Поры, каналы и переносчики

Фосфолипидный бислой является очень эффективным барьером для множества небольших растворимых молекул. Тем не менее, через плазматическую мембрану, а также через мембраны, ограничивающие различные органеллы, постоянно транспортируются полярные вещества и ионы. Этот транспорт целиком опосредован белками, и для объяснения механизма переноса растворимых веществ через мембрану было предложено много моделей.

Здесь будет полезно ввести несколько терминов, использующихся для характеристики белков или структур, участвующих в трансмембранном транспорте. В табл. 1 дается классификация транспортных белков. Прежде всего их подразделяют на каналы и переносчики. Поры и каналы часто изображают в виде туннелей через мембрану, в которых места связывания транспортируемых растворимых веществ доступны с обеих сторон мембраны одновременно. Канальные белки не претерпевают никаких конфор-мационных изменений в процессе переноса растворимых веществ с одной стороны мембраны на другую. Напротив, конформация переносчиков в процессе транспорта различных веществ изменяется.

Таблица 8.1. Классификация некоторых транспортных белков, основанная на механизме их действия и энергетике

1. Каналы

1. Потенциалзависимые каналы

Б. Химически регулируемые каналы

2. Другие каналы

11. Переносчики

А. Пассивные унипортеры Б. Активные переносчики

1. Первичные активные переносчики

а. Сопряженные с окислительно-восстановительными реакциями

б. Сопряженные с поглощением света

в. АТРазы

2. Вторичные активные переносчики

а. Симпортеры

б. Антипортеры

Переносимое вещество связывается с одной стороны мембраны, и для высвобождения его с другой стороны в переносчике должно произойти определенное конформационное изменение. При этом в любой момент времени место связывания вещества доступно только с одной стороны мембраны.

Каналы и поры также претерпевают конформационные изменения, однако последние регулируют лишь их открывание и закрывание и не касаются самого процесса переноса. Две основные группы каналов, приведенные в табл. 1, разделяются на каналы, работа которых регулируется изменением напряжения электрического поля или химическим путем. Каналы первого типа открываются или закрываются в ответ на изменение трансмембранного потенциала; наиболее изученными из них являются каналы электровозбудимых клеток, например нервных или мышечных. Каналы второго типа отвечают на действие специфических химических агентов; наиболее детально изученные из них — каналы, связывающие нейро-медиаторы, например ацетилхолин. Так, никотиновый ацетилхоли-новый рецептор при связывании с ним нейромедиатора переходит в открытую конформацию и пропускает одновалентные катионы.

Термины пора и канал обычно взаимозаменяемы, однако под порой чаще понимают некие неселективные структуры, которые различают вещества главным образом по размеру и пропускают все достаточно малые молекулы. Под каналами чаще всего понимают ионные каналы, которые, как теперь известно, широко распространены во многих типах клеток, отличных от нервных и мышечных.

Переносчики можно разделить на две группы: пассивные и активные. Мы будем использовать термин пассивный переносчик в том случае, когда при его участии осуществляется перенос через мембрану единственного типа веществ. Переносчики-унипортеры только увеличивают поток вещества, идущий без потребления энергии, т. е. по градиенту электрохимического потенциала. Такой процесс называется облегченной диффузией. Наиболее полно изученным пассивным переносчиком является переносчик глюкозы в эритроцитах.

Активные переносчики осуществляют перенос веществ через мембрану с затратами энергии, в результате эти вещества накапливаются с одной стороны мембраны. При этом транспорт вещества должен быть сопряжен с другим, запасающим свободную энергию процессом. Почти все первичные активные переносчики являются ионными насосами, в которых перемещение иона прямо сопряжено с поставляющей энергию химической или фотохимической реакцией. Примером ионного насоса является бактериородопсин, который для переноса протонов через мембрану использует энергию фотонов видимого света. В большинстве случаев ионные насосы являются электрогенными: при работе первичного насоса осуществляется перемещение заряда, в результате чего происходит разделение электрических зарядов и на мембране создается напряжение.

Первичные активные переносчики генерируют напряжение и создают трансмембранные ионные градиенты. Вторичные активные переносчики используют такие градиенты в качестве движущей силы для транспорта растворимых веществ. Наиболее полно охарактеризованным примером такого рода является белок — переносчик лактозы из Escherichia coli. Этот переносчик использует протонный электрохимический градиент, генерируемый дыхательной электронтранспортной цепью, в качестве движущей силы для накопления лактозы в клетке. Это пример симпорта, когда через мембрану одновременно переносятся два разных вещества. Антипортеры осуществляют транспорт веществ в противоположных направлениях. Так, например, белок полосы 3 эритроцитов осуществляет сопряженный транспорт CI ~ и НС0₃~ в противоположных направлениях через эритроцитарную мембрану.

Термины перемеаза, транслоказа и переносчик, являющиеся синонимами, часто используют по отношению к транспортным белкам, отличным от первичных активных переносчиков. Обычно термин «пермеаза» применяют при описании бактериальных транспортных белков. Термин «переносчик», по-видимому, лучше использовать по отношению к ионофорам или сходным с ними структурам, которые связываются с ионами и переносят их через бислой в составе комплекса.

Классификация транспортных белков, представленная в табл. 8.1, основана главным образом на энергетике и механизме транспорта растворимых веществ. Однако по мере установления аминокислотной последовательности все большего числа белков появляется возможность разработать другой принцип классификации транспортных белков — на основе их структурного сходства. В табл. 8.2 показано несколько структурно родственных групп каналов и транспортных белков. При этом белки, входящие в состав одной группы, могут выполнять разные фукнции. В качестве примера рассмотрим переносчик глюкозы млекопитающих и переносчик Н ⁺-арабинозы бактерий. Первый является унипортером, который может катализировать только облегченную диффузию глюкозы, в то время как второй способен сопрягать перенос ионов Н ⁺ по протонному электрохимическому градиенту с активным транспортом другого вещества, арабинозы. Ясно, что природа может приспособить одну и ту же структуру к выполнению различных функций.

КАНАЛЫ И ПЕРЕНОСЧИКИ: РАЗНООБРАЗИЕ ФУНКЦИЙ

Функции ионных каналов и переносчиков весьма разнообразны; проиллюстрируем их на нескольких примерах. Так, регулируемые ионные каналы, участвующие в передаче сигнала, в ответ на определенный внешний стимул быстро изменяют мембранную проницаемость для определенного иона. При этом происходит изменение трансмембранного потенциала. К работе такого рода каналов предъявляется ряд требований. Во-первых, внешний сигнал должен вызывать быстрое переключение между открытым и закрытым состояниями канала. Необходимо также, чтобы быстро устанавливалось новое равновесие или стационарное значение мембранного потенциала. При этом очень существенна скорость процесса. Так, когда канал открыт, через бислой может проходить до 10⁶—10⁸ ионов в секунду. Такая величина потока является экспериментальным критерием, позволяющим отличить каналы от переносчиков. Столь большие ионные потоки означают, что открывание относительно малого числа каналов приводит к значительным быстрым изменениям электрических свойств мембраны. Рассмотрим на конкретном примере, как оценить время ответа мембраны на внешний сигнал.

Предположим, что мембрана с емкостью 1 мкФ/см² содержит некоторое число К ⁺ -каналов с проводимостью в открытом состоянии 20 пСм. Проводимость, равная 1 пСм, эквивалентна 6-10* ион/с на 1 В, так что в нашем случае через каждый канал может пройти 1,2-10⁸ ион/с на 1 В. Предположим, что на мембране существует К ⁺ -градиент с соотношением _внутрн/_{снаружи} = 52. Когда К ⁺-каналы закрыты, мембранная проницаемость по К⁺ равна нулю и К* не участвует в образовании трансмембранного потенциала. При открывании каналов происходит перенос ионов К ⁺ по градиенту концентрации до тех пор, пока не установится новое стационарное распределение.

Таблица 8.3. Сравнение скоростей транспорта для некоторых систем"

Система	Скорость
	транспор-
	та, с ~1
Каналы/поры
Натриевый канал	-107
Грамицидин А	-107
Канал ацетилхолинового рецептора	-107
Пермеазы
Н * -Лактозопермеаза Е. coli	30
Переносчик глюкозы	300
Анионный переносчик белок полосы 3
2'	100 000
Активные переносчики
Бактериородопсин	50
Na * /К +-АТРаза"	450
Цитохром с-оксидаза	1000

В результате диффузии ионов К + через мембрану происходит разделение зарядов. При этом достигается равновесное значение трансмембранного потенциала, которое можно определить из уравнения Нернста. Легко подсчитать, что в нашем случае оно составляет 100 мВ. Заряд, необходимый для поддержания этого потенциала, определяется емкостью С, составляющей всего лишь ~ 10" 12 моль/см2. Столь незначительное число переносимых ионов, не вызывая заметных изменений в концентрации К* как по ту, так и по другую сторону мембраны, порождает тем не менее весьма значительный электрический сигнал.

Ключевой характеристикой канала является время, необходимое для достижения нового стационарного состояния после открывания канала. Оно зависит как от емкости, так и от удельного сопротивления мембраны. Если мы примем число открытых каналов равным 50 на 1 мкм2, то время ответа составит 0,1 мс.

В табл. 8.3 приведены значения числа оборотов для нескольких ионных каналов и переносчиков. Обратите внимание, что для ионных каналов и пор характерны очень большие числа оборотов. Напротив, для лактозопермеазы Е. coli максимальное число оборотов составляет всего лишь ~ 30 с ~1. Если бы рассмотренные выше ионные каналы работали с такой скоростью, то для достижения той же удельной проводимости потребовалось бы увеличить плотность каналов в 10 млн. раз, что физически невозможно.

Для осуществления лактозопермеазой ее физиологических функций, конечно, не требуется столь большого числа оборотов, как для каналов. Ее роль состоит в транспорте лактозы — углевода, который затем участвует в клеточном метаболизме. Для ионных насосов, использующих для работы энергию гидролиза АТР или переноса электронов, характерны максимальные числа оборотов 10²— 10³ с¹, что довольно типично для ферментов, но гораздо меньше аналогичных значений для каналов или пор.

Однако не все переносчики работают столь медленно. Анионный переносчик белок полосы 3 из эритроцитарной мембраны играет важную физиологическую роль в усилении быстрого трансмембранного обмена С1" на НС0₃~. Одна из функций эритроцитов заключается в усилении транспорта СОг от различных тканей к легким. В венозных капиллярах СОг быстро диффундирует через эритроцитарную мембрану. В клетке под действием карбоангидразы СОг превращается в Н2СО3, затем быстро устанавливается равновесие Н2СО3 Н ⁺ + НС0₃~, и анион бикарбоната переносится через мембрану в плазму крови белком полосы 3. В результате по мере того, как эритроцит проходит по капиллярам, концентрация НС0₃~ в плазме увеличивается, причем этот процесс занимает меньше 1 с. Когда кровь достигает легких, начинается диффузия СОг в атмосферу. При этом под действием карбоангидразы в эритроцитах происходит массовое превращение Н₂С0₃ в СОг и НгО. Этот процесс в свою очередь является движущей силой для переноса аниона бикарбоната внутрь эритроцита, где он быстро превращается в СОг и НгО.

Транспортная система должна функционировать очень быстро, но в отличие от ионных каналов в аксонах здесь нет нужды в электрогенных реакциях, которые только замедлили бы быстрый массовый транспорт. Но транспорт катиона, например Na ⁺, вместе с НС0₃~был бы нежелателен, поскольку изменение концентрации соли в эритроците привело бы к осмотическому дисбалансу. Эта проблема решается с помощью антипортера, который в обмен на каждый транспортируемый ион НС0₃~ переносит в обратном направлении анион С1". Такая челночная система работает очень быстро, с числом оборотов 10⁵ с¹, что немногим меньше скорости переноса ионов настоящим каналом.

Дополнение 8.1. Время электрического ответа мембраны

Время электрического ответа т является мерой того, как быстро трансмембранный потенциал достигает нового равновесного значения после открывания специфических ионных каналов. В возбудимых мембранах этот параметр является ключевым и определяется емкостью

мембраны С и удельным сопротивлением R. Получим выражение для т.

Начнем с того, что продифференцируем по времени уравнение для емкости:

dQ/dt равно току / и равно нулю, когда напряжение достигает своего конечного значения Ук. Ток через ионный канал пропорционален разности между истинным напряжением и напряжением, определяемым из уравнения Нернста для равновесного состояния при нулевом потоке. В соответствии с законом Ома / = /R. Отсюда

Решение уравнения имеет вид

или где т = RC.

Напряжение на мембране растет экспоненциально от нуля до конечного значения 100 мВ с постоянной времени т, равной RC. Следовательно, произведение удельного сопротивления мембраны R на емкость С имеет размерность времени и характеризует время электрического ответа мембраны. Предположим, что в мембране открыто 50 каналов на 1 мкм². Это значит, что удельная проводимость мембраны составляет 10 мСм/см² и удельное сопротивление мембраны соответственно равно 100 Ом см². В этом случае RC = 0,1 мс, что находится в интервале значений, характерных для возбудимых мембран зависит главным образом от удельного сопротивления мембраны, поскольку емкость определяется в основном липидным би-слоем.

Обратите внимание, что удельное сопротивление мембраны зависит от числа каналов, времени, в течение которого они открыты, и проводимости каждого канала в открытом состоянии. С разработкой методов, позволяющих реконструировать работу одиночных каналов, появилась возможность прямо измерить эти параметры.

КАНАЛЫ И ПЕРЕНОСЧИКИ КАК ФЕРМЕНТЫ: ПРИМЕНЕНИЕ ТЕОРИИ СКОРОСТЕЙ

Кинетическую теорию переходного состояния Эйринга, используемую энзимологами, успешно применяют и в случае различных траспортных систем. В основе этого подхода лежит предположение о том, что система может находиться в нескольких дискретных состояниях, каждому из которых соответствует стандартное значение электрохимического потенциала. При этом взаимные переходы между двумя состояниями сопряжены с переходом системы через промежуточные стадии с более высокой свобод-

ной энергией, и константы скоростей переходов зависят от высоты соответствующих энергетических барьеров. Минимумы на кривых изменения свободной энергии соответствуют местам связывания транспортируемых веществ. Можно предположить, что канал или переносчик имеет одно или несколько мест связывания переносимых веществ. При достаточно высоких концентрациях переносимого вещества все эти места оказываются занятыми и скорость переноса достигает своего максимального значения У_тлх, равного максимальной скорости работы фермента. Экспериментальные подтверждения этому получены для всех переносчиков и для многих каналов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы каналов

Применим теорию переходного состояния для анализа работы ионного канала в случае, когда ионы изначально присутствуют только с одной стороны мембраны. Примем» для простоты, что внутри канала имеется единственное место связывания и что ионы не могут свободно проникать внутрь канала или покидать его. Если внутри канала имеется много мест связывания, по которым ион может последовательно передаваться, то скорость переноса будет по-прежнему описываться уравнением Михаэлиса— Ментен. Если принять, что трансмембранное напряжение равно нулю, то «реакцию» можно представить следующим образом:

где Е — это канальный белок в «открытом» состоянии, Si и So — транспортируемое вещество внутри и снаружи, ES — комплекс субстрата с местом связывания внутри канала. На рис. 8.1 показан профиль свободной энергии для такой модели. Приведен также профиль для канала в закрытом состоянии. Прохождению иона через канал препятствует увеличение высоты одного из энергетических барьеров, но каков механизм этого процесса, пока неизвестно, за исключением, возможно, канала щелевого контакта. Закрывание канала может быть обусловлено, например, изменением положения а-спирали или только боковой цепи, в результате чего эффективно блокируется транспорт ионов через канал.

Применение критерия стационарного состояния дает уже знакомое уравнение Михаэлиса—Ментен для скорости:

„ к-, + k_{2 rc}.

где Км = - , о — суммарная концентрация переносчика.

Рассмотрим два случая: 1) насыщающая концентрация субстрата, > Км\ 2) низкая концентрация субстрата, < А"м.

1. Насыщающая концентрация субстрата. В этих условиях все места связывания заняты и скорость переноса достигает своего максимального значения, определяемого высотой энергетического барьера для выхода из канала. Это легко увидеть, преобразовав уравнение Михаэлиса — Ментен для случая > Км:

2. Низкая концентрация субстрата. При < Км наблюдается линейная зависимость скорости от концентрации субстрата, т.е. имеет место кинетику второго порядка. Кажущуюся константу скорости второго порядка можно получить, преобразовав уравнение Михаэлиса—Ментен для случая малых:

Полученное уравнение достаточно важно, поскольку оно описывает работу большинства, если не всех ионных каналов. Кажущаяся константа скорости второго порядка для этой реакции равна к₂/Км-Даже для столь простого случая это не истинная микроскопическая константа скорости, а комбинация констант скоростей.

Из этой простой модели следует несколько выводов.

1. Измеряемая константа скорости, которая определяет скорость транспорта по открытому ионному каналу, содержит информацию о кажущемся сродстве иона к месту связывания и о числе оборотов. В отсутствие напряжения на мембране эта константа скорости прямо связана с проницаемостью, обусловленной единичным каналом. Если внутренний барьер мал, то константа скорости транспорта будет равна ki — константе скорости второго порядка для иона, входящего в канал. Лимитирующим фактором для этой реакции может служить диффузия, при этом к\ будет составлять 10—10⁹M"'c^_l. Если внутренний энергетический барьер велик, то константа скорости транспорта будет равна произведению -кг-

2. Зависимость скорости транспорта от напряжения определяется проводимостью. Это легко понять, если посмотреть, как падение напряжения на мембране влияет на индивидуальные микроскопические константы. Если на профиль потенциала, изображенный на рис. 8.1, наложить прямую, отвечающую линейному падению напряжения на мембране, то высота энергетических барьеров, отвечающих кг и к\, уменьшится, а к - i — увеличится. В результате этого существенно увеличится константа скорости второго порядка для ионного транспорта, что и следовало ожидать. Простые модели типа рассмотренной нами не предсказывают линейной зависимости тока от напряжения, наблюдаемой экспериментально. Однако при введении в такие модели дополнительных энергетических барьеров кривая зависимости потока от напряжения становится очень близкой к линейной.

3. Ионную селективность можно объяснить несколькими путями. Селективность — это способность канала пропускать некоторые ионы лучше, чем другие; ее можно количественно охарактеризовать как отношение проницаемостей или проводимостей для сравниваемых ионов. Поскольку в выражение для константы скорости транспорта входят как ки так и к₂, то причиной селективной ионной проводимости может служить как более низкий энергетический барьер на входе в канал, так и более низкий барьер для перемещения внутри канала для определенного типа ионов. Например, если у входа в канал имеются отрицательные заряды или диполи, то скорость транспорта анионов может уменьшиться, т. е. канал окажется катионселективным. Такая картина наблюдается для нескольких рецепторных канальных белков и грамицидина А. Размеры переносимых веществ также влияют на скорость транспорта. Если размер молекулы переносимого вещества больше, чем диаметр канала, то это вещество не сможет попасть в канал. И наконец, селективность может быть связана с различием в скоростях переноса разных ионов внутри канала. Например, в случае Na⁺-селективного канала энергетический барьер для переноса этого иона внутри канала существенно ниже, чем для других ионов, таких, как К⁺, что ведет к увеличению проводимости no Na⁺. Представляется маловероятным, чтобы причиной ионной селективности было увеличение сродства иона к каналу. Такое изменение, соответствующее увеличению глубины впадины на профиле потенциала, должно было бы приводить к уменьшению скорости выхода иона из канала, т. е. к уменьшению максимального потока через канал, а также к уменьшению концентрации иона, необходимой для насыщения канала, т. е. к уменьшению Км. Около значения К_м для тех каналов, которые преимущественно пропускают Na⁺ или К ⁺, достаточно высоки, 200—300 мМ, что выше обычных физиологических концентраций этих ионов.

Применение теории переходного состояния при изучении работы переносчиков

Обратимся теперь к переносчикам. Рассмотрим простой переносчик с одним местом связывания, транспортирующий молекулы через мембрану. Рис. 8.2 иллюстрирует основные свойства как первичного активного переносчика, так и пермеазы. Рассмотрим четыре состояния белка-переносчика: 1) белок обращен внутрь/связан с субстратом; 2) обращен внутрь/не связан; 3) обращен наружу/ связан с субстратом; 4) обращен наружу/не связан. Тогда транспорт можно представить в виде следующей последовательности элементарных обратимых стадий.

1. Субстрат связывается с участком, обращенным к одной стороне мембраны.

2. Происходит конформационное изменение, существенно уменьшающее кинетический барьер для перемещения иона к выходу из канала и увеличивающее энергетический барьер для движения в обратном направлении. Это конформационное изменение может быть спонтанным или может происходить с потреблением энергии. Участок переносчика со связанным субстратом оказывается теперь обращенным к противоположной стороне мембраны.

3. Субстрат высвобождается из комплекса с переносчиком и выходит на противоположной стороне мембраны. Для активных переносчиков сродство субстрата к белку ниже, когда место связывания обращено к /иронс-стороне мембраны.

4. Происходит конформационное изменение, возвращающее белок-переносчик к исходной конформации, в которой место связывания вновь обращено к j/ис-стороне.

Ключевым моментом в работе всех переносчиков является наличие высокого энергетического барьера, для преодоления которого соответствующие белки должны претерпеть конформационные изменения. Если для этого необходима энергия, то система может работать как активный переносчик. Если для конформационного перехода необходимо, чтобы молекула переносимого вещества была связана с белком, т. е. стадия 4 отсутствует, то белок будет катализировать только обмен вещества через бислой, поскольку он не может изомеризоваться в «незагруженной» форме.

Для описания работы ионных каналов и различных видов

переносчиков разработано много моделей и схем. Хотя кинетическая теория переходного состояния имеет определенные ограничения, особенно в том, что касается кинетических свойств каналов, ее применение упрощает решение многих сложных задач и позволяет единым образом подходить к рассмотрению различных транспортных механизмов.

АНАЛИЗ СТАЦИОНАРНОГО СОСТОЯНИЯ

Для кинетической характеристики транспортных систем, которые катализируют облегченную диффузию или активный транспорт, могут использоваться различные подходы к анализу стационарного состояния. Все эти подходы основаны на измерении скорости переноса растворимых веществ через мембрану, но при разных условиях. В качестве примера мы рассмотрим эксперименты, которые проводились на пермеазах и мембранных везикулах. Обычно для такого рода измерений используют радиоактивные метки. Ключевым моментом является то, что пермеаза должна не только переносить вещество через бислой, то также и возвращаться обратно. Скорость транспорта может зависеть от любой из этих стадий. Опишем вкратце некоторые подходы к анализу.

1. Субстрат присутствует только с одной стороны мембраны. Начальная скорость транспорта измеряется для однонаправленного потока. Обратите внимание, что для обеспечения постоянного потока транспортируемого вещества переносчик должен вернуться свободным. Измеряют поток как функцию для процесса, протекающего в любом направлении.

2. Равновесный обмен. Субстрат присутствует в одинаковой концентрации с обеих сторон мембраны, но радиоактивная метка — только с одной стороны. В этом случае пермеаза может возвращаться, будучи связанной с немеченым веществом. Измеряют поток как функцию.

3. Меченый субстрат нахоится с цис-стороны мембраны, а в насыщающей концентрации он присутствует на противоположной стороне. Измеряют поток как функцию ^_uc. Как и в первом случае, при этом регистрируют однонаправленный поток. Такой поток называют также встречным, поскольку меченое вещество переносится против своего химического градиента.

4. Удельная радиоактивность субстрата с обеих сторон мембраны одинакова. В насыщающей концентрации субстрат находится на транс-стороне, a „_uc изменяется. В этом случае измеряют суммарный перенос, поскольку радиоактивное вещество пересекает мембрану в обоих направлениях. При таких условиях измерения состояние системы близко к равновесному.

Во всех случаях определяют К_тах и Км, которые при этом не обязательно совпадают для разных подходов. Для разных моделей можно получить кинетические уравнения для стационарного состояния и проверить их. Как и в классических работах по энзимо-логии, очень полезным может оказаться использование ингибиторов. При этом ингибиторы можно вводить с любой стороны мембраны, что позволяет получить дополнительную информацию.

Такого рода подходы можно применять при работе с клетками, субклеточными мембранными везикулами или искусственными реконструированными системами. Для исследования работы ионных каналов обычно применяют электрические методы, которые дают огромные преимущества.

Дополнение 8.2. Исследование транспорта в стационарном состоянии с использованием мутантной лактоэопермеазы из Е. coll

Как пример использования описанных выше подходов рассмотрим изучение транспорта в стационарном состоянии, осуществляемого одной из мутантных форм лактоэопермеазы, в которой остаток Glu в положении 325 заменен на Ala. На рис. 8.11 этот остаток находится в спирали 10. При измерениях использовали радиоактивную лактозу, при этом накопление лактозы изучали на интактных клетках, а выведение, встречный поток и обмен лактозы — на цитоплазматических мембранных везикулах с правильной ориентацией. Пермеаза дикого типа катализирует сим-порт /3-галактозидов и Н⁺. В присутствии протонного электрохимического градиента пермеаза использует свободную энергию, высвобождающуюся при переносе Н ⁺ по градиенту, для накопления /3-галактозидов против концентрационного градиента.

При замене остатка Glu-325 на Ala активный транспорт лактозы прекращается. Для измерения накопления лактозы использовали интактные клетки, в которых пермеаза дикого типа была заменена мутантной пермеазой. Для этого к суспензии дышащих клеток добавляли -лактозу и измеряли количество лактозы, накапливаемой клетками, в зависимости от времени. Приблизительно через 3 мин перенос лактозы достигал максимальной величины, но в клетках с мутантной пермеазой оставался пренебрежимо малым. Для изучения выведения лактозы инкубировали мембранные пузырьки в течение нескольких часов в присутствии высоких концентраций радиоактивной лактозы, а затем аликвоты переносили в среду без лактозы. Быстро фильтровали везикулы, измеряли их радиоактивность с помощью сцин-тиляционного счетчика и определяли скорость потери лактозы везикулами. Время полувыведения для контрольных везикул составляло 10 с, а для пузырьков, содержавших мутантную пермеазу, оно было равно 540 с. Мутантная пермеаза неспособна транспортировать лактозу как в прямом, так и в обратном направлениях.

Совершенно другие результаты были получены, однако, при измерении равновесного обмена. Эти измерения проводят точно так же, как и измерения по выведению лактозы, только нагруженные лактозой везикулы помещают в среду, содержащую немеченую лактозу в такой же концентрации. В этих опытах скорости выведения -лактозы из везикул, содержавших в одном случае пермеазу дикого типа, в другом — мутантную, были идентичными. Эти эксперименты показывают, что, хотя мутантная пермеаза не может осуществлять полный цикл транспорта лактозы, она способна изо-меризоваться в загруженную форму, что делает возможным трансмембранный обмен лактозы. Сходным образом мутантная пермеаза нормально функционирует в опытах по измерению встречного потока. При таком подходе везикулы нагружают немеченой лактозой, разводят средой, содержащей -лактозу в низкой концентрации, и измеряют поток меченой лактозы внутрь везикул. Этот подход также показал, что связанная с лактозой форма пермеазы нормально изомеризуется и осуществляет трансмембранный обмен лактозы.

Приведенные выше данные позволили сделать вывод о том, что мутантная пермеаза, содержащая А1а-325, не может депротониро-ваться. Таким образом, пермеаза оказывается дефектной по всем сопряженным транспортным процессам, в которых Н⁺ и лактоза переносятся вместе в цикле, требующем наличия депротонирован-ной формы переносчика для изомеризации.

Другие примеры использования такого рода подходов более подробно рассмотрены в отличной книге Штейна.

РЕГИСТРАЦИЯ ТОКА, ПРОТЕКАЮЩЕГО ЧЕРЕЗ ОДИНОЧНЫЙ КАНАЛ: ВСТРАИВАНИЕ В ПЛОСКИЕ МЕМБРАНЫ И МЕТОД ПЭТЧ-КЛАМП

Электрический ток, возникающий при быстром перемещении ионов через канал, можно легко измерить. Например, реконструированный никотиновый ацетилхолиновый рецептор — химический воротный катионселективный канал в постсинаптических мембранах, открывание и закрывание которого регулируется с помощью химических веществ, — имеет проводимость в открытом состоянии 45 пСм при концентрации NaCl с одной стороны мембраны 0,5 М. Это — обычное значение проводимости для ионных каналов. При этом при напряжении на мембране 100 мВ через каждый канал проходит ток 4,5 пА, или 2,7-10⁷ ионов/с. Этот ток легко зарегистрировать с помощью соответствующей электронной аппаратуры. Следовательно, ток через единичный канал можно прямо измерить, если фоновый ток через мембрану достаточно мал. Для того чтобы исследовать свойства индивидуальных канальных молекул, необходимо измерить ток через участок мембраны в условиях, когда одновременно открыто не более одного канала. Для этого можно использовать искусственную систему, когда в плоскую мембрану встроены одиночные канальные белки. Можно также воспользоваться методом пэтч-кламп. В основе метода лежит сделанное в 1979 г. открытие, показавшее, что если чистую стеклянную микропипетку прижать к клеточной мембране и слегка втянуть воздух в пипетку, то на ее конце образуется очень тонкая, но прочная мембранная пленка. Это позволяет получать вольт-амперные характеристики любых каналов, находящихся на этом небольшом участке мембраны. Фоновый ток обычно бывает значительно меньше 1 пА, так что ток через индивидуальный канал можно легко измерить. Применение этой техники произвело настоящую революцию в изучении ионных каналов, позволив детально исследовать работу разнообразных каналов из различных мембран. На рис. 8.3 схематически показаны четыре модификации метода пэтч-кламп. В рамках данного метода можно изменять состав раствора как с одной, так и с обеих сторон мембраны, можно измерять проводимость единичных каналов, изучать энзимологию единичных молекул. Все это делает метод пэтч-кламп необычайно мощным.

Чтобы оценить возможности данного подхода, рассмотрим запись работы единичного ацетилхолинового рецепторного канала, встроенного в бислой. Ворота индивидуальных каналов могут спонтанно открываться и закрываться. Каждое отклонение записи вниз соответствует открыванию канала. Ток, текущий через открытый канал, можно измерить, а это дает возможность определить проводимость единичного канала. Время, в течение которого каждый канал остается открытым, также легко измерить. Получаемое при этом распределение времени жизни канала в открытом состоянии прямо связано с константой скорости закрывания канала. Для самой простой модели, когда имеется одно открытое и одно закрытое состояние,

распределение времени жизни канала описывается экспоненциальной функцией с характерным временем т, равным величине, обратной константе скорости первого порядка для закрывания канала. Когда функция распределения времени жизни канала в открытом состоянии отличается от простой экспоненциальной зависимости, как в случае ацетилхолинового рецептора, для объяснения экспериментальных данных необходимо использовать более сложные состояния. Можно изучать влияние на работу канала различных химических агентов; при этом необходимо отличать влияние этих агентов на кинетические параметры открывания-закрывания каналов от их влияния на проводимость одиночных каналов.

Дополнение 8.3. Определение константы связывания ингибитора по данным о проводимости единичного канала

Рассмотрим использование данных о проводимости единичного канала на примере исследования взаимодействия харибдотоксина с Са^{2 +}-активируемым К ⁺-специфичным каналом. Харибдоток-син, небольшой пептид, выделенный из скорпионов, является эффективным ингибитором этого канала. Биохимические характеристики канала не изучены, однако его работу интенсивно исследовали, используя технику регистрации тока через одиночные каналы. Для этого вначале готовили мембранные везикулы из поперечных волокон скелетных мышц крысы и проводили их слияние с плоским липидным бислоем. На рис. 8.5 приведены записи электрического тока через единичный канал, быстро переходящий из открытого состояния в закрытое. Если эти данные представить в милли-секундном масштабе, то можно будет увидеть отдельные акты срабатывания канала, как это показано на рис. 8.4.

При добавлении харибдотоксина в работе канала появляются длительные периоды, в течение которых он остается в непроводящем состоянии. Очевидно, связывание токсина каким-то образом блокирует канал. Частота появления этих «мертвых» периодов позволяет определить скорость связывания харибдотоксина с каналом; время, в течение которого каналы остаются закрытыми, зависит от константы скорости диссоциации комплекса канал—токсин.

Среднее время жизни канала в активном состоянии т\ обратно пропорционально скорости связывания токсина, а время жизни его в закрытом состоянии т - i — скорости диссоциации:

Данные, представленные на рис. 8.5, показывают, что скорость блокирования канала зависит от концентрации токсина, а скорость диссоциации не зависит от концентрации свободного токсина.

Из этих данных легко получить как А:_дисс, так и к_связ для токсина; их отношение дает константу диссоциации. Замечательно, что получаемые параметры — как кинетические, так и

термодинамические — относятся к событиям, происходящим с индивидуальной молекулой.

НЕБОЛЬШИЕ МОЛЕКУЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛЕЙ КАНАЛОВ И ПОР

Кинетические методы используются для анализа работы различных каналов и переносчиков, обнаруживаемых в биомембранах. Расшифрована аминокислотная последовательность многих из этих белков. Однако, до сих пор не удалось провести рентгенострук-турные исследования с высоким разрешением ни для одного из этих транспортных белков, поэтому при изучении структуры и механизмов работы каналов приходится прибегать к модельным построениям. Большие возможности дает использование малых молекул, способных образовывать поры в бислое. Особенно интересны в этом отношении три соединения: 1) нистатин — полиеновый антибиотик, который образует комплекс с холестеролом; 2) грамидицин А — пептид, который образует катионселективный канал, наиболее полно охарактеризованный из всех изученных к настоящему времени каналов; 3) аламетицин — пептид, который образует регулируемый напряжением воротный канал.

Нистатин и амфотерицин В

Структурные формулы этих сходных полиенов приведены на рис. 8.6. Когда к содержащим стерол плоским мембранам с одной стороны от них добавляют нистатин, происходит увеличение мембранной проницаемости для воды, одновалентных ионов и небольших неэлектролитов. Неэлектролиты, ббльшие, чем глюкоза, пройти через канал не могут. Это говорит о том, что диаметр поры составляет около 8 А. На рис. 8.6 представлена модель канала, согласно которой от 8 до 10 молекул полнена образуют цилиндрическую структуру, в которой гидроксилированные сегменты каждой молекулы обращены внутрь, образуя заполненную водой пору. Наружная поверхность такой структуры неполярна, при этом между каждой парой молекул нистатина имеется пространство для молекулы стерола. Проводимость канала относительно низка, 5 пСм в 2 М КС1. Когда нистатин добавляют к плоской мембране с обеих сторон, две такие цилиндрические структуры, по-видимому, объединяются, образуя в два раза более длинный канал.

Необходимо отметить, что эта порообразующая молекула является амфифильной, поскольку обладает полярным и неполярным

участками. Полярная часть образуется из последовательно расположенных гидроксильных и карбонильных групп. Порообразующий комплекс, по-видимому, стабилен внутри бислоя. Обе эти структурные особенности характерны для большинства каналообразующих белков. Отметим, однако, что структура нистатиновой поры является гипотетической, хотя построена она на вполне разумных положениях и согласуется с экспериментальными данными.

Грамицидин А

Канал, образуемый грамицидином А — гидрофобным пептидом из чередующихся L- и D-аминокислот, — охарактеризован к настоящему времени наиболее полно. Исходя из имеющихся экспериментальных данных, была построена модель канала. Согласно модели, канал образован двумя молекулами грамицидина А, расположенными голова к голове в /3-спиральной конфигурации. В результате чередования L- и D-аминокислот образуется спираль, в которой все боковые цепи располагаются снаружи, а карбонильные группы остова — внутри канала. Этот тип спирали не встречается больше ни в каких белках и образуется из-за необычного чередования стереоизомеров аминокислот в грамицидине А. С этой точки зрения грамицидин А является плохой структурной моделью формируемых белками трансмембраниых пор. Однако во многих других отношениях канал, образуемый грамицидином А, имеет много общих черт с другими каналами и порами. Отметим следующие его особенности.

1. Грамицидин А чрезвычайно гидрофобен, он не содержит ни одной полярной аминокислоты.

2. Проводимость единичного канала, образуемого грамицидином, довольно велика. Например, в 100 мМ RbCl катионная проводимость составляет 30 пСм на канал. Впрочем, это гораздо ниже теоретической предельной величины для поры этого размера, если перенос вещества через пору лимитируется только диффузией.

3. Грамицидиновый канал является катионселективным. Небольшие неорганические и органические катионы проходят через него, в то же время проницаемость по CI ~ равна нулю. Хотя этот анион достаточно мал, чтобы легко пройти через пору такого диаметра, он не транспортируется через грамицидиновый канал и не блокирует его. Этот факт весьма примечателен, если принять во внимание, что в грамицидине нет полярных или заряженных аминокислот. Такая селективность объясняется электростатическим отталкиванием анионов и диполей, образуемых карбонильными группами в воротах канала.

4. Проницаемость канала для одновалентных катионов изменяется в следующем порядке: Cs ⁺ > Rb ⁺ > К ⁺ > Na ⁺ > Li⁺; такая же последовательность сохраняется и для свободной диффузии этих ионов в воде. Селективность, проявляемая каналом в отношении данных одновалентных катионов, невелика, она соответствует всего пятикратному изменению коэффициентов проницаемости. Энергия активации проводимости мала, около 5 ккал/моль. В этом смысле канал функционирует так, как будто он заполнен водой. Возможности свободной диффузии катионов в растворе в значительной степени зависят от электростатических взаимодействий с водой. Небольшие ионы взаимодействуют с молекулами воды сильнее, чем крупные, и электростатическая поляризация вызывает замедление диффузии. Такого же рода силы, по всей вероятности, влияют и на лимитирующие стадии, когда катионы проходят через длинный узкий грамицидиновый канал.

5. Молекулы могут проходить через канал только поодиночке, поскольку его диаметр составляет всего 4 А. Следовательно, транспортируемый ион в момент вхождения в канал должен частично дегидратироваться. 'Помимо переносимого катиона в канале могут находиться от пяти до семи молекул воды, и ион будет контактировать с двумя из них, находящимися спереди и сзади от него. В канале должны присутствовать также группы, с которыми будет взаимодействовать транспортируемый ион вместо утраченных при дегидратации молекул воды. Дегидратация требует больших затрат энергии, поэтому скорее всего именно эта стадия будет лимитирующей.

6. Транспорт ионов через канал, образуемый грамицидином А, характеризуется при достаточно высоких концентрациях соли кинетикой с насыщением. Это указывает на то, что в канале имеется определенное число мест связывания катионов. Например, полунасыщающая концентрация для Na⁺-проводимости составляет 0,31 М. Кинетические модели переноса предполагают наличие двух мест связывания, по одному у каждого входа в канал. Связывание катиона осуществляется в результате его взаимодействия с диполями, в частности с карбонильной группой остатка 11.

7. Вода проходит через канал со скоростью около Ю⁸ молекул в 1 с при низкой ионной силе. Перемещение катиона под влиянием электрического поля сопровождается переносом 5—7 молекул воды, находящихся в канале, что создает электроосмотические эффекты.

8. Открывание и закрывание грамицидинового канала происходит соответственно в результате ассоциации мономеров, образующих димер, и диссоциации димера. Время жизни димера составляет порядка 10 мс—10 с и зависит от липидного состава мембраны и других факторов.

9. Когда грамицидин А находится в отрицательно заряженном липидном бислое, под влиянием поверхностных зарядов может произойти увеличение локальной концентрации катиона у входа в гра-мицидиновую пору. Это значительно увеличит проводимость канала при низких концентрациях соли.

Все сказанное выше ясно показывает, почему грамицидин А является столь важной экспериментальной моделью. Многие из его свойств аналогичны свойствам, проявляемым физиологически важными каналами, такими, как ацетилхолиновый рецептор.

Аламетицин

Аламетицин — это один из представителей группы природных пептидов, которые образуют потенциалзависимые каналы и потому представляют собой хорошую модель для изучения регуляции работы канала с помощью трансмембранного потенциала. Молекула аламетицина состоит из 20 аминокислот, в частности, она содержит остатки а-аминоизобутирата. Основной структурной особенностью аламетицина и его гомологов является их способность образовывать а-спирали. В отличие от j3-cnnpa-ли, образуемой грамицидином А, пространство внутри а-спирали слишком мало, чтобы через него мог пройти ион. Экспериментальные данные скорее свидетельствуют о том, что до 12 молекул ала-метицина агрегируют и образуют пору. Когда аламетицин находится в такой конфигурации, полярные атомы оказываются внутри структуры. Отметим, что для обеспечения полярности наполненного водой канала не требуется присутствия боковых групп полярных аминокислот.

При низком напряжении плоская мембрана, содержащая аламетицин, не проводит электрический ток. По мере увеличения напряжения до некоего критического значения аламетициновые каналы начинают проводить ток. Напряжение на мембране может быть любого знака. Проводимость единичного канала очень высока: она составляет 5000 пСм в 1 М КС1 и свидетельствует о том, что размер пор очень велик. Если предположить, что канал образуется 12 агрегированными мономерами аламетицина, то его диаметр должен быть равен 20 А, что соответствует высокой проводимости единичного канала.

Для объяснения возможного механизма регуляции работы ала-метицинового канала путем изменения напряжения на мембране разработано несколько моделей. Все они предполагают, что диполи в а-спирали, образуемые пептидными группами, суммируются и создают общий диполь, такой, что положительный заряд локализуется на N-конце молекулы, а отрицательный — на С-конце. Трансмембранный потенциал достаточно велик, чтобы при взаимодействии с этим постоянным диполем могло произойти изменение ориентации спирального пептида в мембране или увеличилась эффективность его включения в мембрану.

Рассмотрим простейшую модель, описывающую открывание канала при наложении поля. Согласно этой модели, под действием электрического поля увеличивается число встраиваемых в мембрану молекул аламетицина, в результате чего мономеры начинают агрегировать с образованием цилиндрического канала, причем процесс характеризуется высокой степенью кооперативности. Однако существует и другая точка зрения, согласно которой аламетицин находится в связанной с мембраной непроводящей форме уже в отсутствие напряжения и при наложении электрического поля только агрегирует с образованием канала в открытой конформации. Электрическое поле в рамках этих моделей вызывает дипольный флип-флоп-переход а-спирального пептида, стабилизируя агрегат, в котором а-спирали параллельны друг другу.

Аламетицин представляет собой хорошую модель, позволяющую объяснить процесс образования поры при ассоциации а-спира-лей; он также дает возможность продемонстрировать на простой системе, как трансмембранный потенциал стабилизирует определенные белковые конформации и тем самым оказывает существенное влияние на проводимость канала. Такими свойствами обладают не только пептиды типа аламетицина. В качестве примера можно привести синтетические пептиды и мелиттин.

Несколько примеров пор и каналов

В последнее время достигнуты большие успехи в определении строения пор и каналов на молекулярном уровне. Выявляются некоторые общие структурные элементы этих образований. Анализ аминокислотных последовательностей соответствующих молекул указывает на существование структурно родственных групп ионных каналов. Особенно ценным в этих исследованиях оказался метод реконструкции изображения; с его помощью удалось не только визуализовать отверстия в мембране, создаваемые большими порами, но и выявить симметричную организацию субъединиц вокруг центрального отверстия. Общим структурным мотивом для этих белков может быть цилиндрический канал, формируемый несколькими амфифильиыми а-спиралями разных субъединиц или отдельными доменами одной субъединицы. Впрочем, структура аламетицина и грамицидина А свидетельствует о том, что боковые цепи полярных аминокислот не нужны для формирования полярной внутренней структуры заполненного водой канала. Ни в одном из случаев не доказано достоверно, что кислые остатки непосредственно участвуют в образовании поры. Важным исключением из а-спирального семейства каналов являются пори-яы, поскольку они формируют поры из /3-слоев, а не с помощью а-спиралей.

ЩЕЛЕВЫЕ КОНТАКТЫ

Щелевые контакты — это кластеры мембранных каналов, которые соединяют содержимое соседних клеток в тканях. Через такие каналы проходят небольшие молекулы — метаболиты и неорганические ионы. Диаметр каналов в клетках млекопитающих составляет от 12 до 20 А. Через иих осуществляется перенос из клетки в клетку ионов и химических веществ. Таким образом, эти каналы соединяют две плазматические мембраны. Опыты по клонированию и биохимической реконструкции показали, что канал образован олигомером единственного пептида, мол. масса которого для клеток печени составляет 32000. Исходя из данных об аминокислотной последовательности, можно предположить, что в каждой субъединице имеются четыре трансмембранные а-спирали. К настоящему времени охарактеризованы белки щелевых контактов из нескольких тканей; по-видимому, они образуют обширную группу родственных белков. Эти каналы обычно находятся в открытом состоянии, но закрываются, когда понижается скорость метаболизма. Первичным сигналом для закрывания канала является, по всей вероятности, повышение концентрации Са^{2 +}, хотя при изменении трансмембранного потенциала или закислении среды также наблюдается закрывание канала. Возможно, эффект Са²⁺ является опосредованным. Другим способом регуляции работы канала может быть фосфорилирование.

Основная модель, описывающая строение и возможный механизм работы канала, представлена в работе. Для выяснения структуры канала авторы использовали электронную микроскопию. Каждый канал состоит из 12 субъединиц, по шесть от каждой клетки. Канал представляет собой гексамерную структуру с центральной порой. Каждая субъединица имеет форму стержня, пронизывающего бислой. Два гексамерных комплекса соседних мембран соединены конец к концу и образуют протяженный канал, объединяющий обе мембраны. Структура канала щелевого контакта зависит от наличия ионов Са^{2 +}. В присутствии Са^{2 +} субъединицы расположены параллельно центральной оси канала, а в отсутствие этих ионов они несколько наклонены. Это наводит на мысль, что открывание и закрывание канала происходит аналогично работе ирисовой диафрагмы фотоаппарата; субъединицы скользят друг относительно друга в ответ на сигнал к открыванию или закрыванию. Однако точный механизм этого процесса далеко не ясен.

ЯДЕРНЫЕ ПОРОВЫЕ КОМПЛЕКСЫ

Ядерная оболочка состоит из двух мембран. Ядерные поровые комплексы участвуют в транспорте веществ между ядром и цитоплазмой. Эти поры, аналогично каналам щелевых контактов, пронизывают две мембраны. По данным электронной микроскопии высокого разрешения, ядерная пора имеет октагональную симметрию, но устроена сложнее, чем канал щелевого контакта. Ядерная пора представляет собой два октагональных цилиндра, соединенных вместе наподобие канала щелевого контакта. Полипептидный состав поры ядерной оболочки окончательно не установлен.

Размер поры ядерной оболочки весьма велик, радиус ее функциональной части составляет — 90 А; через нее могут проходить как небольшие растворимые вещества, так и многие крупные молекулы. Существуют специальные механизмы транспорта макромолекул внутрь ядра и из ядра в цитоплазму, однако до сих пор о них мало что известно.

ПОРИНЫ

Порины образуют поры, которые функционируют как молекулярные сита, опосредуя диффузию небольших гидрофильных молекул через наружную мембрану грамотрицательных бактерий. Исследование более чем сорока различных поринов позволило выявить некоторые их общие особенности. Мол. масса поринов варьирует от 28 ООО до 48 ООО. В мембране они обычно присутствуют в виде тримеров. Для поринов характерно высокое содержание /3-слоев. Наиболее полно к настоящему времени охарактеризованы порины из Е. coli: OmpF, OmpC, PhoE и LamB. Их основной особенностью является то, что они образуют наполненный водой трансмембранный канал, причем этот канал образован в основном ^-структурными элементами. На рис. 8.7 представлена одна из возможных моделей образования поринового канала из амфифильных, так и по селективности. Селективность связана с наличием внутри канала или около входа в канал заряженных аминокислотных остатков. Измерения проводи-

мости одиночных каналов и проницаемости пор, а также электронно-микроскопические исследования указывают на то, что строение пор не одинаково для разных поринов. В одних случаях тримеры порина образуют один большой канал, в других — три независимых канала. Канал OmpF имеет три входа с наружной стороны клетки, которые затем сливаются, образуя единый выход в периплазму.

Три из четырех порииов Е. coli имеют много общих структурных особенностей, а их аминокислотные последовательности в значительной степени гомологичны. Эти порины образуют поры диаметром 10—12 A. Четвертый порин, Lam В, значительно отличается от трех предыдущих, хотя его аминокислотная последовательность обнаруживает некоторое сходство с ними. Ои тоже образует главным образом /3-складчатые структуры. LamB является частью системы транспорта мальтозы и обладает сродством к производным мальтозы. В отсутствие мальтозы LamB образует небольшие каналы, которые целиком блокируются при связывании мальтозы. Главной функцией LamB является стимуляция накопления мальтозы, а не работа в качестве диффузионной поры для небольших растворимых веществ. Топографию LamB исследовали с помощью различных методов, включая генетические. В результате была построена детальная модель этого канала, пронизывающего мембрану.

Предположение о том, что порины являются воротными каналами и, значит, могут находиться в закрытом состоянии, подвергалось всесторонней проверке. In vitro работа поринов может регулироваться напряжением на мембране, однако физиологическая значимость этого явления остается неясной.

И наконец, следует отметить, что из наружной мембраны митохондрий были выделены порины, работа которых регулируется напряжением на мембране. Они называются потенциалзависимыми анионселективными каналами. Эти порины не являются родственными бактериальным поринам, но они также рбразуют цилиндрическую пору из /3-структурных элементов

nAChR-канал является примером канала, работа которого регулируется нейромедиатором. Эти каналы находятся главным образом в концевых пластинках — постсинаптических мембранах нервно-мышечных соединений скелетных мышц. При электрическом возбуждении нейрона из него высвобождается нейромедиатор аце-тилхолин. Последний диффундирует от пресинаптической мембраны нейрона к мембране скелетной мышцы. Никотиновые ацетилхо-линовые рецепторы имеют вид плотно упакованных кластеров в плазматической мембране мышечного волокна, входящей в состав концевой пластинки. При взаимодействии с ацетилхолином канал открывается, опосредуя селективное перемещение катионов. Под действием ионного тока изменяется трансмембранный потенциал и происходит электрическое возбуждение мышечной клетки, что приводит к сокращению мышцы.

nAChR-канал регулируется с помощью химических механизмов, причем сигнал действует непосредственно на канал. Химдческим сигналом является ацетилхолин, который передает возбуждение от нервного волокна к мышце. Анализ аминокислотной последовательности показал, что никотиновый ацетилхолиновый рецептор и два других нейромедиаторных рецептора — глициновый рецептор и рецептор 7-аминомасляной кислоты — имеют много общих структурных особенностей. Они образуют группу химически регулируемых каналов. Впрочем, несмотря на сходство аминокислотных последовательностей, эти белки имеют разную четвертичную структуру. Биохимические свойства рецептора глутамата, одного из важных иейромедиаторов головного мозга, не исследованы.

Отметим, что номенклатура и классификация нейромедиатор-ных рецепторов основаны главным образом на данных о влиянии на них различных лекарственных веществ, в особенности тех, которые выступают в роли агонистов, стимулируя рецептор наподобие естественного нейромедиатора, или антагонистов, которые блокируют стимулирующий эффект агонистов. Например, рецепторы ацетилхолина в начале этого века разделяли на никотиновые и мус-кариновые на основании их фармакологических различий. Никотиновые рецепторы ацетилхолина — это группа родственных рецеп-торных белков. Мускариновый рецептор из клеток мозга структурно не сходен с nAChR-каналом и в действительности не является каналом. Необходимо отметить, что охарактеризованы никотиновые ацетилхолиновые рецепторы из ткани мозга, по некоторым структурным и функциональным особенностям отличающиеся от каналов коицевой пластинки.

По сравнению с другими канальными белками nAChR-канал охарактеризован наиболее полно, и связано это с тем, что существует легкодоступный источник, содержащий большие количества данного белка. Большая часть биохимических экспериментов была поставлена с использованием рецептора, выделенного из электрического органа скатов Eiectrophorus и Torpedo. Показано, что эти каналы очень похожи на каналы концевых пластинок как в структурном, так и в функциональном отношении. Гибридные белки, состоящие из субъединиц рецепторов из электрического органа Torpedo и нервио-мышечиого соединения быка, оказались полностью функциональными.

Выделенный и очищенный nAChR-канал состоит из пяти полипептидных субъединиц четырех разных типов со стехиометрией а₂08у. Две копии а-субъединиц, присутствующие в комплексе, по всей вероятности, выполняют разные функции. Субъединицы близки друг к другу по аминокислотной последовательности и различаются по кажущейся молекулярной массе. Все субъединицы фосфорилированы и гликозилированы, а к двум, а и /3, ковалентно присоединен липид.

На основе электронно-микроскопических методов реконструкции изображения была построена модель канала, приведенная на рис. 8.8. Метод негативного контрастирования ясно показыва-

ет, что канал имеет центральное отверстие диаметром 30 А с внеклеточного конца и значительно более узкое с ци-топлазматической стороны. На фотографиях четко видна пентамер-ная структура комплекса. Это означает, что пять субъединиц организованы вокруг центральной поры. Использование реагентов, образующих поперечные сшивки, показывает, что субъединицы расположены в следующей последовательности: /3—а—6—у—а, так что а-субъединицы не соседствуют друг с другом. По данным многочисленных исследований, места связывания ацетилхолина, других агонистов и конкурентных антагонистов располагаются на а-субъединицах. Следовательно, существуют два места связывания для этих химических агентов. Антагонисты препятствуют активации, вызываемой агонистами, или путем прямой конкуренции за связывание с теми же участками, или за счет связывания с каким-либо другим местом и, возможно, взаимодействия с каналом per se.

Как видно из рис. 8.8, nAChR-канал имеет длину около 140 А, причем участок длиной 70 А расположен над поверхностью бислоя с наружной стороны, образуя большие ворота канала. В клетках Torpedo канал существует в виде димерных единиц, связанных друг с другом дисульфидным мостиком между 6-субъединицами с внеклеточной стороны. Часть канала, выступающая из бислоя с цитоплазматической стороны, гораздо менее протяженна; по-видимому, она взаимодействует с элементами цитоскелета, что способствует образованию плотноупакованных кластеров канальных белков в концевой пластинке. Было высказано предположение, что эти взаимодействия опосредует особый белок мол. массой 43 000. В концевой пластинке каналы могут быть собраны в кластеры с плотностью до 10000 молекул на 1 мкм², что близко к теоретическому пределу. При взаимодействии с ацетилхолином или другими агонистами через данный участок мембраны начинает течь электрический ток, деполяризующий постсинаптическую мембрану.

Кинетическое поведение nAChR-канал а можно с успехом анализировать, если рассматривать его как аллостерический фермент, способный находиться в нескольких конформациях. Существуют как минимум три состояния, в которых может находиться канал: открытое, закрытое и инактивированное. Для индукции перехода канала из закрытого состояния в открытое, в котором он остается около 1 мс, необходимо кооперативное связывание двух молекул ацетилхолина. В инактивированиом состоянии канал остается закрытым даже в присутствии ацетилхолина. Измерения проводимости одиночного канала свидетельствуют о наличии более чем одного открытого состояния, и кинетическая модель при этом оказывается достаточно сложной. Опыты по встраиванию канала в липидный бислой показали, что липидное окружение может влиять на способность канала к переходу из одной конформации в другую.

В открытой конформации канал проницаем для катионов и небольших неэлектролитов, но не анионов. Ограничения, налагаемые на размер проходящих молекул, позволяют судить о размерах наиболее узкой части канала. Соответствующие данные представлены на рис. 8.9 вместе с данными для двух других каналов. Радиус небольшого негидратированного иона, способного проходить через канал, является разумной оценкой предельных размеров канала. Непроницаемость канала для анионов и в три раза ббльшую проницаемость для катионов, чем для незаряженных молекул, можно объяснить электростатическими взаимодействиями, возникающими благодаря присутствию в воротах канала биполярных или отрицательно заряженных групп. Селективность канала по отношению к одно- и двухвалентным катионам невелика, но согласуется с моделью, в которой ионы даже внутри канала взаимодействуют главным образом с молекулами воды, а не с элементами собственно канала. Хотя размеры nAChR-канала относительно велики, он все же слишком мал, чтобы через него могли проходить полностью гидратированные ионы. Внутренняя полость канала должна содержать группы, которые могли бы легко заменить утраченные при дегидратации молекулы воды.

О молекулярной структуре этого канала известно больше, чем о структуре какого-либо иного канала. И все же, к сожалению, не выработано единой точки зрения на то, как построен данный канал, хотя было создано много достаточно детальных моделей. Большой вклад в исследование этого вопроса внесли работы с использованием методов молекулярной генетики. Так, при помощи клонирования генов каждой из субъединиц nAChR-канала из нескольких источников были определены аминокислотные последовательности этих субъединиц, анализ которых выявил наличие высококонсервативных участков. В качестве потенциальных трансмембранных а-спиралей было идентифицировано до семи различных сегментов. Наиболее интересен один из них, обозначаемый как М5 или МА; он может образовывать амфифильную спираль с заряженными группами, расположенными с одной стороны. Большинство исследователей полагают, что узкая часть канала, пронизывающая бислой, построена из субъединиц, каждая из которых образует а-спираль. Ансамбль а-спиралей формирует центральную пору. Первым кандидатом на эту роль является амфифильная спираль, хотя модельные исследования с грамицидином А с очевидностью показали, что наличие заряженных групп не является необходимым условием для образования наполненного водой катионселективного канала. Экспериментальные данные о прямом участии амфифильной спирали в формировании канала отсутствуют; даже вопрос о том, является ли эта спираль трансмембранной, не решен окончательно. Имеются данные, что в формировании канала участвует другая спираль, М2. Эти данные были получены при изучении связывания с каналом неконкурентных антагонистов и с помощью молекулярнно-генетических методов. Хотя спираль М2 не является амфифильной, она может образовывать канал, аналогичный грамицидиновому или аламетициновому. Отметим, что другие члены группы нейромедиаторных рецепторов не имеют участков, аналогичных амфифильной спирали никотинового ацетилхолинового рецептора.

В работах Нума и др. впервые были продемонстрированы возможности применения сайт-специфического мутагенеза при исследовании подобного рода систем. Гены, кодирующие каждую из четырех субъединиц канала, клонировали в cos-клетках обезьяны и ооцитах Хепорш и наблюдали экспрессию функциональных каналов в плазматической мембране. Для изучения работы таких каналов очень ценным оказались методы регистрации токов через одиночные каналы. Есть надежда, что с развитием подобных экспериментальных подходов мы сможем получить ответы на многие давно интересующие нас вопросы о строении каналов. Использование поликлональных и моноклональных антител поможет выявить те участки полипептидов, которые ответственны за связывание ацетилхолина, а также участки, формирующие собственно канал. В настоящее время большинство исследователей полагают, что этот канал образуется из а-спиралей, как аламетициновый канал. Те же представления легли в основу модели Na ⁺-канала.

ПОТЕНЦИЛЗАВИСИМЫЙ НАТРИЕВЫЙ КАНАЛ

Потенциалзависимый натриевый канал обеспечивает быстрое увеличение натриевой проводимости, ответственное за фазу деполяризации при развитии потенциала действия в нервных и мышечных клетках. Этот канал был очищен до гомогенного состояния из нескольких источников, в частности из мозга крысы, скелетных мышц млекопитающих, сердца цыпленка и электрического органа ската Electrophorus electricus.

Очищенные каналы из Elektrophorus electricus и сердца цыпленка содержат единственную гликопротеиновую субъединицу с мол. массой -260000, в то время как каналы, выделенные из тканей млекопитающих, содержат еще одну или две меньшие субъединицы с мол. массой от ЗЗООО до 38 000. Большую часть из этих очищенных препаратов каналов удалось встроить в плоские мембраны, при этом они сохраняли присущие им in vivo электрофизиологические и фармакологические характеристики. Для успешной реконструкции канала, выделенного из тканей млекопитающих, необходим по меньшей мере один из небольших ассоциированных белков.

Натриевые каналы взаимодействуют с различными токсинами, в частности с тетродотоксином, сакситоксином и а-токсином скорпиона, которые очень прочно связываются с канальными белками и могут использоваться при количественных биохимических измерениях. Присутствие этих токсинов очень важно как для биохимической очистки каналов, так и для изучения их работы in vivo. Как и канал концевой пластинки, натриевые каналы распределены в плазматической мембране не равномерно, а собраны в кластеры. В мышечных клетках Na ⁺-каналы сконцентрированы в районе концевой пластинки вместе с nAChR-каналами.

Нума с соавторами клонировали гены, кодирующие белки натриевых каналов из Electrophorus и главную субъединицу канала из мозга крысы, и определили их нуклеотидную последовательность. Было показано, что белок натриевого канала из Electrophorus содержит 1820 аминокислотных остатков, организованных в четыре повторяющиеся гомологичные единицы. По мнению разных авторов, каждый гомологичный участок содержит 4, 6 или 8 трансмембранных а-спиралей. Некоторые из этих предполагаемых трансмембранных спиралей амфифильны и аналогичны постулированным для nAChR-канала. Имеются экспериментальные данные о том, что карбоксильный конец полипептидной цепи локализован на цитоплазматической поверхности; сообщалось также, что амфифильная 54-спираль является внецитоплаз-матической. Однако никакой дополнительной информации, позволяющей подтвердить предложенные топологические модели, не существует. Нет также данных о том, какие участки полипептида непосредственно вовлечены в образование поры. Различные модели натриевого канала концептуально близки к моделям канала концевой пластинки в том отношении, что канал per se состоит из кластера а-спиралей, образующих центральную пору. В этом случае, однако, вместо пяти различных субъединиц мы имеем четыре гомологичных домена единственной субъединицы. По всей вероятности, специфичные группы организованы в канале таким образом, что образуется «селективный фильтр».

Предельные размеры канала можно оценить, используя метод «молекулярного сита», однако при этом нельзя объяснить селективность канала по отношению к достаточно малым ионам. На рис. 8.10 приведен профиль свободной энергии для диффузии ионов Na⁺ через канал. Если лимитирующей стадией является дегидратация, то параметром, определяющим высоту энергетического барьера, будет геометрия тех компонентов, которые временно заменяют воду. Для К⁺ положение соот-

ветствующих групп не будет оптимальным, поскольку этот ион несколько больше по диаметру, а потому энергетический барьер будет выше. Напротив, для К⁺-селективных каналов соответствующий энергетический барьер будет минимален именно для ионов К ⁺.

В последнее время было построено также много моделей, описывающих регуляцию работы канала при помощи трансмембранного потенциала. В регуляции, без сомнения, участвует изменение заряда белка в ответ на наложение электрического поля. Однако никаких данных о том, какие именно участки полипептида образуют ворота или отвечают на изменение напряжения, не существует. Высказывается предположение, что это может быть амфи-фильная 54-спираль.

Данные об аминокислотной последовательности натриевого канала свидетельствуют о том, что он относится к группе потенциал-зависимых каналов. В эту же группу входят калиевый канал из Drosophila и дигидропиридиновый калиевый канал из скелетных мышц кролика. Все эти белки содержат амфи-фильный положительно заряженный сегмент, аналогичный S4-cer-менту натриевого канала. Это еще раз подтверждает вывод о том, что данный сегмент участвует в регуляции работы канала, отвечая на изменение напряжения на мембране. Отметим, что как натриевый канал из тканей млекопитающих, так и кальциевый канал следующий раздел) имеют субъединицы, функции которых неизвестны.

КАЛЬЦИЕВЫЙ КАНАЛ

Са^{2 +}-селективные каналы очень широко распространены в возбудимых клетках — нервных и мышечных, а также в большинстве других типов клеток. Некоторые Са^{2 +}-каналы отвечают на изменение напряжения на мембране, а работа других регулируется опосредованно с помощью рецепторов. Обычно концентрация ионов Са²⁺ в цитоплазме не превышает 10"⁷ М, что в 10000 раз ниже, чем концентрация ионов Са²⁺ вне клетки. Из-за этих условий и в отличие от Na ⁺ - и К ⁺ -каналов открывание Са^{2 +} -канала может приводить к значительным изменениям концентрации этого иона в цитоплазме, что в свою очередь индуцирует разнообразные биохимические события. Например, потенциалзависимое увеличение концентрации ионов Са²⁺ в цитоплазме приводит к высвобождению нейромедиаторов.

Исходя их фармакологических данных, была проведена классификация Са²⁺-каналов. Для очистки и дальнейшей харктеристики каналов очень полезными оказались органические блокирующие агенты с высоким сродством к каналам. Единственный класс Са^{2 +} -каналов, охарактеризованных биохимически, — это потенциалзави-симые каналы, которые блокируются различными органическими соединениями, в частности производными дигидропиридииа. Эти каналы были выделены из сердечной и скелетной мышц и оказались одинаковыми. Они состоят как минимум из двух субъединиц с мол. массой 140000 и 30000. Большая субъединица была клонирована и секвенирована и оказалась структурно близка к потенциалзависимому натриевому каналу.

Появляется все больше данных, свидетельствующих о сходстве структуры различных каналов и пор. В основе всех этих систем лежит заполненная водой пора, выстланная изнутри полярными группами. Пора может быть образована или а-спиральными, или 0-структурными элементами. Чтобы транспорт осуществлялся с высокой скоростью, в канале не обязательно должны присутствовать места связывания, обладающие высоким сродством к переносимым веществам, поскольку селективность определяется высотой энергетических барьеров, а не глубиной впадин. Селективность каналов можно в большинстве случаев объяснить тем, что в нескольких ключевых местах располагаются специфические аминокислотные остатки, определяющие характер тех веществ, которые могут проходить через канал. Возможно, воротные механизмы различных каналов также имеют много общего, но экспериментальные данные по этому поводу пока отсутствуют.

Как мы увидим позже, аналогичные структурные свойства можно обнаружить и у других транспортных белков.

Некоторые унипортеры, симпортеры и антипортеры

К настоящему времени достаточно хорошо охарактеризовано несколько систем, катализирующих транспорт одного или более растворимых веществ. При этом скорость переноса с помощью этих белковых комплексов гораздо ниже, чем даже через наиболее «медленные» каналы. Мы рассмотрим переносчик глюкозы и анионный переносчик из мембраны эритроцита, лактозопермеазу из Е. coli и группу митохондриальных переносчиков. Транспортные функции этих белков весьма разнообразны: оии катализируют облегченную диффузию одного какого-то вещества, симпорт Н ⁺ и сахара, в результате чего происходит накопление сахара в клетке, и антипорт растворенного вещества. Отметим некоторые общие свойства этих процессов.

1. В некоторых случаях эти транспортные белки являются оли-гомерами, обычно димерами. Однако, по-видимому, только у митохондриальных переносчиков канал образуется из структурных элементов разных мономеров. Во всех других случаях, по всей вероятности, каждая субъ-едииица функционирует независимо, даже если она является частью олигомера.

2. Весьма высокая степень гомологии транспортных белков указывает иа их близкое структурное родство, хотя они существенно различаются как по субстратной специфичности, так и по функциям. Это позволяет предположить, что для широкой группы функционально различных переносчиков характерны общие транспортные механизмы.

3. В большинстве случаев для анализа работы транспортных белков можно с успехом использовать модели с чередованием кон-формационных состояний, аналогичные модели, схематически представленной на рис. 8.2. При этом лимитирующей стадией является конформационное изменение с той стороной мембраны, где находится место связывания.

4. В большинстве случаев сродство переносчика к транспортируемому веществу не зависит от того, к какой стороне мембраны обращено место связывания. Однако для первичных активных транспортных систем наблюдается иная картина.

5. Все рассматриваемые здесь переносчики обычно чувствительны к реагентам, действие которых направлено на сульфгидрильные группы. Однако это не обязательно должно означать, что между переносчиками имеется значительное структурное сходство или они используют одинаковый механизм транспорта. Например, установлено, что ни один из восьми остатков цистеина лактозопермеазы не участвует непосредственно в транспорте. Высказывалось также предположение, что погруженные в мембрану остатки пролина распределены в транспортных белках непропорционально, однако значение этого факта остается неясным.

ПЕРЕНОСЧИК ГЛЮКОЗЫ ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТА

Этот переносчик охарактеризован наиболее полно из всех белков, катализирующих диффузию единственного вещества через мембрану. Он переносит через эритроцитарную мембрану D-глюкозу, которая затем используется при гликолизе. Такие же или аналогичные переносчики глюкозы присутствуют и в других типах животных клеток. Большой прогресс в этой области исследований был достигнут благодаря секвенированию ДНК, кодирующей переносчик глюкозы из клеток гепатомы человека и из клеток мозга крысы. Очищенный переносчик из эритроцитов представляет собой гликопротеин с кажущейся мол. массой 55 000. По-видимому, в мембране он находится в виде димера. Если судить по данным об аминокислотной последовательности, то переносчик должен содержать 12 трансмембранных а-спиральных участков, однако экспериментальные данные не дают окончательного ответа на этот вопрос. Очищенный переносчик удалось встроить в фосфолипидные везикулы, при этом оказалось, что он ориентирован асимметрично.

Как и при исследовании канальных белков, очень важную роль сыграли опыты с использованием специфических ингибиторов, обладающих высоким сродством к переносчику. В число этих ингибиторов входят цитохалазин В и флоретин, которые связываются с переносчиком со стехиометрией 1:1. Одни ингибиторы связываются с переносчиком только в том случае, если они находятся с цитоплазматической стороны мембраны, другие специфически связываются с наружной стороны мембраны. В работе было показано, что места связывания двух указанных ингибиторов находятся вблизи С-конца полипептида.

Большинство кинетических данных и данных по связыванию согласуются с простой моделью четырех состояний, в которой предполагается, что существует единственное место связывания D-глюкозы, находящееся внутри канала. Для измерения индивидуальных констант скоростей использовали ЯМР и метод остановленной струи. Конформация загруженного канала изменяется с константой скорости 2000 с~', которая приблизительно в семь раз выше аналогичной константы для незагруженного канала. Следовательно, обмен глюкозы происходит с большей скоростью, чем транспорт как таковой, для осуществления которого незагруженный переносчик должен возвратиться через мембрану. Природа конформационного изменения неизвестна, хотя оно было зарегистрировано при помощи инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и, как предполагают, включает скольжение а-спиралей друг относительно друга.

Между переносчиком глюкозы из клеток млекопитающих и некоторыми транспортными системами бактерий наблюдается значительная гомология. Удивительно, что такая гомология наблюдается также между переносчиком глюкозы и белками, осуществляющими симпорт Н ⁺-арабинозы и Н ⁺-ксилозы. Эти сим-портеры, как и описываемая ниже система транспорта Н ⁺-лактозы, используют для аккумуляции указанных сахаров электрохимический протонный градиент. Переносчик глюкозы из мембраны эритроцитов не транспортирует Н⁺ и не способен к транспорту против градиента глюкозы. Очень важными представляются работы по изучению взаимосвязи структуры белкового комплекса и механизма его работы.

ЛАКТОЗОПЕРМЕАЗА ИЗ Е. coll

Этот комплекс изучен наиболее полно из всех симпортных белков. Он кодируется /асУ-геном, который является частью lac-оперона, и его часто называют lac-пермеазой. Ген lacY был клонирован и секвенирован, и из штамма-сверхпродуцента был выделен белок — продукт этого гена. Пермеазу можно изучать в цитоплаз-матических мембранных везикулах, в интактных клетках или в реконструированных протеолипосомах. Судя по дан-

ным об аминокислотной последовательности, белок имеет мол. массу 46 500, хотя результаты электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН дают другую величину. Почти не вызывает сомнения, что функциональной единицей в мембране является мономер, хотя некоторые данные свидетельствуют о существовании димерной формы пермеазы in vivo.

На основании данных об аминокислотной последовательности лактозопермеазы были построена модели, согласно которым этот белок имеет 12 или 14 трансмембранных а-спиралей. Это в основном согласуется со спектроскопическими данными, свидетельствующими о высоком содержании а-спиралей, и немногочисленными топологическими данными. На рис. 8.11 представлена модель, построенная Кабаком, с указанием сегментов, которые, согласно экспериментальным данным, являются цито- или периплаз-матическими.

1. Пермеаза имеет одно или более мест связывания для протона и одно — для лактозы. Эти места бывают поочередно обращены к периплазматической и цитоплазматической сторонам мембаны, и соответствующий коиформациониый переход является лимитирующей стадией процесса. Максимальная скорость транспорта равна 25—50 с~¹. При наличии трансмембранного протонного электрохимического потенциала для лактозы составляет ~ 80 мкМ; место связывания протона, возможно, характеризуется высоким рК_л, поэтому большую часть времени протонировано. При ДД_Н ♦ = 0 значение Км для лактозы гораздо выше — 15—20 мМ.

2. Транспорт лактозы обязательно сопровождается транспортом Н⁺ со стехиометрией 1:1.

3. Конечным результатом транспорта является перенос через бислой положительного заряда. Следовательно, важную роль в установлении равновесия и скорости транспорта играют трансмембранный электрический потенциал и разность протонного химического потенциала.

Дополнение 8.4. Генетические подходы и сайт-специфический мутагенез: важные методы изучения лактоэопермеазы

Наиболее ценные данные при изучении лактоэопермеазы были получены с помощью генетических методов. Эти работы начали проводить сравнительно недавно, но уже ясно, что такого рода подходы помогут получить важные результаты при изучении как этой, так и других транспортных систем. С помощью направленного мутагенеза было показано, что при замене аланина-177 или тирозииа-236 данная пермеаза может переносить мальтозу. Эти сайты, отмеченные на рис. 8.11 кружками, могут участвовать в связывании сахара.

Кабак и его коллеги использовали сайт-специфический мутагенез для изучения механизма функционирования пермеазы. Было показано, что замена многих аминокислот не оказывает заметного влияния на кинетику транспорта. Это означает, что данные аминокислоты не принимают прямого участия в транспорте; более того — их замена не приводит к «глобальным» конформационным изменениям белкового комплекса и не препятствует нормальной организации комплекса в мембране.

Были выделены три мутантные формы, неспособные катализировать определение стадии транспорта. Особенно существенны для нормального транспорта гистидин-322, глутамат-325 и аргинин-302; возможно, эти аминокислоты участвуют в переносе заряда внутри мембраны. Было высказано предположение, что они образуют некую связанную водородными связями группу между спиралями 9 и 10. Пермеаза, в которой глутамат-325 заменен на аланин, не может катализировать активный транспорт или выведение лактозы, но способна осуществлять нормальный обмен лактозы. Следовательно, нагруженная форма переносчика может претерпевать нормальные конформационные изменения, блокируется же какая-то другая стадия полного цикла, возможно депротонирование пермеазы. Можно надеяться, что именно с помощью такого рода экспериментов удастся понять механизм работы данного переносчика. При этом очевидно, что в интерпретации результатов ключевую роль могло бы сыграть установление трехмерной структуры фермента.

Как у Е. coli, так и у высших организмов имеются другие системы симпорта сахара и катионов. Однако лактозопермеаза не гомологична ни переносчикам Н ⁺-ксилозы или Н ⁺-арабинозы, ни переносчику глюкозы млекопитающих. Никакой гомологии не было обнаружено также между лак-тозопермеазой и мелибиозопермеазой из Е. coli. Последняя использует в качестве движущей силы для накопления мелибио-зы симпорт не только Н ⁺, но также и Na ⁺. Способность использовать Na ⁺, по всей вероятности, исключает механизмы с перескакиванием протона по сети водородных связей в пронизывающей мембрану части переносчика. Известен также некий переносчик Na ⁺-глюкозы, который катализирует накопление глюкозы в клетках щеточной каемки кишечника.

БЕЛОК ПОЛОСЫ 3 — АНИОННЫЙ ПЕРЕНОСЧИК ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ

На долю белка полосы 3 приходится около 25% общего количества мембранных белков эритроцита человека; сходные белки присутствуют также в неэритроидных клетках. Этот белок выполняет несколько функции, причем их можно соотнести с двумя основными доменами белковой молекулы. N-концевая часть является гидрофильной и локализована с цитоплазмати-ческой стороны эритроцитарной мембраны. Она содержит места связывания для компонентов цитоскелета, а также для ферментов гликолиза и гемоглобина. Этот домен можно удалить путем протеолиза, не затронув С-концевого домена, который остается связанным с мембраной и опосредует С1"/НСО_э~обмен, а также образует канал в мембране, через который может проникать вода. Внецитоплазматический компонент этой части белка содержит также углеводные антигенные детерминанты нескольких систем групп крови. В мембране белок полосы 3 находится в форме димера или тетрамера.

Было проведено клонирование и секвенирование участка кДНК, кодирующего белок полосы 3 из эритроцитов мыши. Эти данные послужили основой для построения модели белка полосы 3. Было высказано предположение, что он имеет 12 трансмембранных а-спиралей, при этом некоторые из них являются ам-фифильными. Экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу, получены только для нескольких участков полипептида и основаны главным образом на результатах протеолиза и локализации связанных углеводов.

Обширные кинетические исследования согласуются с моделью с чередованием конформации и одним местом связывания. Однако скорость равновесного анионного обмена с помощью переносчика по меньшей мере в 10⁴ раз превышает скорость транспорта как такового. Следовательно, незагруженный переносчик не претерпевает быстрых конформационных превращений, необходимых для того, чтобы анион мог связаться с мембраной. По данным ЯМР с использованием ³⁵С1, у переносчика имеется единственное место связывания, и оно может быть обращено как внутрь, так и наружу. Результаты опытов с использованием игнибиторов транспорта тоже свидетельствуют о том, что в канале имеется единственное место связывания аниона, локализованное где-то в середине канала. При этом предполагается, что переход этого места связывания с одной стороны мембраны на другую блокируется неким «скользящим барьером», который перемещается вдоль канала в результате конформационных изменений. Лимитирующей стадией является конформационный переход нагруженного переносчика, но происходит он достаточно быстро, с частотой 10⁵ с ~¹ при 37 °С. По-видимому, такая высокая скорость предотвращает значительные конформационные изменения в белке. Природа этого конформационного перехода и точная структура канала экспериментально не определены.

Конформационный переход загруженного переносчика, лимитирующий весь транспортный процесс, лишь в очень малой степени зависит от мембранного потенциала. Это согласуется с таким кон-формационным переходом, в результате которого через мембрану перемещается 0,1 связанного с белком заряда. Если этот переход сопряжен с перемещением анионного субстрата, то он должен сопровождаться переносом противоиона, например заряженной аминокислотной группы. В отличие от этого потенциалзависимое конформационное изменение, индуцирующее открывание натриевого канала, приводит к результирующему перемещению через мембрану шести связанных с белком зарядов.

ГРУППА МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ

Гомологичность некоторых транспортных белков внутренней митохондриальной мембраны свидетельствует об их близком родстве: по всей вероятности, они произошли от общего предка в результате дивергентной эволюции. Имеются по меньшей мере три представителя этой группы: 1) ADP/ATP-транслоказа; 2) переносчик фосфата и 3) разобщающий белок. В структуре этих белков имеется много общего, и тем не менее оии существенно различаются по субстратной специфичности. ADP/ATP-транслоказа катализирует транспорт ADP и АТР через бислой. При физиологических условиях АТР транспортируется из митохондрий, a ADP переносится в матрикс. Механизм этого процесса, по-видимому, аналогичен таковому для белка полосы 3, за исключением того, что АТР несет на один отрицательный заряд больше, чем ADP, и поэтому обмен зависит от трансмембранного электрического потенциала на митохондриальной мембране. Переносчик фосфата осуществляет одновременно и симпорт Н ⁺, и, во-видимому, механизм его работы сходен с описанным ранее механизмом для Н ⁺ -лактозопермеа-зы из Е. coli. Этот белок катализирует транспорт фосфата внутрь митохондрий. Благодаря симпорту Н⁺ процесс в целом является электронейтральным и не зависит от трансмембранного потенциала. Разобщающий белок был обнаружен в митохондриях из клеток бурого жира млекопитающих; его функция заключается в диссипации протонного электрохимического градиента, создаваемого при функционировании дыхательной цепи, в результате чего генерируется тепло. Разобщающий белок может также катализировать транспорт анионов, например CI ~, так что, может быть, на самом деле он катализирует транспорт ОН ~, который невозможно экспериментально отличить от транспорта Н⁺. Этот переносчик связывается с нуклеотидами, которые ингибируют транспорт, и его работа может регулироваться жирными кислотами.

Все три переносчика, а возможно, еще и а-кетоглутарат/малат-транслоказа, имеют сходное строение; этот вывод был сделан на основе данных об их аминокислотной последовательности. Все они имеют мол. массу около 33 000 Да и состоят из трех гомологичных доменов, каждый из которых содержит ~ 100 аминокислот. По всей вероятности, эти три домена образовались в результате утроения единственного гена. Была построена модель, согласно которой каждый из гомологичных доменов дважды пересекает мембрану, а вся субъединица содержит шесть трансмембранных а-спи-ралей. С этой моделью согласуются данные по химической модификации. Отметим, что такая структура имеет много общего с Na ⁺ -каналом, состоящим из четырех родственных гомологичных доменов. ADP/ATP-транслоказа является димером и, по-видимому, содержит единственный канал, по которому осуществляется транспорт. Такой вывод основывается на результатах исследований по связыванию ингибиторов с высоким сродством.

Несколько примеров активных переносчиков, использующих энергию гидролиза АТР или фосцЪоенолпирувата

Сделаем несколько замечаний, касающихся первичных активных переносчиков. Охарактеризовано довольно много систем, с помощью которых происходит сопряжение транспорта тех или иных веществ через мембрану с гидролизом макроэргической фосфатной связи или с другой реакцией, в ходе которой высвобождается энергия. Мы не стремимся дать подробный анализ обширной литературы по данному вопросу, а хотим лишь отметить некоторые основные особенности строения и механизма работы этих транспортных систем в контексте того, что мы уже узнали о других группах транспортных белков.

Как мы уже отмечали, в основе кинетических моделей многих первичных активных транспортных систем лежит концепция чередования конформационных изменений. При этом совершенно необязательно, чтобы реакция, в ходе которой высвобождается энергия, например реакция гидролиза АТР, была прямо сопряжена с конформационным переходом, необходимым для транспорта, как это показано на рис. 8.2; важно лишь, чтобы такое сопряжение существовало с одной или несколькими стадиями кинетического цикла. Требования, предъявляемые к структуре трансмембранного «канала» первичного активного переносчика, аналогичны таковым для других переносчиков, но здесь возникает дополнительная сложность — необходимость контроля сопряжения химической реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта растворимого вещества.

О молекулярной структуре первичных активных транспортных систем известно даже меньше, чем о транспортных белках. Идентифицировать группы родственных переносчиков, близких по строению и механизму работы, помогают данные об их аминокислотной последовательности, которых становится все больше. Однако достоверные данные о том, каково строение участков, непосредственно вовлеченных в транспорт веществ, отсутствуют. В основе различного рода структурных моделей активных переносчиков лежит предположение о том, что трансмембранный канал, через который транспортируются вещества, образован кластером трансмембранных амфифильных а-спиралей. Сходным образом и модели, описывающие сопряжение химических реакций и транспорта веществ, опираются на весьма немногочисленные экспериментальные данные. Модели сопряжения можно разделить на две главные группы. Согласно модели прямого сопряжения, химическая реакция оказывает непосредственное влияние на перенос транспортируемого вещества, причем этот процесс не требует значительных опосредованных белком конформаци-онных изменений. Например, протоны, участвующие в гидролизе АТР, могли бы быть именно теми ионами, которые транспортируются через мембрану в ходе данной реакции. Для этого необходимо, чтобы участок комплекса, где протекает химическая реакция, и участок связывания транспортируемого вещества были расположены очень близко друг к другу. В отличие от этого в модели непрямого сопряжения химическая реакция оказывает влияние на транспортный процесс через опосредованные белком конформационные изменения. Допускается даже, что химическая реакция и активный транспорт могут быть связаны с разными субъединицами внутри комплекса. Эти модели имеют то преимущество, что с их помощью нетрудно объяснить транспорт различных веществ одними и теми же или близкородственными белками при участии одних и тех же механизмов.

Активные транспортные системы функционируют со скоростями, типичными для многих ферментов, т. е. 10²—10³ с" ¹ в условиях насыщения. В отличие от канальных белков селективность в отношении субстрата обусловливается главным образом сродством транспортируемого вещества к активному переносчику. Более того, большинство первичных активных переносчиков обычно функционирует в условиях, когда концентрация переносимого вещества с #ис-стороны близка или немного превышает Км и лимитирующей стадией транспорта является конформационный переход белка или химическая реакция, служащая источником энергии для данной системы.

И наконец, роль первичных активных транспортных систем заключается в перемещении вещества через мембрану против его концентрационного градиента в одном направлении. Поскольку переносчик после высвобождения транспортируемого вещества должен опять изменить свою ориентацию с транс на цис, необходим какой-то механизм, препятствующий возвращению на цис-сторону загруженного переносчика. Следовательно, сродство активного переносчика к транспортируемому веществу должно быть| выше с г/ис-стороны, чем с т/7Анс-стороны. Если бы это было не так, переносчик работал бы очень неэффективно при высоких концентрациях субстрата с m/юнс-стороны. В такой реакции энергия затрачивается главным образом на изменение сродства переносчика к транспортируемому веществу. Например, фосфорилирование Na ⁺ /К ⁺ -АТРазы или Са -АТРазы при помощи АТР ведет к стабилизации конформации тех переносчиков, у которых место связывания ионов обращено наружу и которые имеют низкое сродство соответственно к Na ⁺ или Са^{2 +}. В то же время связывание АТР стабилизирует ту форму Na ⁺/К ⁺-АТРазы, в которой места связывания ионов, обращенные к цитоплазме, имеют низкое сродство к К*. Следовательно, механизм сопряжения реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта, катализируемого активными переносчиками, лучше всего рассматривать исходя из термодинамических принципов, т. е. как временную стабилизацию определенных конформации и изменение сродства к транспортируемому веществу.

Можно выделить пять групп переносчиков, которые используют свободную энергию макроэргической фосфатной связи для осуществления транспорта веществ, т. е. Природа нашла несколько путей решения этой задачи.

ПЕРЕНОСЧИКИ КАТИОНОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ: АТР-ЗАВИСИМЫЕ ИОННЫЕ НАСОСЫ

Несколько про- и эукариотических ионпереносящих АТРаз составляют единое семейство и обладают сходными аминокислотными последовательностями и механизмами переноса ионов. Наиболее полно охарактеризованы Na ⁺ /K⁺-ATPa3a из плазматической мембраны животных клеток и Са^{2 +} -АТРаза из сар-коплазматического ретикулума. Большинство ферментов этой группы представляют собой единый полипептид с мол. массой 100 000; исключение составляет Na ⁺/К ⁺-АТРаза, выделенная из нескольких источников, которая содержит вторую, меньшую субъединицу с неизвестной функцией. Эти переносчики ингиби-руются ванадатом и прямо фосфорилируются АТР с образованием фосфорилированного интермедидата, играющего важную роль в транспорте. Катионные переносчики этой группы значительно различаются по ионной специфичности. Неодинакова и стехиометрия транспорта. Например, Са^{2 +}-АТРаза переносит 2Са^{2 +} /АТР в полость саркоплазматического ретикулума, в то время как Na⁺/К ⁺-АТРаза переносит 3Na⁺ наружу и 2К ⁺ в цитоплазму через плазматическую мембрану. При этом различия в работе АТРазы касаются не только стехиометрии и природы переносимых ионов, но также и того, что Са^{2 +} -АТРаза способна переносить ионы лишь в одном направлении, в то время как Na ⁺ /K⁺-АТРаза делает это в обоих направлениях.

Название «фермент Е1Е2-ТИГЩ» было введено в работе, посвященной Na ⁺/К ⁺-АТРазе. Как показали исследования, этот белок существует по меньшей мере в двух различающихся конформациях, для которых характерны разное связывание субстратов и неодинаковая подверженность мягкому протеолизу. Форма Е, соответствует конформации, в которой места связывания ионов обращены в сторону цитоплазмы и которая обладает высоким сродством к АТР. Места связывания ионов в фосфорилированной форме Е₂ обращены наружу. На рис. 8.12 изображен транспортный цикл, в котором участвуют две ненагруженные формы переносчика и две нагруженные, Е_{2 CBCM3}, со «спрятанными» внутри насосного комплекса ионами. Изучение связывания К ⁺ фосфорилированной формой переносчика показало, что оно происходит в двух разных местах.

Отметим основные особенности каталитического цикла.

1. Ei-форма связывает три иона Na⁺ с цитоплазматической стороны мембраны и затем взаимодействует с АТР, образуя фосфори-лированный фермент. Фосфорилируется при этом специфический ас-партат, консервативный в этой группе ферментов.

2. После отсоединения ADP ионы оказываются «спрятанными» внутри комплекса.

3. Фосфорилирование белка стабилизирует конформацию с низким сродством к Na ⁺; при этом места связывания ионов обращены наружу. Это способствует переходу Ei-P -» Ег-Р, в результате которого и осуществляется перенос.

4. В форме Ег-Р места связывания ионов обращены во внеклеточную среду; эта конформация обладает высоким сродством к К⁺, который связывается, катализирует дефосфорилирование и остается «спрятанным» внутри комплекса. Обратите внимание, что Na⁺ необходим для быстрого фосфорилирования, а К⁺ — для быстрого дефосфорилирования. Ванадат связывается с формой Е₂, возможно, как некий аналог переходного состояния фосфата. У других ферментов Е^г-типа, например Са^{2 +} -АТРазы, форма Ег-Р дефосфорилируется и переходит в форму Ei, которая в свою очередь переходит в незагруженную форму.

1. Лимитирующей стадией каталитического цикла является, по всей вероятности, освобождение К⁺ и переход его из связанного с ферментом состояния в свободное. Этот процесс стимулируется связыванием АТР с сайтом, обладающим низким сродством. Следовательно, АТР выполняет две разные функции, выступая в качестве субстрата и аллостерического эффектора. Сколько мест связывания АТР имеет фермент, пока неясно.

Определена аминокислотная последовательность нескольких АТРаз Е|Е₂-типа, включая Na⁺/К⁺-АТРазу из не-

скольких источников, Са^{2 +} -АТРазу, Н ⁺ -АТРазу из плазматической мембраны дрожжей и Neurospora crassa и К⁺-АТРазу из S. faecalis. Исходя из профилей гидрофобности, были построены модели, согласно которым эти белковые комплексы содержат 6, 8 или 10 трансмембранных а-спиральных сегментов. Некоторые участки полипептидов, в том числе и сегмент; содержащий сайт фосфорилирования, в значительной степени гомологичны. Все белки имеют большую гидрофильную петлю, содержащую домены, с которыми, по всей вероятности, связываются нуклеотиды и где происходит фосфори-лирование.

У Са² * -АТРазы один расщепляемый трипсином сайт, чувствительный к конформационному переходу Е| -♦ Ег, находится в «трансдукционном» домене. Исследовалось также связывание Са²⁺ с ферментом; было высказано предположение, что транспорту Са²⁺ предшествует связывание двух ионов Са²⁺ с определенными участками внутри белкового комплекса. По всей вероятности, у Са^{2 +} -АТРазы места связывания Са^{2 +} с высоким сродством располагаются на значительном удалении от места связывания нуклеотидов, однако эту гипотезу нужно еще проверить. Основные особенности строения Са^{2 +}-АТРазы, представленные на рис. 8.13, согласуются с данными электронной микроскопии, согласно которым этот белковый комплекс сильно выступает из бислоя в цитоплазму. Вероятно, в условиях in vivo АТРазы Е|Ег-типа агрегируют, образуя по меньшей мере димеры, но подтвердить данное предположение экспериментально очень трудно. Тем не менее очевидно, что мономеры также способны к катализу, по крайней мере в некоторых случаях.

Определена аминокислотная последовательность меньшей @-субъединицы Na ⁺/К ⁺-АТРазы. Было высказано предположение, что эта субъединица имеет одну или четыре трансмембранные а-спирали.

В заключение отметим, что благодаря легкости клонирования этих мембранных АТРаз и возможности использования разных экспериментальных подходов эти системы являются отличным объектом для применения к ним направленного мутагенеза и других генетических методов. Подобные методы уже применяются в исследованиях FiFo-АТРаз.

АТРазы Fq-ТИПА ИЗ МИТОХОНДРИЙ, ХЛОРОПЛАСТОВ И БАКТЕРИИ

Большинство бактерий, а также митохондрии и хлоропласты содержат родственные АТРазы FiFo-типа, которые используют трансмембранный протонный электрохимический градиент для синтеза АТР из ADP и неорганического фосфата. В физиологических условиях эти ферменты являются АТР-синтазами. Они содержат от 8 до 13 различных субъединиц и, таким образом, являются гораздо более сложными структурами, чем АТРазы EiE₂-THna из плазматических мембран. АТРазы FiFo-типа состоят из двух частей: 1) гидрофильного глобулярного Fi-комплекса, содержащего места связывания нуклеотидов и функционирующего в качестве АТРазы, и 2) мембраносвязанного Fo-kom-плекса, который функционирует как Н⁺-проводящий канал. F|- и Fo-комплексы могут отсоединяться друг от друга, а после очистки их можно реконструировать с восстановлением функциональной активности.

Fi-комплекс из Е. coli содержит пять субъединиц в стехиометрии m/Sj-yot. Между тремя парами а$ в составе Fi наблюдается асимметрия, возникающая, по всей вероятности, в результате асимметричиых взаимодействий с другими субъединицами. В составе каждого комплекса имеется по три каталитических центра, и для быстрого оборота фермента необходимо, чтобы АТР был связан более чем с одним местом связывания. Для объяснения механизма катализа были построены различные модели с чередованием мест связывания, в частности модель, согласно которой в ходе катализа происходит физическое вращение частей фермента. Возможно, в связывании Fi- и Fo-компонентов фермента в мембране участвуют 5- и е-субъединицы.

Fo-комплекс из фермента Е. coli устроен достаточно просто, он содержит только три субъединицы в стехиометрии а\ЬгСю. Все эти субъединицы необходимы для формирования Н⁺ -проводящего канала. Полагают, что Н ⁺ -проводящая часть Fo образована а-спиралями из множественных копий с-субъедииицы. По всей вероятности, эта субъединица содержит пять трансмембранных а-спиралей, в то время как а- и Ь-субъединицы — по одной. Результаты, полученные с помощью генетических методов, согласуются с предположением, согласно которому погруженные в мембрану части всех трех субъединиц играют важную роль в обеспечении протонной проводимости.

Изучение этой системы показывает нам, сколь успешным может быть применение генетических методов для исследования строения мембранных белков, для которых отсутствуют кристаллографические данные высокого разрешения. Очень важно выяснить, приводит ли замена единственной аминокислоты в таком белке к конфор-мационным изменениям, которые скажутся на катализе. По-видимому, результат такой замены сильно зависит от природы переносчика. Например, как мы уже обсуждали, очень обнадеживающими в этом отношении являются данные, полученные для лактоэопермеазы. Очевидно, в следующем десятилетии в изучении взаимосвязи между структурой и функцией мембранных белков главную роль будут играть различные генетические методы, в частности направленный мутагенез.

Рассмотрим результаты, прлученные к настоящему времени для FiFo-АТРазы из Е. coli.

1. Наличие многочисленных мутантных по £-субъединице форм позволяет идентифицировать участок, являющийся, по всей вероятности, каталитическим нуклеотидсвязывающим доменом. Исследование мутантных форм показало также, что между а- и /3-субъединицами имеется конформационное сопряжение.

2. Показано, что мутантные по е-субъединице формы неспособны к сопряжению транспорта Н ⁺ с катализируемой комплексом Fi АТРазной активностью, а также к связыванию комплексов F, и Fo.

3. Показано, что определенные аминокислотные остатки в субъединицах а, Ь и с опосредуют протонную проницаемость; имеющиеся генетические данные позволяют предположить, что субъединица b непосредственно контактирует в мембране с субъединицами а и с.

Связаны ли все эти явления с локальными или глобальными конформационными изменениями, покажут дальнейшие исследования. Пока же мы не может сказать определенно, как происходит сопряжение гидролиза АТР и транспорта Н⁺ при работе АТРазы FiFo-типа, а также с чем связана протонная проводимость.

Важными в этом отношении могут оказаться данные о том, что цитоплазматическая мембрана анаэробной бактерии Propionigenium modestum содержит Na⁺-зависимую АТРазу FiF^vrHna. Если этот фермент работает как первичный АТР-зависимый Na⁺-насос, то логично предположить, что механизм функционирования Н⁺ -АТРазы и Na ⁺-АТРазы одинаков. Например, это позволит исключить модели прямого сопряжения.

ТРИ ДРУГИХ КЛАССА ПЕРЕНОСЧИКОВ

Помимо АТР-зависимых активных переносчиков Е1Е2- и F|Fo-типов есть еще три класса активных переносчиков, использующих свободную энергию гидролиза макроэргических фосфатных связей. О реальных механизмах транспорта или сопряжения в этих системах известно немного. Отметим несколько интересных их особенностей.

1. Бактериальные фосфотрансферазы. Этот комплекс был обнаружен только в бактериях; он катализирует транспорт Сахаров, таких, как глюкоза и маннитол. Уникальной особенностью этой системы является то, что транспорт сахара сопровождается его фосфорилированием. Получаемое фосфатное производное сахара уже не может служить субстратом для переносчика в бактериальной мембране, и таким образом предотвращается обратный поток сахара через эту систему. Вспомним, что в переносчиках EiE2-THna фосфорилирование переносчика стабилизирует форму с низким сродством к переносимому веществу, что также препятствует обратному переносу транспортируемых веществ.

Конечным донором фосфата в фосфотрансферазной системе является фосфоенолпируват. Фосфат переносится специфической последовательностью растворимых фосфорилированных интермедиа-тов в цитоплазму к мембраносвязанному транспортному белку, называемому фермент II или ЕИ. Существует группа ферментов ЕП-типа, специфичных к разным сахарам, но обладающих сходной первичной структурой. По всей вероятности, внутри мембраны ферменты ЕП-типа образуют димеры. Высказывалось предположение, что они формируют каналы. Эти белки чувствительны к реагентам, действующим на сульфгидрильные группы, и к окислению, что может играть важную роль в условиях in vivo. Немного известно о том, каким образом фосфорилированные ферменты ЕП-типа осуществляют транспорт и фосфорилирование Сахаров. Разумной представляется модифицированная модель с чередованием конформации и единственным местом связывания.

2. Бактериальные периплазматические транспортные системы. В дополнение к системам симпорта и фосфо-трансферазной системе бактерии имеют еще одну систему активного транспорта растворимых веществ, которая используется для различных аминокислот и Сахаров. Так, охарактеризованы системы, специфичные к гистидину и мальтозе. К сожалению, биохимические данные, которые могли бы дополнить интенсивные генетические исследования мембраносвязанных компонентов этих систем, весьма немногочисленны. Уникальной особенностью этих систем является то, что они содержат субстратспеци-фичные связывающие белки, локализованные в периплазматиче-ском пространстве. Роль этих белков заключается в связывании переносимого вещества и последующей передаче его собственно транспортирующей системе цитоплазматической мембраны. Специфичность системы определяется как связывающими белками, так и мембраносвязанными компонентами. Цитоплазм этический мембранный компонент содержит три субъединицы, две из которых являются трансмембранными белками, а третья, по всей вероятности, прочно связана с цитоплазматической стороной мембраны. Как оказалось, этот третий компонент транспортного комплекса содержит место связывания нуклеотидов, где, как предполагается, происходит гидролиз АТР — реакция, являющаяся движущей силой активного транспорта. Однако прямые данные, подтверждающие эту гипотезу, отсутствуют. Практически ничего не известно о механизме транспорта, за исключением того, что для него необходим растворимый связывающий белок.

По всей вероятности, эта система аналогична транспортной системе млекопитающих, которая используется ими для выведения из клетки нежелательных лекарственных веществ и обеспечивает множественную лекарственную устойчивость. По-видимому, транспорт разных лекарственных веществ единственной транспортной системой опосредуется группой немембранных связывающих белков. Сходное предположение высказывалось относительно кодируемой плазмидой бактериальной транспортной системы, которая выводит из клеток арсенаты. Предполагается, что эти системы также используют гидролиз АТР в качестве источника энергии, однако это не было прямо продемонстрировано.

3. Вакуолярные Н ⁺ -АТРазы. В эукариотических клетках имеются Н ⁺ -АТРазы, локализованные в мембранах различных внутренних органелл. Эти АТРазы отличаются от АТРаз как FiFo-, 'так и Е|Ег-типов. В некоторых случаях функцией Н ⁺ -АТРазы является транспорт протонов внутрь той или иной органеллы для закисления ее содержимого. Например, известно, что низкий рН в эндоцитозных пузырьках необходим для отсоединения лигандов от их рецепторов, происходящего вслед за эндоцитозом. Хотя достоверные данные о структурном родстве этих Н ⁺-АТРаз пока не получены, известно, что все они 1) содержат более одной субъединицы; 2) не образуют фосфорилированного интермедиата; 3) нечувствительны к ванадату; 4) транспортируют Н ⁺. Однако все эти вопросы требуют дополнительных биохимических и структурных исследований.

Активные транспортные системы, сопряженные с процессом переноса электронов или поглощением света

Имеется несколько интересных примеров активных транспортных систем, которые используют для своей работы изменение окислительно-восстановительного состояния связанной с белком просте-тической группы или энергию света, поглощаемого простетической группой. В целом транспорт и в этом случае подчиняется закономерностям, обсуждавшимся ранее. Для его осуществления нужно стабилизировать некую нестабильную форму белка, которая является необходимым промежуточным соединением в транспортном цикле. Способы стабилизации могут быть различными: фосфорилирование белка или даже связывание АТР, о чем мы уже говорили.

ЦИТОХРОМ с-ОКСИДАЗА: ПРОТОННЫЙ РЕДОКС-НАСОС

Этот белок является наиболее ярким примером фермента, который, функционируя как ионный насос, сопрягает ионный транспорт и реакции переноса электронов. Оксид аза катализирует окисление цитохрома с, локализованного в межмембранном пространстве митохондрий, и восстановление Ог до воды. В этой реакции участвуют четыре иоиа Н ⁺ на каждую молекулу Ог; протоны поступают из матрикса митохондрий. Соотвтетствеино на каждый электрон, проходящий через систему, через внутреннюю митохон-дриальную мембрану переносится по меньшей мере один протон. Фермент содержит две простетические группы гема а, а также два или три атома меди и один атом цинка. Цитохром с-оксидаза — очень консервативный фермент, мало изменившийся в ходе эволюции. Ферменты, сходные с митохондриальной цитохром с-оксидазой, обнаруживаются во многих бактериях. Субъединичный состав комплекса сильно варьирует: он содержит от двух субъединиц у некоторых бактерий до 12 в оксидазе митохондрий сердца быка. По всей вероятности, в переносе Н⁺ непосредственно участвует одна субъединица, ио окончательно этот вопрос еще не выяснен. Согласно данным электронной микроскопии, окси-даза не только пронизывает бислой, ио и выходит на внешнюю поверхность мембраны. К сожалению, до сих пор окончательно не установлен не только механизм ионного транспорта, но и расположение простетических групп в ферменте.

Для описания работы оксидазы можно использовать очень простую модель четырех состояний. В этой модели постулируется, что место связывания Н⁺ доступно с одной стороны мембраны, когда ион металла в составе простетической группы восстановлен, и обращено к противоположной стороне мембраны, когда он окислен. Значения рК в окисленном и восстановленном состояниях также могут различаться. Существенно, что в ходе реакций переноса электронов происходит поочередная стабилизация двух конформации фермента, в которых место связывания Н⁺ обращено к разным сторонам мембраны. Однако механизм этого явления на молекулярном уровне не установлен.

В заключение следует отметить, что существует по меньшей мере один пример редокс-зависимого транспорта Na⁺. Это означает, что такого рода системы не ограничиваются переносом только ионов Н ⁺.

БАКТЕРИОРОДОПСИН: Н⁺ НАСОС, ИСПОЛЬЗУЮЩИЙ ЭНЕРГИЮ СВЕТА

Функция бактериородопсина состоит в активном транспорте протонов через бактериальную цитоплазматическую мембрану. Поглощение света связанной простетической группой ретиналя запускает последовательность событий, которые поддаются регистрации оптическими методами. Эти реакции сопряжены с переносом двух Н ⁺ на каждый цикл работы комплекса. Галородопсин, белок из той же бактерии, использует аналогичный механизм для активного транспорта CI ~. По всей вероятности, мономерная форма бактериородопсина является самостоятельной функциональной единицей, хотя внутри мембраны он находится в виде тримера. Показано, что ретиналь локализован примерно в середине бислоя. Предполагается, что для него характерен прямой механизм сопряжения. Структура белка с семью параллельными а-спиралями, пронизывающими мембрану, не дает ответа на вопрос о существовании какого бы то ни было канала. Как ион Н ⁺ достигает ретина-ля — неизвестно, но, без сомнения, это один из вопросов, который можно будет решить, используя методы сайт-специфического мутагенеза.

В лаборатории Кораны при помощи сайт-специфического мутагенеза были получены многочисленные мутантные формы бактериородопсина. Оказалось, что большинство из них, в том числе и с замещением каждого из 11 остатков тирозина, сохраняют нормальную или близкую к нормальной транспортную активность. Эти данные служат еще одной иллюстрацией использования генетических методов исследования структуры и механизма действия белкового комплекса.

Мембранные поры, создаваемые экзогенными агентами

Мы рассматривали процессы регуляции клеткой потоков веществ через мембрану при помощи различных эндогенных транспортных систем. Однако в условиях in vivo поры в биомембранах могут образовываться с помощью экзогенных веществ, а также под влиянием различных воздействий. Многие пептиды и белки, создавая неселективные поры в плазматической мембране клетки-мишени, убивают клетку. Мы рассмотрим разные способы образования пор в биомембранах под действием специфических агентов или физических факторов.

ТОКСИНЫ -И ЦИТОЛИТИЧЕСКИЕ БЕЛКИ

В природе существуют различные водорастворимые токсины, взаимодействующие со специфическими клетками-мишенями. Как минимум, токсины должны узнавать определенные рецепторы на наружной поверхности мембраны и каким-то образом проникать в цитоплазму. Одни токсины способствуют высвобождению в цитоплазму фермента, оказывающего летальное воздействие, другие просто образуют в мембране неселективные поры, давая возможность метаболитам, ионам, а иногда и макромолекулам выйти из клетки. Наиболее интересным представляется вопрос о том, как эти водорастворимые гидрофильные белки спонтанно встраиваются в мембранный бислой. Рассмотрим основные свойства некоторых из токсинов, образующих поры в биомембранах.

1. Колицины представляют собой одиночные полипептиды, и некоторые из них образуют неселективные каналы в цитоплазматической мембране чувствительных штаммов Е. coli. Наиболее полно к настоящему времени охарактеризованы колицины Е1 и А. Очищенные белки спонтанно формируют в плоских мембранах потенциалзависимые каналы, достаточно большие, чтобы пропускать такие молекулы, как NAD⁺. Недавно был выделен и охарактеризован каналообразующий участок, находящийся на С-конце колицина Е1. Его аминокислотная последовательность отлична от таковой у интегральных мембранных белков. Под действием напряжения происходит переход образуемой колицином Е1 поры из открытого состояния в закрытое, что сопровождается переносом через мембрану значительного количества белка. Пору образует только одна молекула колицина.

2. Дифтерийный токсин представляет собой одиночный полипетид, также продуцируемый бактериями, который при связывании с поверхностными рецепторами определенных клеток образует в мембране канал и высвобождает в цитоплазму фермент, оказывающий летальное действие. Один фрагмент токсина формирует в мембране поры, размер которых достаточно велик, чтобы через них мог пройти сегмент токсина, обладающий ферментативной активностью. Однако окончательно не доказано, что именно таков механизм переноса. Сходные результаты были получены и для токсинов, вызывающих столбняк и ботулизм. Холерный токсин состоит из двух субъединиц, при этом субъединица В образует в мембране олигомер с центральным каналом, который используется для переноса А-субъединицы, обладающей ферментативной активностью. С помощью рентгеновской кристаллографии была установлена структура экзотоксина А из Pseudomonas, близкого по строению к дифтерийному токсину, что,однако, не помогло выяснить механизм спонтанного встраивания этого растворимого белка в мембрану и образования поры.

3. Комплекс комплемента и порообразующих белков из цито-токсичных Т-клеток. Эти родственные белки сыворотки агрегируют, образуя большие поры в мембране клеток-мишеней. Первичным компонентом этого комплекса является белок С9, который после нескольких актов самосборки с участием других компонентов системы комплемента формирует большую пору, в результате чего происходит лизис клетки. Этот белок интенсивно изучали с использованием модельных систем плоских мембран и липосом. Однако механизм формирования поры на молекулярном уровне до сих пор неизвестен.

Примером другого токсина, который агрегирует в мембране, образуя большую пору, является а-токсин из S. aureus. Известно, что он образует гексамерную структуру, претерпевающую при связывании с мембраной конформационные изменения.

ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИЯ ПРИ ПОМОЩИ ДЕТЕРГЕНТОВ

Сапонин и дигитонин взаимодействуют с холестеролом внутри мембран и образуют агрегаты в виде крупных пор. Эти агенты широко используются для формирования больших отверстий в плазматических мембранах клеток, через которые внутрь клеток могут проходить как небольшие молекулы, так и макромолекулы.

ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИЯ ПРИ ПОМОЩИ ОСМОТИЧЕСКОГО ШОКА

Под действием осмотического шока в мембранах образуются отверстия. Так, в мембране эритроцита появляется одно большое отверстие диаметром ~ 1 мкм, размер которого затем уменьшается до 14 280 А. Конечный размер зависит от состава буфера. Детали формирования и строения этого гемолитического отверстия неизвестны.

ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИЯ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПОЛЯ

Поры в плазматической мембране животных клеток могут образовываться и под действием электрического поля. Исследования, проведенные на тенях эритроцитов, показали, что вблизи катода происходит формирование нестабильных больших пор, которые затем быстро уменьшаются до 10 А. Образование пор под действием электрического поля иногда используют для инициации слияния клеток. Связано ли наблюдаемое порообразование со структурными изменениями, вызывающими слияние мембран, неизвестно.

ПЕРМЕАБИЛИЗАЦИЯ ЗА СЧЕТ ОБРАЗОВАНИЯ ДЕФЕКТОВ УПАКОВКИ МЕМБРАННЫХ КОМПОНЕНТОВ

Любая обработка, которая изменяет упаковку липидов и белков в мембране, может привести к нарушению функции мембраны как барьера для гидрофильных веществ. Например, проницаемость ли-посом при температуре фазового перехода существенно повышается, становясь эквивалентной проницаемости поры диаметром 18 л. К аналогичному эффекту может привести и агрегация белков как в реконструированных протеолипосомах, так и при перекрестном сшивании мембранных белков внутри биомембран. Эти явления вряд ли участвуют в естественных физиологических процессах, однако они указывают на то, что какие-то изменения в организации мембранных компонентов несовместимы с функцией мембраны.

Резюме

Транспорт большинства растворимых молекул через биологические мембраны опосредуется переносчиками или канальными белками. Каналы облегчают транспорт ионов через мембрану, и перенос через них осуществляется очень быстро. Такие высокие скорости транспорта ионов связаны с тем, что канальные белки не претерпевают конформационных изменений при переносе иона с одной стороны мембраны на другую. Столь быстрый транспорт ионов обусловливает такую высокую мембранную проводимость, что удается измерить ионный ток через отдельный канал. В отличие от этого переносчики, которые участвуют в транспортном цикле, претерпевают конформационные изменения. При этом место связывания переносимого вещества бывает обращено сначала к одной, а затем к противоположной стороне мембраны. Как правило, опосредованный переносчиками транспорт веществ через мембрану происходит на несколько порядков медленнее, чем транспорт по каналам.

Пассивные переносчики просто облегчают диффузию веществ через мембрану, в то время как активные используют энергию для транспорта веществ против концентрационного градиента. Известны активные переносчики, сопрягающие транспорт вещества с переносом электронов, гидролизом АТР или фосфоенолпирувата, поглощением света или совместным транспортом иона.

Существуют группы каналов и переносчиков, которые объединяют функционально различающиеся белки, имеющие сходное строение. Близость их аминокислотных последовательностей позволяет предположить, что, несмотря на различия в субстратной специфичности, каналы и переносчики одной группы могут фукнционировать по сходному механизму. По-видимому, белковые комплексы образуют в мембране пору, находящуюся в центре белкового кластера, который содержит несколько копий одинаковых или близкородственных полипептидов или доменов одного полипептида. Эти поры могут открываться или закрываться в ответ на химический или электрический сигнал.