиеся за счет слияния ацентрических участков двух хромосом. Эти случаи должны отмечаться особо, если в клетках не было дицентриков, поскольку речь идет о повреждении двух хромосом с неполным обменом. Ацентрические фрагменты практически никогда не лежат рядом и на той же оси с фрагментированной хромосомой. Благодаря этому их легко отличить от изохроматидных обменов.

“Точковые” фрагменты - парные округлые образования, без просвета в середине, интенсивно окрашенные, диаметр не менее, чем поперечник хроматиды.

Обе “точки” лежат рядом за счет притяжения сестринских хроматид. Если фрагменты имеют длину или диаметр больше, чем поперечник хроматиды, то считают, что это интерстициальный небольшой участок хромосомы, замкнувшийся в маленькое ацентрические кольцо. Если фрагменты имеют длину или диаметр меньше поперечника хроматиды, то такие фигуры относят к парным фрагментам. Следует, однако, отметить, что строгих доказательств такого деления нет.

Ацентрические кольца могут быть легко распознаны при их хорошем распластывании на стекле. Иногда они располагаются боком. В этих случаях для них характерны овальная форма и отсутствие просвета. Оба сестринских кольца лежат рядом часто с наложением одного на другое в силу притяжения идентичных участков сестринских хроматид.

Кольцевые хромосомы являются замкнутыми структурами, включающими участки большей или меньшей величины обеих плеч. Они относятся к группе внутрихромосомных обменов между двумя плечами. При большом количестве повреждений могут образовываться и дицентрические кольцевые хромосомы.

Точный анализ хромосомных аберраций требует правильно отбирать клетки для исследования и они должны отвечать следующим требованиям:

1) Все хромосомы должны быть хорошо прокрашены и равномерно разбросаны.

2) Не допускается наличие нескольких случайных хромосом в поле зрения.

3) Уровень конденсации хромосом должен находится в следующих пределах:

max - малые акроцентрические хромосомы видны в виде четко выраженных структур, а не в виде точек, т.к. в таком случае их легко можно принять за точечные фрагменты;

min - хромосомы разделены на две хроматиды и лежат отдельно друг от друга.

4) Не допускается наличие в метафазных пластинках хромосом, вошедших а анафазу, потому что их трудно отдиффиренцировать от парных фрагментов.

5) Не допускается анализ метафазных пластинок с большим количеством наложений хромосом, особенно продольных, т.к. в таких случаях можно определить большее количество обменных аберраций, чем имеется в действительности.

6) Из-за технических манипуляций возможны потери хромосом в пластинке. Обычно при учете хромосомных аберраций допускается анализ клеток с числом хромосом от 44 до 47 (Бочков, 1971).

Данные цитогенетических исследований заносят в специальные бланки-протоколы, где отличают число хромосом, общее

число проанализированных клеток, число клеток с аберрациями, общее число аберраций, типы аберраций, а также зарисовки аберраций и их координаты.

1.2. Спонтанный хромосомный мутагенез.

Подразделение хромосомных аберраций на спонтанные и индуцированные являются чисто условными. Так как возникновение любой аберрации обусловлено определенными мутагенными факторами. О спонтанных хромосомных аберрациях говорят в тех случаях когда точная причина их возникновения неизвестна.

Закономерности спонтанных хромосомных аберраций достаточно полно изучены в лаборатории мутагенеза Института медицинской генетики АМН на основе исследований 531 культуры лимфацитов переферической крови 437 здоровых лиц разного возраста и пола (Бочков и др., 1972).

Ниже приведены основные параметры спонтанных хромосомных аберраций в лимфацитах крови человека. При исследовании более 60 тыс. клеток обнаружено, что средняя частота клеток с хромосомными аберрациями составляет 1,2%, а число аберраций на клетку не превышает 0,0124. Сравнение этих показателей у лиц разного возраста и пола не выявило существенных колебаний, т.е. частота спонтанных хромосомных аберраций находится в одних и тех же пределах у индивидов мужского и женского пола в возрасте от 0 до 70 лет. Среди обнаруженных аберраций более 90% составили ацентрические фрагменты (одиночные и парные). Обменные аберрации составили около 6-8%. Распределение исследованных культур по частоте клеток с хромосомными аберрациями оказалось следующим: из 527 изученных культур 30,4% были без аберраций, 38,1% имели по одной аберрантной метафазе и одной хромосомной аберрации, 19,9% - по две, 8,3% - по три, 2,1% - по четыре, 0,4% - по пять, 0,6% - по шесть, 0,2% - по семь. Таким образом, 96,7% исследуемых культур лимфоцитов от здоровых лиц имели частоту аберрантных клеток и хромосомных аберраций в пределах от 0 до 3. Это распределение культур соответствует теоретическому распределению Пуассона, на основании чего можно сделать заключение о том, что максимальный уровень клеток с хромосомными аберрациями в культуре лимфоцитов человека в норме не превышает 3% (Захаров А.Ф., 1992).

Некоторые авторы наблюдали у отдельных индивидов из контрольных выборок клетки с необычно большим числом хромосомных аберраций. Интерпретация таких находок не может быть однозначной, поскольку действие мутагенных факторов трудно оценивать ретроспективно. Это могло быть действие вируса, химического вещества, облучения или это могло быть результат спонтанного мутагенного процесса (Бочков, 1989).

1.3. Специфичность и особенности химического мутагенеза.

Приоритет открытия большинства известных в настоящее время мутагенов, в том числе и наиболее эффективных, широко используемых во всем мире, - формальдегида, уретана, этиленимина, окиси этилена, диэтилсульфата, диметилсульфата - принадлежит советскому генетику И.А. Рапопорту.

Исследования показали, что химические мутагены на несколько порядков превышают активность радиации, часто обладают значительно более специфическими и более тонким действием на клетку (Рапопорт И.А, 1966).

В настоящее время список химических мутагенов насчитывает десятки веществ по числу главных функциональных центров и десятки в расчете на их производные, вместе с тем накапливаются новые сведения о тонкостях действия мутагенов, поэтому систематика их основанная на особенностях химического строения, взаимодействия с генетическим материалом, своеобразия биологического эффекта, представляет определенные трудности.

В классификации, которая нашла наиболее широкое распространение, различают пять основных групп мутагенов:

1. ингибиторы синтеза предшественников нуклеиновых кислот.

2. аналоги азотистых оснований.

3. алкилирующие соединения (из всех обнаруженных на сегодняшний день мутагенов они считаются наиболее сильными).

4. окислители, восстановители, свободные радикалы.

5. акридиновые красители.

Вредное генетическое действие химических препаратов трудноуловимо -попытки оценить генетическую опасность химических веществ, находящихся в окружающей среде, наталкиваются на очень серьезные трудности.

Бесчисленное множество химических мутагенов по разному взаимодействуют с молекулой ДНК. Спектры их биологического действия различны. Хотя и обнаруживают частичное перекрывание (Фогель, 1990).

Химические мутагены проходят через метаболистическую систему организма и самыми непредсказуемыми путями превращаются в другие соединения. При этом они могут потерять свою мутагенную активность, а могут приобрести такие мутагенные свойства, которые отсутствовали у исходного соединения. Особую опасность представляют не мутагенные химические вещества, которые, включившись в метаболизм, превращаются в мутагены. Другие трудности связаны с поглощением, распределением по разным системам органов и выделением, или если выделение не возможно, накоплением этих веществ (Ауэрбах, 1978).

Химические мутагены могут проявлять узкую специфичность в отношении организмов и даже клеток одного и того же организма (впервые идея о специфичности действия мутагенов была сформулирована И.А. Рапопортом ).

Химические агенты, которые мутагены для тест - объекта, не обязательно окажутся мутагенными для человека. И наоборот, вещества, не вызывающие мутации в контрольных опытах, могут вызывать их после метаболистических превращений (Ауэрбах, 1978).

Обязательно надо учитывать комбинированное действие мутагенов (это не просто суммарный эффект в их действии). Иногда при комбинированном действии наблюдали изменение спектра мутаций, причем каждый мутаген в отдельности не обладал способности к индукции мутаций определенного типа (Засухин, 1971).

Другая трудность связана с кривыми доза - эффект. Для химических мутагенов, действующих внутри клетки или организма, кривые доза - эффект не выражают линейной зависимости; они могут иметь резкий подъем или быть более пологими, а иногда бывают двух- или полифазными. Для мутагенного действия некоторых химических веществ характерно наличие порога при концентрации ниже некоторой определенной величины они не вызывают мутаций (Ауэрбах, 1978). До сих пор не выяснена специфика действия малых и острых доз. Имеются данные, что малые дозы в пересчете на единицу энергии более эффективны в сравнении с острыми дозами (Дубинин, 1986).

Хромосомные аберрации, индуцированные химическими факторами возникают почти исключительно в S - фазе независимо от того, на какой стадии цикла клетка подвергалась воздействию. Т.е. большинство аберраций будут хроматидного типа (Руководство по изучению генетических эффектов в популяции человека, 1989), хотя для общей гипотезы и имеются исключения (Evans Vijaylaxmi, 1980; Beston Gooch, 1981). Разрывы локализуются главным образом в гетерохроматиновых районах (Прокофьева-Бельговская, 1986).

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика обследованных групп.

 В соответствии с поставленными задачами проведено цитогенетическое обследование в группах девочек-подростков, проживающих в с. Усманка и с. Дмитриевка Чебулинского района Кемеровской области. В качестве группы сравнения была использована группа девочек близкого возраста, проживающих в п. Крапивинский Кемеровской области - населенном пункте не имеющем промышленных предприятий и интенсивного движения транспорта. Всего обследовано 52 подростка (табл.1), в том числе 25 человек из Чебулинского района и 27 человека из Крапивинского.

Возраст обследованных в группе сравнения варьировал в пределах 14-17 лет при среднем значении - 15,72 года; в группе девочек из Чебулинского района средний возраст составил 14,4 лет при индивидуальных вариациях 13-15 лет (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1

 Возрастная структура обследованных групп детей

Группа	Число обследованных	Средний возраст	Вариации возраста
Усманка	12	14,7	13 - 15
Дмитриевка	13	14,0	13 - 15
Крапивино	27	15,7	14 - 17

-30-

Сбор анамнестических данных проводили путем устного анкетирования и анализа индивидуальных медицинских карт. В исследование не включали детей, подвергавшихся вакцинациям и рентгендиагностическим процедурам в течение 3-х месяцев до сбора материала.

2.2. Культивирование крови, приготовление препаратов хромосом и анализ цитогенетических нарушений.

  Материалом для исследования являлась цельная периферическая кровь, которую забирали у доноров в асептических условиях, с немедленным помещением в гепаринизированный флакон (0,5% раствор гепарина ф."Рихтер"). Посев культур проводили в течении суток после взятия крови.

Для анализа хромосом осуществляли подготовку препаратов с использованием стандартного полумикрометода культивирования лимфоцитов [Hungerford et al., 1965]. Фиксацию материала проводили в 3-х сменах охлажденного этанол-уксусного фиксатора (3:1). Клеточную суспензию раскапывали на чистые охлажденные, смоченные водой предметные стекла. Препараты сушили над пламенем спиртовки, шифровали и окрашивали 2% раствором красителя Гинзы.

Учет хромосомных аберраций проводили согласно общепринятым требованиям [Бочков и др., 1972; Carrano, Natarajan, 1988]. Ахроматические пробелы (гепы) в число аберраций не включали и учитывали отдельно. Для оценки цитогенетических эффектов определяли общее количество аберраций и их качественный спектр на 100 проанализированных метафаз от каждого донора.

Статистическую обработку фактического материала проводили с использованием программы “STATISTICA for WINDOWS 5.0”; сравнение экспериментальных групп выполняли методом непараметрической статистики Манна-Уитни.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

 Дифференцированное кариотипирование, проведенное в изучаемых группах, позволило установить наличие нормального кариотипа у всех обследованных детей (46,ХХ).

Цитогенетический анализ уровня спонтанных хромосомных аберраций в исследованных группах дал следующие результаты (табл.2). Из данных приведенных в таблице 2 видно, что средние частоты спонтанной повреждаемости хромосом в группах обследованных детей имеют существенные различия, что прежде всего отражает неодинаковые экологические параметры среды в сравниваемых районах. Так, уровень клеток с хромосомными аберрациями в группе детей, проживающих в п.Крапивинcкий составил в среднем 1,77±0,54%, что не превышает общепопуляционных значений спонтанного мутагенеза, известных из литературы [Бочков, Чеботарев, 1989; Gundy, Varga, 1983]. Таким образом, цитогенетический анализ показал, что воздействие мутагенных факторов среды в п. Крапивинском находится на фоновом уровне, а частота хромосомных аберраций, установленная для группы сравнения, по видимому, соответствует популяционному региональному уровню при отсутствии на человека интенсивного антропогенного воздействия [Дружинин и др., 1995, 1997].

 Вместе с этим, в группах детей, проживающих в Чебулинском районе были зарегистрированы средние частоты повреждаемости хромосомного аппарата, которые значительно превышают аналогичные показатели в выборке сравнения (табл.2). Наиболее неблагоприятные генотоксические эффекты выявлены в группе

-33-

девочек из с. Усманка (9,96 ± 2,88 %); несколько меньшее значение характерно для группы детей из с. Дмитриевка (6,08 ± 0,97%), однако и в этом случае имеется достоверность различий по отношению к показателям мутаций в группе сравнения (Р = 0,000092).

ТАБЛИЦА 2

Уровень цитогенетических нарушений в обследованных группах 

Группа	Число обследованных	Число аберраций на 100 клеток, %, (M±m)	Пределы вариаций, % - %
Усманка	12	9,96 ± 2,88	0 - 35,3
Дмитриевка	13	6,08 ± 0,97	1,3 - 13,7
Крапивино	27	1,77±0,54	0 - 12,5

* При сравнении выборок: "Усманка" и "Крапивино" Р = 0,000312;

"Дмитриевка" и "Крапивино" Р = 0,000092;

"Усманка" и "Дмитриевка" Р = 0,707.

Обсуждая данные, приведенные в табл. 2, можно отметить, что большие значения стандартной ошибки средней в группах детей из Чебулинского района (2,88 для выборки "Усманка" и 0,97 для выборки "Дмитриевка") свидетельствуют о широкой вариабельности цитогенетического ответа на мутагенное воздействие. Действительно, индивидуальные значения частот хромосомных аберраций варьируют от минимальных показателей до 35,3% аберрантных клеток. Этот факт говорит, с одной стороны, о существовании индивидуальной чувствительности к генотоксическому действию. С другой стороны, факт наличия очень высоких частот мутаций хромосом у отдельных детей при полном или почти полном отсутствии мутагенного эффекта у другой части обследованных позволяет предположить, что данные выборки неоднородны по степени воздействия кластогенных факторов на отдельных их представителей.

Известно, что ДНК-повреждающие агенты могут быть различной природы: физической (все виды ионизирующего излучения), химической (химические мутагены) и биологической (вирусы). Для выяснения причинности наблюдаемых в той или иной популяции хромосомных нарушений важное значение имеет анализ качественного спектра регистрируемых аберраций [Бочков,1993]. Основанием для этого служит известный факт о наличии специфики в типах образующихся аберраций, характерных для ионизирующего излучения, по сравнению с аберрациями, вызываемыми химическими мутагенами [Evans, 1982]. Под воздействием облучения в клетках чаще возникают аберрации хромосомного типа, в частности - дицентрические хромосомы, которые считаются испытанным индикатором мутагенного воздействия радиоактивного излучения [Моссэ, 1990]. Такой анализ был проведен на следующем этапе эксперимента; его результаты представлены на рис.4.

Из гистограммы видно, что соотношение одиночных и парных фрагментов хромосом является сходным в двух группах детей из разных сел Чебулинского района (63%/24% для выборки "Усманка" и 67%/30% для выборки "Дмитриевка"). Такое соотношение аберраций хроматидного и хромосомного типа с явным превалированием первых над вторыми указывает на преимущественно химическую природу генотоксических агентов, действующих на детей из Чебулинского района. Вместе с тем, в качественном спектре мутаций в выборках "Усманка" и "Дмитриевка" имеются и определенные отличия. Так в выборке "Усманка" дицентрические хромосомы встречались с частотой 0,87±0,52%, тогда как в выборке "Дмитриевка" аналогичный показатель составил 0,25±0,13%. Следует отметить, что отмеченные частоты дицентроческих хромосом (особенно у детей из с.Усманка) являются достаточно высокими и превышают общепопуляционные значения этого типа аберраций: 0,16% [Bender et al., 1988]. Можно предположить, что причиной появления маркерных для лучевого воздействия мутаций хромосом у обследованных детей из Чебулинского района является хроническое воздействие малых доз радиации на данную популяцию. Это не кажется странным ввиду достаточно близкого расположения с. Усманка от места подземного испытания ядерного оружия (полигон расположен в 10-15 км. от этого населенного пункта).

Основная компонента генотоксических эффектов, выявленных в группах детей из Чебулинского района, все же имеет явную химическую природу и этот факт заставляет искать источник вероятного химического загрязнения среды. Так, например, в 5 километровой зоне от с. Усманка расположен могильник ядохимикатов, причем условия хранения токсических веществ явно не соответствуют нормативам. Можно предположить, что происходит периодическая утечка токсикантов в окружающую среду, что и влечет за собой появление выраженных мутагенных эффектов у детей, проживающих в сельской местности. К настоящему времени можно лишь полагать, что данное химическое соединение (соединения) помимо ДНК- повреждающей активности, обладает колхициноподобным действием, разрушая веретено деления клетки, что выражается в появлении большого числа мутаций геномного типа полиплоидных клеток (рис.4).

Таким образом, результаты цитогенетического обследования девочек-подростков, проживающих в с.Усманка и с. Дмитриевка свидетельствуют о крайне неблагоприятной эколого-генетической обстановке, имеющей место в этих населенных пунктах Чебулинского района, причем причинами этого неблагополучия могут быть факторы как лучевой, так и химической природы. Следствием высокого уровня мутаций может быть увеличение заболеваемости населения района, особенно в части нозологических форм, связанных с повышенной хромосомной нестабильностью: онкопатологии, иммунодефицитные состояния, нарушение репродуктивной функции. Медицинские и социальные последствия загрязнения окружающей среды для жителей Чебулинского района должны стать предметом дальнейшего изучения всех заинтересованных структур: административных, медицинских и экологических.

Выводы.

Результаты полученные в данной работе позволили сформулировать следующие выводы:

1. Уровень хромосомных мутаций в лимфоцитах крови девочек-подростков, проживающих в селах Усманка и Дмитриевка Чебулинского района достоверно превышает аналогичный показатель в группе сравнения (п.Крапивинский).

2. Качественный спектр цитогенетических нарушений указывает на сочетанное действие химических и радиационных факторов.

3. Вероятными причинами загрязнения окружающей среды в Чебулинском районе Кемеровской области являются захоронение ядохимикатов и испытание ядерного устройства.

4. Требуется дальнейшее изучение генетических последствий загрязнения среды на территории Чебулинского района и факторов его вызывающих.

-39-

ЛИТЕРАТУРА

1. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. - М.: Мир, 1978. - с. 443-444.

2. Беляев И.Я., Акифьев А.П. Генетические процессы и проблемы мишени в хромосомном мутагенезе. //Генетика. - 1988. Т.24. №8. с. 1384-1392.

3. Бочков Н.П., Демин Ю.С., Лучник Н.В. Классификация и методы учета хромосомных аберраций в соматических клетках // Генетика. 1972. Т. 8. № 5. С. 133-141.

4. Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. Наследственность человека и мутагены внешней среды. М.: Медицина, 1989. 272с.

5. Бочков Н.П. Анализ типов аберрантных клеток - необходимый элемент биологической индикации облучения // Мед. Радиология. 1993. №2. С. 31-35.

6. Бочков Н.П. Генетические технологии в педиатрии. // Педиатрия. 1995. №4. С. 21-24.

7. Захаров А.Ф. Хромосомы человека. М: «Медицина», 1977., с.80-81

8. Дружинин В.Г., Лифанов А.Ю., Головина Т.А., Ульянова М.В. Цитогенетические эффекты у детей-подростков из разных районов Кемеровской области // "Генетика",1995, N7, С.983-987.

9. Дружинин В.Г., Лифанов А.Ю., Рытенков В.Ю. Цитогенетические нарушения у детей-подростков из Кемеровской области как индикатор экологического неблагополучия региона // "Генетика", 1997. Т.33, N5, С.699-703.

10. Дубинин Н.П. Потенциальные изменения в ДНК и мутации. Популярная цитогенетика. М., 1978. с. 244.

11. Дубинина Л.П. Лейкоциты крови человека - тест система для оценки мутагенов среды. - М.: Наука, 1977. - с. 116.

12. Митрофанов Ю.А., Олимпиенко Г.С. Индуцированный мутационный процесс эукариот. М., 1980. с. - 264.

13. Рапопорт И.А. Супермутагены. - М.: Наука, 1966. - с. 5-8.

14. Руководство по изучению генетических эффектов в популяциях человека. Всемирная организация здравоохранения. - Женева, - 1989 - с. 45.

15. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. - М.: Наука, 1986. - с. 209.

16. Фогель Д. Генетика человека. М.: Мир. 1990. 384с.

17. Bender MA, Preston RJ, Leonard RC, Pyatt BE, Gooch PC, Shelby MD Chromosomal aberration and sister-chromatid exchange frequencies in peripheral blood lymphocytes of a large human population sample// Mutat. Res. 1988.;V.204(3):P.421-433.

18. Buckton K.E., Evans H.J. (Eds) Methods for the analysis of human chromosome aberrations// WHO Report. Geneva. - 1973.

19. Carrano A.V., Natarajan A.T. Considerations for population monitoring using cytogenetic techniques // Mutat. Res. 1988. V. 204. P.379-406.

20. Evans H.I. Cytogenetic and allied studies in population exposed to radiations and chemical agents // New York. 1985. P.429-451.

21. Ford C. E., Hamerton J. Z. 1996. The chromosomes of man. // Acta genet. et. satist. med. v. 6,2,264.

22. Gundy S, Varga LP. Chromosomal aberrations in healthy persons.// Mutat Res. 1983. V.120. P.187-191.

23. Hsy T.C., Powerat C.M. Mammalian chromosomes in vitro II A method for spreading the chromosomes of cells in tissue culture. - J. Heredity v. p. 23.

24. Hungerford P.A. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl. // Stain Techn. 1965. V. 40. P. 333-338.

Tjio J.H., Levan A. The chromosome number of men. Hereditas. - 1956. - V. 42 - p.16