Рестрикционное картирование

Введение
Картирование генома – быстро развивающаяся область исследований. Для ученых, избравших ее своей специальностью, это одновременно и хорошо, и плохо. Хорошо, поскольку это освобождает нас от необходимости соблюдать узкую направленность в своей работе, а плохо, поскольку мы пока незнаем, какой способ картирования дает наиболее реальную картину структуры генома и, следовательно, какие данные больше соответствуют истине. Оглядываясь на путь, пройденный нами в исследованиях по картированию, мы с сожалением должны констатировать: если бы пришлось начинать все сначала, мы вряд ли бы двигались в том же направлении.
Картирование генома подразумевает создание систематизированной библиотеки клонов, которая полностью представляет геном и содержит набор генетических маркеров, достаточный, чтобы строить физическую и генетическую карты. По ходу исследований мы постепенно приближаемся к истинной структуре. В идеале карты, полученные разными способами, должны быть идентичными. Изучение структуры генома не требует обязательного построения рестрикционной карты, однако некоторые способы картирования автоматически приводят к ее получению.
Цель картирования – облегчать процедуру клонирования известных генов и способствовать поиску в геноме интересующих клонов. Наличие карты позволяет легко соотносить друг с другом результаты разрозненных экспериментов по локализации в геноме различных клонов.

1. Стратегия
1.1 Сравнение клонов
В любом методе картирования генома центральной процедурой является сравнение клонов, позволяющее выявить частичные перекрывания. Наиболее просто перекрывания можно обнаружить с помощью гибридизации. Однако саму по себе гибридизацию нельзя считать удовлетворительным критерием взаимного соответствия клонов, так как имеющиеся в геноме, особенно у эукариот, диспергированные повторы могут давать ложноположительные ответы. Кроме того, прямое сравнение пар – процедура слишком трудоемкая, чтобы использовать ее для реализации программы, требующей сопоставления большого количества клонов. Более приемлемым представляется такой подход, который позволяет постепенно накапливать информацию о каждом клоне, а затем анализировать ее.
Большинство методов картирования в настоящее время основано на обработке ДНК генома одной или несколькими рестриктазами с последующим определением размеров образующихся фрагментов. Для этой цели предложен ряд методик.
Вначале мы бы хотели коснуться приема, использованного нами при анализе структуры генома нематоды Caenorhabdltis elegans. Он получил название «метод отпечатков пальцев» и подразумевает использование неупорядоченных и неполных наборов фрагментов, которые являются характеристикой клона, хотя и описывают его неполностью: фрагменты разделяют с помощью электрофореза в тонкослойном полиакриламидном геле.

1.2 Векторы
Стратегия картирования основывается на анализе случайно отобранных клонов. Совершенно ясно поэтому, что при картировании необходимо иметь как можно более обширную библиотеку клонов. Желательно также, чтобы размер клонированных вставок позволял их использовать в дальнейшем в биохимической генетике.
Первоначально мы выбрали для экспериментов космиды из-за сравнительно крупных размеров акцептируемой ДНК. С тех пор как более 10 лет назад Коллинс и Хон ввели в практику первый космидный вектор, было сконструировано большое количество новых векторов такого рода. Среди них используемый в картировании Caenorhabdltis, векторы серии Lorist, разработанные Литлом и Кроссом. Последние два имеют интересные структурные особенности, в частности наличие постоянного числа копий и, что еще более важно для описываемых здесь методов, присутствие элементов, увеличивающих представительность клональных библиотек: терминаторов транскрипции, предотвращающих влияние векторных генов, возможное при транскрипции клонированных вставок. Эти векторы содержат также промоторные последовательности фагов SP6 и Т7, облегчающие считывание. Методы конструирования, расщепления и дефосфорилирования векторных ДНК описаны Маниатисом.
Я2001 – единственный Я-вектор, использованный при картировании Caenorhabditis. И хотя в этом случае вставка составляет только половину последовательности космидной вставки, клоны оказываются более стабильными. Наконец, для некоторых областей генома отмечено более полное представительство именно в А-библиотеке.
Недавно был получен вектор, с помощью которого можно конструировать искусственные дрожжевые хромосомы. Это открытие сулит переворот в картировании: появляется возможность клонировать фрагменты ДНК, на порядок превышающие по размерам космидные вставки. Вероятно также, что соответствующие геномные библиотеки окажутся более представительными. Метод «отпечатков пальцев» пока пригоден лишь для маленьких YAC, но, используя гибридизацию, можно будет присоединять к космидам и большие фрагменты. Скорее всего, в будущем для картирования генома будет применяться техника подбора пар, специально разработанная для YAC.
1.3 Селекция клонов
Если создан банк клонов и разработана техника подбора пар, остается только выбрать стратегию селекции для дальнейшего анализа клонов. Для небольших геномов более эффективно первоначально подбирать клоны случайным образом. Затем, когда эта возможность исчерпывается, необходимо заполнить оставшиеся пробелы в карте с помощью гибридизацион-ных или других методов.

2. Экспериментальная часть
Поскольку именно космидная библиотека является основой нашей работы, мы решили подробно описать здесь ее создание.
Выделение геномной ДНК
Представленный здесь пример – экстракция ДНК из нематод. Этот метод универсален и включает минимум необходимых манипуляций.
Червей выращивают в жидкой питательной среде, отмывают, быстро замораживают и хранят в жидком азоте, в аликвотах по 1 г.
1. Размельчите одну аликвоту до порошкообразного состояния в ступке, охлажденной в жидком азоте, затем осторожно смешайте ее с 30 мл раствора, содержащего 100 мМ этилен-диаминотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,5% додецилсульфата натрия и 50 мкг/мл протеиназы К-
2. Инкубируйте 2 ч при 50°С.
3. Охладите на льду, добавьте равный объем фенола и экстрагируйте 15 мин при 4°С, медленно перемешивая. Отцентрифугируйте и осторожно удалите водный слой пипеткой с широким носиком.
4. Добавьте два объема 95%-ного спирта и осторожно намотайте ДНК на толстую стеклянную палочку. Отмойте три раза 70%-ным спиртом, высушите на воздухе и суспендируйте в 3 мл раствора, содержащего 10 мм трис-HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА.
Для последующего эффективного получения космид не обязательно использование градиента CsCl.
Приготовление фрагментов
Чтобы избежать ошибок в процессе картирования путем подбора пар по методу «отпечатков пальцев», важно не использовать при приготовлении фрагментов лигазную обработку. Мы предпочитаем двумерную электрофоретическую очистку выделению в градиенте плотности сахарозы, так как это дает более ясную картину распределения по размерам и достаточный выход эффективно клонируемых фрагментов.
Для предотвращения ошибок, связанных с «концевыми эффектами», желательно при анализе библиотеки, полученной на основе частичного гидролиза геномной ДНК, вводить ту же рестриктазу и в анализирующую рестрикционную систему. Так, например, частичная 5а «ЗА1-библиотека, анализируемая с помощью mdIII и Sa «3AI, не будет давать артефактов. Что касается космидных клонов, у которых фингерпринтные картины могут состоять из 20–30 полос, это требование необязательно, однако при картировании клонов концевые эффекты вызывают серьезные затруднения.
1. Подберите необходимые условия для частичного гидролиза. Выберите четыре варианта усиления жесткости обработки так, чтобы получались фрагменты требуемого размера.
2. Гидролизуйте 4 аликвоты по 40 мкг свежеэкстрагированной ДНК. Образцы заморозьте.
3. Перед проведением препаративного электрофореза сравните небольшое количество образца с K/Hindlll-маркерами, проведя электрофорез в 150 мл 0,3%-ного агарозного геля HGT ТАЕ, 1 В/см в течение 16 ч. Для корректного измерения размеров фрагментов все последующие определения должны быть проведены в тех же условиях.
4. После требуемого гидролиза объедините аликвоты ДНК, проведите фенольную экстракцию и спиртовое осаждение.
5. Растворите в 180 мкл раствора ТЕ. Добавьте 60 мкл неде-натурирующего красителя, нанесите в 16 лунок 0,4%-ного агарозного геля LGT ТАЕ.
6. Нанесите в качестве маркеров ТП и интактную ЯДНК- В препаративном геле это не укажет вам точно размеры фрагментов, но поможет аккуратно отрезать полоски геля. Проведите электрофорез в течение 20 ч при 1 В/см и окрасьте гель бромидом этидия.
7. Результат электрофореза вы можете увидеть, поместив гель под длинноволновую ультрафиолетовую лампу. Отрежьте полоски по 2 мм шириной от всех 16 дорожек для отделения гидролизованного материала.
8. Расплавьте агарозный гель, нагревая в течение 10 мин требуемые образцы при 68°С в пластиковых пробирках. Проведите фенольную экстракцию, сконцентрируйте изобутанолом до 0,3 мл, переосадите спиртом и проанализируйте фрагменты, как указано выше. 9. Проведите повторно препаративный LGT-гель-электрофорез для очистки выбранной вами фракции, экстрагируйте ее из требуемой полоски геля и окончательно проанализируйте минимальную аликвоту в аналитическом варианте. Ожидаемый выход –2–4 мкг ДНК из 160 мкг материала. 10. Растворите в 20 мкл ТЕ.
Смеси для упаковки космид
В продаже имеется большое количество упаковочных смесей, но из соображений экономии можно готовить их самим. Для этих целей мы с успехом использовали штаммы Escherichia coli: NS428 и NS433. Упаковочные смеси, полученные нами, позволяли получить до 10⁶ космидных рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК-
Получены сведения, что Есо К-активность в упаковочных смесях может влиять на репрезентативность Я-библиотек, однако нет данных, что это возможно и для космидных. Имеются в продаже коммерческие Есо К-упаковочные смеси.
Соединение фрагментов с вектором
Предлагаемый метод пригоден для лигирования частичных гидролизатов Sau3Al в вектор Lorist2.
1. Добавьте вместе 1 мкл BamHI-обработанного де-фосфорилированного Lorist2; 2 мкл приготовленных 5аиЗА1-фрагментов; 2 мкл 10 X лигазного буферного раствора; 2 мкл 10 мМ АТР, рН 7,4; 2 мкл 0,1 М дитиотрей-тола; 10 мкл воды и 1 мкл лигазы. Для достижения максимально возможного лигирования поместите смесь в закрытый капилляр.
2. Инкубируйте 16 ч при 14°С.
3. Осторожно упакуйте, руководствуясь соответствующей методикой.
4. Храните библиотеку при 4°С под хлороформом.
5. Разведите 5 мкл упакованной библиотеки в 0,1 мл раствора для разведения.
Добавьте 0,2 мл стационарной культуры клеток. Мы используем для этих целей линию 1046. Ее следует регулярно пересевать через отдельные колонии, контролируя признак reck.
Инкубируйте 20 мин при 37°С. Добавьте 0,5 мл раствора CY и проинкубируйте дополнительно 50 мин. Высейте разные объемы на чашки с канамицином. Ожидаемый выход – 10⁵–10⁶ рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК.

Заключение
В настоящее время около 90% генома С. elegans клонировано в космидах. Количество клонов, благодаря космидным стыковкам упало с 900 до 700 и снизилось еще при использовании YAC-стыковок. Одна треть кажущихся разрывов между космидными цепочками на самом деле представляет собой еще невыявленные небольшие петли; существует большое количество реальных разрывов, для которых космидные клоны очень редки или недоступны для получения. В этом случае многие исследователи надеются решить проблему с помощью больших цепочек. Мы осознаем всю важность и актуальность скорейшего заполнения разрывов.
Наш опыт подсказывает, что использование космид для картирования геномов эукариот не лишено недостатков, хотя этот метод оказался очень удачным, по крайней мере для одного прокариота. Весьма вероятно, что быстрое заполнение разрывов в карте будет обеспечено методом YAC. Скорее всего, удастся получить Я-клоны, необходимые для более точного заполнения брешей в космидной карте.
Прописи растворов
1. ТЕ: 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА.
2. 10X лигазный буфер: 0,5 М трис-HCl рН 7,4, 0,1 М MgCl₂.
3. 10X средне-солевой рестрикционный буфер: 500 мМ NaCl, 100 мМ трис-HCl рН 7,4, 100 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотрейтола.
4. 10 X ТВЕ в г/л: 108 г. трис-основания, 55 г. борной кислоты, 9,3 г ЭДТА.
5. 50 X ТАЕ: 242 г. трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0, вода до 1 л.
6. 4%-ный денатурирующий гель: 480 г. мочевины, 38 г. акриламида, 2 г бисакриламида, воды примерно 800 мл. Растворить при незначительном нагревании. Добавить 20 г. смолы Амберлит МВ-3, медленно перемешивать 1 ч. Профильтровать через стеклянный фильтр N2. Добавить 100 мл 10х ТВЕ и воды до 1 л.
7. Краситель с формамидом: 100 мл деионизованного формамида, 0,1 г ксиленцианола FF, 0,1 г бромфенолового синего, 0,3 г ЭДТА.
8. Прокипяченная РНКаза: 100 мг РНКазы А, 10 мл 10 мМ трис-HCl рН 7,4, 15 мМ NaCl. Инкубировать при 100°С 15 мин. Охладить, разлить по пробиркам, хранить образцы при –20°С.
9. 2Х TY-среда в г/л: 16 г. триптона, 10 г. дрожжевого экстракта, 5 г NaCl. Довести рН до 7,4. 10. CY-среда в г/л: 10 г. казаминокислот, 5 г дрожжевого экстракта, 3 г NaCl, 2 г КС1. Довести рН до 7,0.
11. 20Х SSPE: 104 г. NaCl, 15,6 г NaH₂P0₄X2H₂0; 3,7 г ЭДТАх2Н₂0; 25 мл 4 М NaOH и воды до 500 мл.
12. Буфер для разведения фага К: 10 мл 1 М трис-HCl рН 7,4, 5 мл 1 М MgS0₄, 11,7 г NaCl, 1 г желатины, воды до 1 л.