Карбоксипептидаза N является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится Zn²⁺.[54] Фермент имеет оптимум рН 5,5-6,0, активируется ионами Co²⁺ в 5-10 раз, ионами Ni²⁺ в 2-3 раза, ингибируется CuCl₂, HgCl₂, аминопропилмеркаптоянтарной кислотой, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой, ЭДТА и 1,10-фенантролином. Сульфат цинка, хлорид кальция, N-этилмалеимид и ФМСФ не влияют на активность КПN [78]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и гуанидинопропилянтарная кислота с K_i 8,8 нМ и 7,5 нМ, соответственно. КПN ингибируется Met- и Leu-энкефалинами, веществом Р, вазопрессином, окситоцином, тиреотропин-рилизинг-фактором [59].
Уровни мРНК КПN и активности КПN в мозге и тканях в целом коррелируют между собой. Наивысшие уровни мРНК КПN обнаружены в пирамидальных клетках гиппокампа, в передней и промежуточной долях гипофиза, эпендимных клетках боковых желудочков мозга, базолатеральной миндалине, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах. Средние уровни мРНК КПN у крыс обнаружены в таламусе, медиальном коленчатом ядре, коре мозжечка и промежуточной оливе. Наименьшие уровни выявлены в гранулярном клеточном слое гиппокампа, латеральном гипоталамусе, бледном шаре и в ретикулярной формации ножки мозга.
В клетке КПN локализована, в основном, в секреторных гранулах, причем часто совместно с биологически активными пептидами – инсулином [45], энкефалинами [58], вазопрессином [71], окситоцином [70], веществом P [44], атриальным натрийуретическим фактором.[67].
Она обладает, практически, абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми остатками основных аминокислот. КПN хорошо отщепляет остатки лизина и аргинина от Arg⁸-вазопрессин-Gly-Lys-Arg [71], а также превращает ¹²⁵I-Met-энкефалин-Arg⁶ и ¹²⁵I-Met-энкефалин-Lys⁶ в ¹²⁵I-Met-энкефалин. Фермент отщепляет остатки -Lys¹⁵-Lys¹⁶-Arg¹⁷ с карбоксильного конца фрагмента АКТГ (АКТГ_1-14) и остатки аргинина с С-конца гиппурил-L-Arg и Leu-энкефалин-Arg [58]. КПN с очень низким сродством отщепляет остаток гистидина с карбоксильного конца проокситоцина [76].
Следует отметить, что уровень мРНК КПN способен быстро изменяться в ответ на внешние воздействия, вызывающие изменения уровня биологически активных пептидов или уровня их мРНК. Кроме того, в случае синтеза дефектной (неактивной КПN) (мутация в гене, кодирующем КПN) наблюдается нарушение синтеза и секреции многих биологически активных пептидов.
Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на организм и культуры клеток [13], нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КПN свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как энкефалины, АКТГ, b-эндорфин, вазопрессин, окситоцин, нейротензин, меланоцитстимулирующий горомон, вещество Р и др. [6], а также участвует в (алкоголизм, стресс, болезнь Альцгеймера, в общем, в адаптационных процессах. [31]

 

1.2.2 Пептидилдипептидаза А

Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, дипептидил-карбоксипептидаза A, кининаза II, карбоксикатепсин, пептидилдипептидаза А, КФ 3.4.15.1) обладает пептидилдипептидазной и слабыми трипептидилкарбоксипептидазной и эндопептидазной активностями [50]. Он выделен и очищен из разных тканей, в том числе из мозга, различных видов животных[46]. Фермент из всех тканей (эндотелиальная форма), за исключением семенников (тестикулярная форма), имеет очень близкие физико-химические и иммунологические свойства, тогда как фермент из семенников отличается от ангиотензинпревращающего фермента из других источников по молекулярной массе и иммунологическим свойствам.
В мозге обнаружена только эндотелиальная форма. Она состоит из одной полипептидной цепи, имеет молекулярную массу 170-180 кДа и содержит около 13% остатков нейтральных сахаров. Эндотелиальная форма состоит из двух гомологичных доменов, каждый из которых имеет активный центр и центр связывания Zn²⁺ [10].
Отличия в степени гликозилирования приводят к образованию двух иммунологически идентичных форм, одна из которых (эндотелиальная) с молекулярной массой 180 кДа присутствует, исключая семенники, во всех тканях, в том числе и мозге, а вторая (нейрональная) с молекулярной массой 170 кДа – обнаруживается только в мозге, и не присутствует в других тканях.[41]
Имеются единичные сообщения об обнаружении в различных органах и тканях более высокомолекулярных каталитически активных форм АПФ с молекулярной массой 600 кДа, 430 кДа, 330 кДа, 240 кДа, иммунологически полностью идентичных эндотелиальной форме. В настоящее время неясно, являются ли эти формы предшественниками АПФ, или образуются при гель-фильтрации благодаря склонности молекул фермента, как и других мембраносвязанных белков, к агрегации. pI фермента из различных органов и тканей колеблется в пределах от 4,6 до 5,1, что обусловливает дополнительную гетерогенность фермента при электрофоретическом разделении. Полагают, что гетерогенность АПФ может иметь важное значение для избирательности регуляции его активности в различных тканях. [25].
АПФ из различных источников имеет оптимум pH 7,6-8,2, для проявления максимальной активности необходимы ионы Cl^- .[30] АПФ содержит 1 прочно связанный ион Zn²⁺ на каждый активный центр и сильно ингибируется хелатирующими агентами, такими как ЭДТА и о-фенантролином [61]. Фермент ингибируется брадикининпотенциирующим фактором (K_i 40 нМ), дитиотреитолом, 2-меркаптоэтанолом и додецилсульфатом натрия. N-этилмалеимид, бацитрацин, пуромицин, фосфорамидон, тиорфан, ингибитор металл-зависимых основных карбоксипептидаз ГЭМЯК не влияют на его активность [10]. Создан целый класс пептидных аналогов субстратов АПФ с K_i порядка 10-50 нМ, наиболее известные из них каптоприл (IC₅₀ » 20 нМ), еналаприл (IC₅₀ 25-35 нМ), лизиноприл (IC₅₀ 3-10 нМ) [49].
Фермент in vitro катализирует расщепление в общей сложности более 30 биологически активных пептидов и их предшественников [75]. Он превращает ангиотензин I в ангиотензин II (Km 4-70 мкМ), последовательно отщепляет два дипептида с C-конца брадикинина, расщепляет неокиоторфин с образованием киоторфина (K_m 0,58 мМ), Met-энкефалин-Arg⁶-Phe⁷ с образованием Met-энкефалина (K_m 0,30 мМ), вещество P и вещество K, холецистокинин и гастрин, энкефалин, нейротензин, нейрокинины A и B, рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона. АПФ катализирует образование Met-энкефалин-Arg⁶ из Met-энкефалин-Arg⁶-Gly⁷-Leu⁸, отщепляет последовательно два дипептида с C-конца динорфина A 1-8, расщепляет натрийуретический фактор из мозга и предсердий, вазопрессин, окситоцин.
Активность АПФ in vitro ингибируется многими биологически активными пептидами и их предшественниками: неокиоторфином, Met-энкефалин-Arg⁶-Phe⁷, b-липотропином, веществом P, брадикинином, Leu-энкефалин-Arg⁶ и некоторыми дипептидами [10].
АПФ широко распространён в тканях человека и животных. Наиболее высокий уровень АПФ в периферических тканях обнаружен в лёгких и семенниках, в почках активность АПФ примерно в 25 раз меньше, чем в лёгких. В сыворотке крови активность АПФ примерно в 200 раз ниже, чем в лёгких [18]. Активность фермента в мозге сопоставима с активностью в почках. Наиболее высокое содержание АПФ обнаружено в гипофизе и стриатонигральном тракте. АПФ локализован преимущественно в синаптосомах [43]. В стриатонигральном тракте фермент связан с фракцией мембран, содержащей мускариновые рецепторы, причём в этой фракции обнаруживается только нейрональная, но не эндотелиальная форма АПФ. Таким образом, на мембранах дендритов локализована только нейрональная форма АПФ.[41]
Хорошо известно, что АПФ является компонентом ренин-ангиотензиновой системы. В периферических органах и тканях он вовлекается в обмен ангиотензина и брадикинина и является важным звеном регуляции артериального давления, водно-солевого баланса и воспалительных процессов.[60] В последнее время обнаружено, что АПФ вовлекается в определение эмоционального статуса животных, устойчивости к эмоциональному стрессу [12], агрессивности [16], предрасположенности к потреблению этанола, мозговой АПФ вовлекается в формирование наследственно обусловленной гипертонии, в ответ на воздействие стрессирующих факторов [27] и потребление этанола [17]. Ингибиторы АПФ влияют на потребление воды и этанола, усиливают анальгетическую активность Met-энкефалин-Arg⁶-Leu⁷ и подавляют его деградацию в мозге. Каптоприл, кроме того, обладает центральным действием, является антидепрессантом, его антидепрессивный эффект блокируется налоксоном, он пролонгирует и усиливает анальгетические эффекты Met- и Leu-энкефалинов, причём это усиление также блокируется налоксоном. Участие АПФ в некоторых из перечисленных выше физиологических и патологических процессов, а также многие из перечисленных эффектов, вызванных введением его ингибиторов, невозможно объяснить исходя из представления, что единственной функцией АПФ является участие в обмене ангиотензинов и брадикинина. Приведенные факты позволяют предположить, что АПФ вовлекается в обмен и других регуляторных пептидов [10], что подтверждается и достаточно высокой активностью фермента в мозге.

1.2.3 Лейцинаминопептидаза

Лейцинаминопептидаза (КФ 3.4.11.1) проявляет широкую субстратную специфичность и отщепляет практически любые N-концевые аминокислоты, за исключением аланина и цистеина [56]. Она гидролизует амид лейцина лучше, чем ариламид лейцина, с меньшей скоростью расщепляет лизин- и аргининамид. Фермент имеет по данным Хрусталёвой [36] и Fraticante и соавт. [51] молекулярную массу около 62 кДа, по данным Shimamura и соавт. [74] – 53000, по данным Gibson и соавт [56] – 270 кДа, что позволяет предположить возможность существования субъединичной структуры. Он проявляет максимальную активность при нейтральных и слабощелочных значениях pH, активируется ионами Mn²⁺, ингибируется ПХМФС, бестатином и амастатином; пуромицин и арфаменин A не влияют на его активность [72]. Фермент отщепляет остаток тирозина от Tyr-Gly-Gly, Tyr-Gly-Gly-Phe, Leu-энкефалина, динорфина-(1-8), динорфина-(1-10) и динорфина-(1-13), максимальная скорость расщепления наблюдается в случае Leu-энкефалина, с удлинением цепи скорость расщепления субстрата резко уменьшается [56]. Активность фермента равномерно рапределена между серым и белым веществом коры полушарий. Он обнаружен как в цитозольной так и мембранной фракциях головного мозга, особенно высокая активность найдена в миелине. Считают, что лейцинаминопептидазе принадлежит важная роль в инактивации энкефалинов, вещества Р и, возможно, большинства других регуляторных пептидов [36].

1.3 Механизм адаптации к физической работе. Роль регуляторных пептидов

Одним из эндогенных пептидов, широко представленных в разных отделах мозга, в том числе и в эмоциогенных зонах гипоталамуса, является вещество Р. Известно, что вещество Р способно оказывать непосредственное влияние на активность центральных нейронов, в большинстве случаев возбуждая их. Вместе с тем была отмечена способность вещества Р изменять реакции нейронов на нейромедиаторы. Доказано, что вещество Р способно снижать степень выраженности невротических состояний, нормализовать сон, улучшать память и процессы обучения, что позволяет рассматривать его как модулятор физиологических и патологических процессов.
Кроме того, вещество Р, содержащееся в нейронах задних рогов спинного мозга, способно передавать сигналы от периферических болевых рецепторов в центральные отделы нервной системы. Исследования на крысах позволили рассматривать вещество Р, синтезирующееся в гипоталамусе, как один из возможных пептидных факторов устойчивости к эмоциональному стрессу[37]. Вещество Р оказывает также модулярное влияние на метаболизм катехоламинов мозга при эмоциональном стрессе, выражающееся в способности вызвать долговременные изменения содержания норадреналина и дофамина в гипоталамусе и среднем мозге в сторону повышения, что расценивается как проявление центральных нейрохимических механизмов адаптации к эмоциональному стрессу[37].
Экспериментальные данные показывают, что содержание вещества Р в гипоталамусе коррелирует с устойчивостью к эмоциональному стрессу [48]. У больных неврозом отмечены снижение содержания вещества Р в крови и расстройства сна. У экспериментальных животных, подвергнутых эмоциональному стрессу, также нарушается электроэнцефалографическая структура сна. Сон является антистрессовым фактором. Во время бодрствования содержание вещества Р в крови снижается. При полноценном сне его уровень вновь повышается. Введение в организм животных, подвергнутых эмоциональному стрессу, вещества Р восстанавливает нормальную структуру сна. Таким образом, эмоциональный стресс, нарушая сон, лишает организм одного из защитных механизмов, с помощью которого повышается содержание вещества Р и обеспечивается устойчивость к стрессу. Учитывая то, что организм способен сам синтезировать вещество Р в большей степени во время сна, с одной стороны, и то, что содержание этого вещества в гипоталамусе коррелирует с устойчивостью к эмоциональному стрессу, с другой стороны, встает вопрос: каким путем, кроме полноценного сна, можно добиться ускоренного и полного восстановления в организме уровня вещества Р.
Одним из путей достижения этой цели, на наш взгляд, является использование рефлексотерапевтических методов (игло-, электро- и прессотерапии). Воздействуя на определенные биологически активные точки организма, связанные с гипоталамусом и средним мозгом, можно "запустить" выработку данными структурами мозга вещества Р. Физиологический эффект вещества Р как одного из эндогенных пептидов проявляется в модуляторном действии, выражающемся в способности влиять на нейрохимические свойства и катехо-ламиновый метаболизм нейронов, участвующих в формировании эмоциональных реакций, и тем самым прекращать нейромедиаторную интеграцию отрицательного эмоционального возбуждения, от которой зависит продолжительность отрицательной эмоциональной реакции, а значит и возможность развития эмоционального стресса.
В работах М.А. Звягинцевой (1988) [23], К.В. Судакова (1989) [32] разрабатываются способы коррекции и купирования стрессовых реакций и вызванных ими нарушений кровообращения с помощью эндогенных нейропептидов, а именно субстанции Р и пептида дельта-сна. Как показали исследования, субстанция Р обладает антистрессовым действием, улучшает функциональные состояния головного мозга и нормализует АД. Синтез в мозге эндогенных пептидов (вещества Р и, возможно, других эндогенных пептидов) может быть одним из факторов, определяющих генетические и индивидуальные различия в устойчивости к острому и хроническому эмоциональному стрессу и особенность метаболизма биогенных аминов в различных структурах мозга у устойчивых и предрасположенных к эмоциональному стрессу особей. Другими эндогенными пептидами, регулирующими эмоциональные реакции, в том числе и стрессовые, помимо вещества Р, являются эндорфины и энкефалины. Они так же, как и вещество Р, широко представлены в различных отделах мозга, в том числе в эмоциогенных зонах лимбической системы и в промежуточной доле гипофиза[4].
Эндорфины и энкефалины обладают необычайной способностью подобно морфину и героину снимать болевые ощущения. Это так называемые естественные опиаты. Тот факт, что морфин, героин и эндорфины связываются в одних и тех же местах, позволяет предположить, что эндорфины играют роль и в тех разновидностях эмоций, которые не имеют прямого отношения к боли. Ф. Блум и соавт. (1988) [4] показали, что у экспериментальных животных и человека при стрессе происходит выработка и высвобождение эндорфинов в нервных сетях. Высвободившиеся эндорфины, по всей вероятности, действуют двояко. С одной стороны, как опиаты, с другой - как регуляторы эмоциональных (стрессовых) реакций. Как опиаты, они блокируют высвобождение в синапсах задних рогов спинного мозга вещества Р, выделяемого из медленных (безмиелиновых) волокон, проводящих болевые импульсы от болевых рецепторов. В результате этого постсинаптический нейрон подвергается более слабой стимуляции веществом Р и головной мозг получает меньше болевых импульсов. Как регуляторы эмоциональных реакций, они каким-то образом, по всей вероятности через лимбическую систему, регулируют возбуждение, страх и другие стрессовые состояния в соответствии с ситуацией [35].
В настоящее время протеолиз рассматривается не только как процесс катаболической утилизации биологически активных пептидов, но и как регуляторный фактор, функция которого состоит в запуске и прерывании ряда биохимических и физиологических процессов при различных функциональных состояниях организма. Практически неизученным остается вопрос об изменениях в функции ферментов обмена нейропептидов при физической работе, в то время как именно активность этих ферментов определяет уровень биологически активных пептидов в организме и, следовательно, степень адаптации организма к физической работе. Физическую работу можно отнести к факторам стресса.