ГОУ ВПО

(КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ)

Биологический факультет

Кафедра генетики

Реферат для большого практикума по молекулярной

генетике и иммунохимии

Тема: Иммунологические методы, основанные

на взаимодействии антиген – антитело

Преподаватель

д.м.н. А.В. Шабалдин

Работу выполнила

ст. 5 курса

биологического факультета

Лунина А.А.

КЕМЕРОВО 2007

Содержание

Введение

1. Двойная радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони

   0. Принцип

   1. Проведение иммунодиффузии

   2. Оценка результатов

   3. Определение титра

   4. Область применения

2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену

   0. Принцип

   1. Проведение иммунодиффузии

3. Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини

   0. Принцип

   1. Проведение исследования

   2. Оценка метода

4. Нефелометрия

   0. Принцип метода

   1. Проведение исследования

   2. Оценка метода

5. Иммунодот и иммуноспот

6. Список литературы

Введение

В современное время широко используют методы, основанные на взаимодействии антиген – антитело. К данным методам относятся методы иммунодиффузии, нефелометрии, иммунодот и иммуноспот. Они широко используются для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными. Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных.

1. Двойная радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони

1.1. Принцип

В слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для антигена и антисыворотки и заполняют их соответствующими растворами. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в полях геля и становятся видимыми как линии преципитации.

1.2. Проведение иммунодиффузии

Расплавляют агар (1,5 г) на водяной бане в 100 мл одного из предлагаемых растворителей (0,15 М раствор Na Cl, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1). Горячий агарозный гель разливают по 3 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально.

Чтобы усилить сцепление геля с поверхностью стекла, предметные стекла рекомендуется покрыть агаровой пленкой. Для этого на стекло наносят 1%-ный водный агаровый золь и высушивают при 70°С.

В зависимости от задачи иммунохимического анализа для вырезания лунок в геля применяют либо специальные штампы разного профиля, либо инъекционные иглы, металлические или стеклянные трубочки с разными краями. Лунки для антигенов и антисыворотки располагают на расстоянии не менее 4 и не более 10 мм.

Заполнив лунки соответствующими растворами, пластинки помещают во влажную камеру. Иммунодиффузию можно проводить при 4, 20 и 37°С. Она длится не менее 24ч и может продолжаться до 6-7 дней. Образование новых линий преципитации следует наблюдать ежедневно. Продолжительность иммунодиффузии зависит от конкретной задачи исследования и от ряда других факторов. Результаты иммунодиффузии учитывают непосредственно на влажном препарате или сначала удаляют непреципитировавшие белки. Для этого препараты 2-3 раза погружают на 12 ч в ванночку с 0,15 М раствором NaCl, затем поверхность геля накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде, и высушивают при комнатной температуре. Высушенные препараты окрашивают, например амидо-черным 10В, и учитывают результаты иммунодиффузии.

1.3. Оценка результатов

Число линий преципитации

У разных антигенов часто бывают сходные коэффициенты диффузии. Поэтому в многокомпонентных системах антиген-антитело в одном и том же участке геля могут появиться преципитаты разной специфичности, образующие одну линию преципитации. В других случаях концентрации антигенов и антител и их соотношения могут оказаться настолько неблагоприятными, что заметной преципитации просто не произойдет. Поэтому число видимых линий преципитации обычно меньше числа систем антиген-антитело и лишь в лучшем случае равно ему.

Расположение преципитатов между лунками

При оптимальном соотношении между антигеном и антителом линия преципитации располагается почти посередине между лунками. Количественное преобладание одного из реагентов сдвигает линию преципитации к лунки другого реагента. Относительная концентрация реагентов в месте первоначальной преципитации может изменится, например из-за дополнительного поступления одного из них; тогда происходит сдвиг фронта преципитации, но часть иммунных агрегатов, особенно на стороне избытка антител остается в прежнем положении, и их можно обнаружить в виде вуали или отдельной зоны преципитации. Возможность подобных явлений заставляет при длительной иммунодиффузии ежедневно просматривать препараты.

Взаимное расположение линий преципитации: сравнительный анализ

Для выявления полной или частичной идентичности в геле обычно вырезают три лунки, расположенные треугольником. В две из низ помещают сравниваемые растворы антигенов, а в третью – антисыворотку.

Если линии полностью сливаются, то антигены полностью идентичны. Если линии пересекаются, то антигены не идентичны. Если одна из линий длиннее другой, и выходя из нее образует шпору, то антигены частично идентичны. Оба антигена имеют некоторые общие детерминанты, но у одного антигена имеются детерминанты, которых нет у второго, именно они образуют шпору. Если две линии преципитации пересекаются, частично сливаясь, антигены имеют как одинаковые, так и различные детерминанты.

1.4. Определение титра

Готовят последовательные двукратные разведения изучаемого антигена и равные объемы каждого разведения вносят в лунки, расположенные по периферии той лунки, в которой антисыворотка (стандартный объем). При оценке результатов иммунодиффузии учитывают:

1. расстояние, отделяющее линию преципитации от центральной и периферических лунок;

2. последнее разведение антигена, которое еще дает видимый преципитат;

3. интенсивность и ширину полос преципитации.

Последнее разведение антигена, дающее преципитат, считают его титром. Подобным образом можно титровать содержание антител в антисыворотке.

1.5. Область применения

Качественный анализ, например для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными.

Метод обладает высокой специфичностью, при количественных вариантах иммунодиффузии ошибка метода составляет 3-7%.

2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену

2.1. Принцип

Гель, содержащий антисыворотку, помещают в стеклянные трубки или пробирки. Трубки вертикально погружают в раствор антигена, и в пробирках раствор антигена наслаивают на гель. Антигены диффундируют в гель со скоростью, пропорциональной их концентрации, и, соединившись со специфическими антителами, образуют с ними беловато-мутные преципитаты. Число линий преципитации зависит от числа реагирующих систем антиген-антитело. Чем продолжительнее диффузия, тем дальше фронт преципитации каждой линии удаляется от границы, разделяющей гель и жидкость. Расстояние, которое он проходит за определенное время при строго постоянной концентрации антисыворотки в геле, зависит только от концентрации диффундирующего антигена. При постоянных условия опыта (температура, серия антисыворотки и ее концентрация в геле, концентрация самого геля) с помощью простой линейной иммунодиффузии можно определять количество антигена.

2.2. Проведение иммунодиффузии

Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки, стандартные растворы антигенов и рабочий стандарт, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1. Специальный агар Noble; стеклянные капилляры для определения гематокрита длиной около 50 мм, с внутренним диаметром 1-1,5 мм; измерительная лупа с точностью до 0,1 мм.

В стеклянные капилляры насасывают и выдувают обратно 1%-ный горячий золь агара на воде. Затем капилляры высушивают при 70°С. Образовавшаяся агаровая пленка усиливает сцепление геля со стеклом и препятствует образованию щелей, в которые мог бы проникнуть антиген.

В 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендируют 2 г сухого агара и нагревают на водяной бане до расплавления. Агар охлаждают до 48°С и смешивают с равным объемом подогретой до 48°С антисыворотки. В эту смесь погружают капилляры, с тем чтобы она заполнила их на 2-3 см. Когда гель затвердеет, капилляры готовы к употреблению.

Капилляры погружают в растворы антигенов, но перед погружением капилляров в антиген следует довести температуру всех реагентов до нужной величины, например до 4°С. Реакция длится 48 ч. Затем измеряют расстояние, которое прошел фронт преципитации в каждом капилляре.

Для того, чтобы антиген мог диффундировать в гель, содержащий антитела, он должен быть в избытке. Скорость миграции преципитата К можно вычислить, разделив расстояние h, на квадратный корень из времени диффузии t.

При постоянном времени диффузии между логарифмом концентрации антигена и расстоянием, которое проходит фронт преципитации, существует прямая линейная зависимость. Наклон калибровочной кривой прямо пропорционален квадрату коэффициента диффузии антигена и обратно пропорционален концентрации антител в геле и вязкости геля.

Оценка метода

Критическим фактором является температура. Продолжительность инкубации зависит от величины диффундирующих молекул, чаще всего длится 12, 24 или 48 часов.

3. Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини

3.1. Принцип

На ровную поверхность равномерным слоем наносят гель, содержащий антитела. В геле вырезают лунки и заполняют их раствором антигена. Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. До тех пор пока в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение диаметра кольца преципитации.

3.2. Проведение исследования

Реагенты и приборы

Моноспецифические антисыворотки; стандартные растворы антигенов; рабочий стандарт; веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1; агар; рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, кюветы для элюции из комплекта для электрофореза; измерительный инструмент с точностью до 0,1 мм; микрошприц.

Нагревают 1,5 г агара до полного расплавления в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяной бане и, охладив до 48°С, смешивают в нужной пропорции с антисывороткой, подогретой до той же температуры. Смесь разливают по 2 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально. Золь должен равномерно распределиться по поверхности стекла. Чтобы усилить сцепление геля со стеклом, рекомендуется предварительно покрыть стекло тонкой агаровой пленкой.

В пластинке геля вырезают лунки, рассчитанные на 2 мкл антигенного раствора каждая. После внесения антигена пластинки геля помещают во влажную камеру и проводят иммунодиффузию при комнатной температуре. Кольца преципитации можно измерять прямо на влажной пластинке. Если преципитаты видны недостаточно четко, то сначала элюируют непреципитировавшие белки в двух сменах 0,15 М раствора NaCl по 12 ч, затем гель высушивают и окрашивают красителями, например амидо-черным, и высушивают вновь.

Площадь, занимаемая преципитатом к концу диффузии, прямо пропорциональна исходной концентрации антигена в лунке. Для построения калибровочной кривой берут либо площадь преципитата как функцию концентрации антигена, либо логарифм диаметра преципитата как функцию логарифма концентрации антигена:

S=K*Q_AГ+S₀,

где S – площадь преципитата, включая S₀, S₀ – площадь стартовой лунки и Q_AГ -- количество антигена.

Наклон К полученной прямой обратно пропорционален концентрации антител в геле. Уменьшив содержание антисыворотки в агаре, можно увеличить К. В результате возрастет диаметр преципитата, что повысит чувствительность и экономность метода. Оптимальная концентрация антисыворотки в геле зависит прежде всего от титра антител.

Результаты иммунодиффузии существенно не зависят от температуры. Опыт может быть поставлен при 4, 20 или 37°С. Следует избегать только резких (более 5°) колебаний температуры.

Необходимая продолжительность иммунодиффузии зависит от природы изучаемого антигена. Первый ориентировочный замер преципитатов можно сделать уже через 24 ч.

3.3. Оценка метода

В пределах своей чувствительности радиальная иммунодиффузия пригодна для количественного определения любого антигена, если имеются соответствующие моноспецифические антисыворотки и чистые или стандартные антигены, чтобы построить калибровочную кривую для данной системы.

При помощи этого метода чаще определяют белковые антигены, например белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, секретов желез. Радиальная иммунодиффузия пригодна также для сравнительного качественного и количественного анализа иммунохимически близких белков.

4. Нефелометрия

4.1. Принцип метода

Раствор антигена смешивают с соответствующей моноспецифической антисывороткой и смесь инкубируют. При этом образуются иммунные агрегаты, способные рассеивать проходящий свет. Интенсивность рассеивания или поглощения проходящего света прямо пропорциональна количеству комплексов антиген-антитело, и ее можно измерять фотометрически.

Если объемы реагентов, разведение антисыворотки, время и температура инкубации постоянны и единственной переменной величиной является концентрация антигена, то последнюю можно определить по кривой экстинкции. Чтобы построить такую кривую, с антисывороткой инкубируют растворы антигена возрастающей концентрации. Сначала с увеличением концентрации антигена кривая экстинкции идет вверх, затем, после некоторого максимума, снижается. При постоянном количестве антител подъем концентрации антигена увеличивает не только количество, но и величину иммунных агрегатов. При оптимальном соотношении антигена и антител количество и размер иммунных агрегатов достигает максимума. Область оптимальных соотношений называют зоной эквивалентности. Дальнейший подъем концентрации антигена ведет к уменьшению агрегатов.

4.2. Проведение исследования

Реагенты и приборы

Забуференный фосфатами раствор NaCl. 11,9 г Na₂HPO₄·2H₂O растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl; 9,1 г KH₂PO₄ растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl. Получается буфер с pH 7,5.

Моноспецифические антисыворотки.

Стандартные растворы. Используются стандартные сыворотки с известным содержанием белков или стандартные растворы, приготовленные из чистых белков.

Рабочий стандарт, если требуется определить содержание различных белков в сыворотке или сывороточных белков в других жидкостях организма.

Стандартные растворы, исследуемые образцы и антисыворотки разводят забуференным раствором NaCl с pH 7,5. Определение антигенов производят с кроличьими антисыворотками в разведении 1:5-1:20. Для построения кривой экстинкции сначала готовят серию разведений антигена от 0,5 до 10 мг на 100 мл. К последним разведениям стандартной сыворотки или раствора чистого белка прибавляют равный объем разбавленной антисыворотки, перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20°С) на 2 ч. После этого определяют экстинкцию растворов в проходящем свете при 450 нм в микрокювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (буфер + антисыворотка). С исследуемым образцом поступают так же, как со стандартными растворами. Определяют его экстинкцию и по восходящей части кривой устанавливают концентрацию антигена. Если приходится исследовать мутные или окрашенные растворы антигенов, следует предварительно измерить их собственную экстинкцию, чтобы учесть ее при оценке результатов. Затем с учетом разведения исходного материала вычисляют концентрацию исследуемого антигена.

Полную уверенность в том, что полученная величина экстинкции соответствует области избытка антител, дает исследование, проведенное с несколькими разведениями антигена. Условия инкубации должны быть строго постоянными. Для фотометрии следует выбирать длину волны, лежащую за пределами областей поглощения гемоглобина (400 – 420 нм). Необходимо также учитывать спектр собственного поглощения реагентов и их смеси до образования иммунных агрегатов.

4.3. Оценка метода

Преимущества нефелометрии – относительная простота и быстрота процедуры, а также возможность ее автоматизации. Однако этот метод предъявляет особые требования к качеству антисыворотки. Она должна содержать достаточно антител, чтобы в разведении антител не менее 1:5 обеспечить величину максимальной экстинкции выше 0,2. Антисыворотка должна быть прозрачной.

5. Иммунодот и иммуноспот

Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных. Однако этот метод имеет ряд недостатков. В модифицированном варианте для адсорбции различных антигенов используют нитроцеллюлозные фильтры. Такую модификацию называют dot-ELISA (точечный твердофазный иммуноферментный анализ). В dot-ELISA минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку в виде серии точек. Преципитирующие хромогенные субстраты на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют цветные пятна. Фильтры с результатами анализа могут храниться в темноте в течение многих лет без потери окраски.

В dot-ELISA можно применять различные препараты антигенов. На нитроцеллюлозных мембранах можно сорбировать как жизнеспособные или фиксированные формалином простейшие, так и супернатанты, полученные после разрушения клеток.

Пятно антигена наносят в объеме от 0,1 до 3 мкл. В случае препаратов солюбизированных антигенов предпочтительнее использовать мембраны с малым диаметром пор. При применении целых клеток величина пор не играет большой роли.

Все стадии инкубации и промывки выполняют при комнатной температуре. Сначала диски с антигеном обрабатывают блокирующим раствором (3 – 5%-ный раствор очищенного бычьего сывороточного альбумина в солевом триэтаноламиновом буферном растворе). Можно успешно применять и цельную лошадиную сыворотку или 1%-ный раствор нормальной сыворотки кролика в фосфатном буферном растворе с NaCl. При обнаружении антител 50 мкл сыворотки в 1%-ном растворе БСА-СТБ инкубируют на диске. Антитела специфически связываются с антигеном, сорбированном на диске. Затем диски трижды промывают в растворе детергента (0,05%-ный раствор нонидета Р-40 в СТБ, 0,05%-ный раствор твина-20 в солевом растворе трис- НCl). После промывки диски инкубируют с 50 мкл конъюгата аффинно очищенных антивидовых антител с ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза).

После отмывки несвязавшегося материала добавляют преципитирующий хромогенный субстрат. При окислении субстрата ферментом в присутствии пероксида водорода образуется четкое пятно.

При определении антигенов пробы наносят непосредственно на подложку, затем проводят иммунологическую реакцию или со специфическими антителами и конъюгатом вторичных антител с ферментом и хромогенным субстратом, или с конъюгатом специфических антител с ферментом-маркером и субстратом.

В двухсайтовом dot-ELISA при определении антигенов сначала на подложку наносят специфические антитела. Антигены в пробе связываются с антителами. Потом добавляют меченые специфические антитела против другого эпитопа антигена и проводят реакцию с преципитирующим субстратом. Для таких методик характерна высокая специфичность.

Важным преимуществом метода dot-ELISA является возможность его применения для самых разнообразных медицинских целей. Все модификации dot-ELISA отличаются экономичным расходом реагентов, не требуют приборов с электропитанием для регистрации результатов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. Новые методы иммуноанализа. – М.: Мир, 1991. – С.116.

2. Иммунологические методы. Под ред. Х.Фримеля. – М.:Мир, 1979. – С. 31 – 55.