Курсовая Виготовлення лікарських препаратів на основі амілолітичних ферментів
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2015-10-25Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
ЗМІСТ
ВСТУП
1. ДЖЕРЕЛА ОДЕРЖАННЯ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ
1.1 Продуценти –прокаріоти
1.2 Продуценти – дріжджеподібні гриби
1.3 Продуценти – мікроскопічні гриби
1.4 Патентний пошук
1.4.1 Штам цвілевого гриба Aspergillus аwamori IMBF-100017 - продуценту амілолітичних ферментів
1.4.2 Штам бактерій Васillus licheniformis – продуцент комплексу термостабільних амілолітичних і протеолітичних ферментів
2. МЕХАНІЗМ ДІЇ ТА ВЛАСТИВОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ
2.1 Властивості та структура ферментів
2.2 Класифікація амілолітичних ферментів
2.3 Механізм дії амілолітичних ферментів
3. ФІРМИ ВИРОБНИКИ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
3.1 Українські виробники
3.2 Закордонні виробники
3.3 Російські виробники
4. ГАЛУЗІ ВИКОРИСТАННЯ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
4.1 Хлібопекарська і крохмалопаточна промисловість
4.2 Пивоваріння та спиртова промисловість
4.3 Текстильна промисловість
4.4 Фармацевтична промисловість
5. СУЧАСНІ НАУКОВІ ДОСЛІДЖЕННЯ, ПОВ`ЯЗАНІ З РОЗРОБКОЮ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
5. 1Комп'ютерне моделювання структурі амілолітичних ферментів
6. ОСОБЛИВОСТІ ТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРОЦЕСУ ВИРОБНИЦТВА АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
6.1 Виробничі способи культивування мікроорганізмів – продутентів ферментів
6.2 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з глибинних культур мікроорганізмів
6.3 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з поверхневих культур мікроорганізмів
7. МЕТОДИКИ ВИЗНАЧЕННЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЇ АКТИВНОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ
7.1 Спектрофлюрометричні методи
7.2 Колориметричні (фотометричні) методи
7.3 Спектрофотометричні методи
7.4 Манометричні методи і інші методи
ВИСНОВОК
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
ВСТУП
Ферменти або ензими – органічні каталізатори білкової або РНК природи. Ферменти каталізують більшість хімічних реакцій, які відбуваються у живих організмах.
Великою і незаперечною перевагою ферментів перед хімічними каталізаторами є те, що вони діють при нормальному тиску, при температурах від 20 до 70 ° С, рН в діапазоні від 4 до 9 і мають у більшості випадків виключно високу субстратну специфічність, що дозволяє в складній суміші біополімерів направлено впливати тільки на визначені з'єднання.
НА сьогоднішній день в світі інтенсивно збільшується виробництво ферментів для використання їх в різноманітних ланках людської життєдіяльності. Не виняток і амілолітичні ферментні препарати. Завдяки своїм особливості – каталізу реакцій гідролізу різноманітних оліго- та полісахаридів – амілолітичні ферменти використовуються в харчовій промисловості, легкій промисловості, медичній промисловості, та в діагностичних цілях. Їх використання значно спрощує та значно здешевлює технологічний процес виробництва.
Все це свідчить про те, що виробництво амілолітичних ферментних препаратів є одним з перспективних напрямків у біотехнології, що буде і далі інтенсивно розвиватися та розширюватися. І саме тому цей реферат наддає докладну інформацію про структуру та функції а також схему виробництва амілолітичних препаратів.
1. ДЖЕРЕЛА ОТРИМАННЯ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ
НА сьогоднішній день амілолітичні ферментні препарати в Україні та за кордоном набули дуже широкого використання.
До розвитку ферментної промисловості головним промисловим джерелом отримання амілаз в європейських країнах було проросле зерно (солод). Для медичних цілей амілази отримували з тваринної сировини. В даний час головним джерелом амілаз є прокаріоти, особливо бактерії, гриби і найрідше дріжджі[1,2].
1.1 Прокаріоти
Серед бактеріальної мікрофлори найбільш ефективними продуцентами є такі мікроорганізми: Вас. subtilis, Вас. diastaticus, Вас. mesentericus, Вас. macerans і Вас. polymycus та ін.
Бацили – продуценти амілолітичних ферментів представляють собою в більшості випадків Г+ палички довжиною 1,2 ... 1,3 мкм і діаметром 0,6 ... 0,8 мкм. Палички з'єднуються по два, три, іноді утворюють ланцюжки. собою утворюють спори, що надають стійкість клітині при дії несприятливих умов. Такі форми легко переносять висушування, низькі та високі температури, опромінення і т. д. Цикл розвитку бактерій порівняно короткий.
рН-стабільність мікробних глюкоамілаз лежить в широкому діапазоні від 2,5 до 9. Термостабільність глюкоамілаз лежить в інтервалі від 30 до 45 ° С і рідко підвищується до 55-60 ° С. Глюкоамілази різного походження помітно відрізняються по молекулярній масі, яка, за даними різних авторів, має значення від 48 000 до 210 000.
Бактерію Вас. subtilis-82, що застосовується в даний час на спиртових заводах як продуцент α-амілази в суміші з препаратами глюкоамілази, вирощують протягом 48 ... 60 годин при температурі +30 - +35 ° С.
Особливість застосування бактерій у виробництві – їх здатність утворювати високоактивну термостійку α-амілазу. Для розрідження крохмалю також застосовуються амілолітичні препарати, що містять α-амілазу: α-амілаза гідролізує внутрішні альфа-1,4-глікозидні зв'язки крохмалю, приводячи до швидкого зниження в'язкості клейстеризованих розчинів крохмалю, тим самим забезпечуючи підготовку сусла до дії глюкоамілази. Кінцевими продуктами дії бактеріальної альфа-амілази на крохмаль є низькомолекулярні розчинні декстрини з невеликим змістом моно-і дисахаридів (глюкози і мальтози). [3].
1.2 Дріжджоподібні гриби
Амілолітичні ферменти синтезують також деякі дріжджі і дріжджоподібні гриби родів Saccharomyces, Candida, Endomycopsis і Endomyces.
Відомо більше 100 видів дріжджів, які добре ростуть на крохмалі як на єдиному джерелі вуглецю. Серед них особливо виділяються два види, які утворюють як глюкоамілази, так і β-амілази, ростуть на крохмалі з високим економічним коефіцієнтом і можуть не тільки асимілювати, але і зброджувати крохмаль: Schwanniomyces occidentalis і Saccharomycopsis fibuliger. Обидва види - перспективні продуценти амілолітичних ферментів на крохмалевмісних відходах.
У спиртовому виробництві знайшли застосування дріжджоподібні гриби End. bispora і End. species 20-9, що вирощуються глибинним способом і продукують головним чином активну глюкоамілазу; активність ферменту виявляється слабо. Високоактивний End. bispora має розгалужений міцелій, утворює бластоспори; гіфи – септовані, зернисті; на твердих агаризованних середовищах пророщують колонії з повітряним сірувато-білим міцелієм, на рідких поживних середовищах - гіфи і деяка кількість бластоспор.
Дріжджоподібні гриби в спиртовому виробництві самостійно не застосовують, тому що вони не містять інших ферментів, необхідних для нормального оцукрювання сусла з крохмалевмісної сировини. Зазвичай їх використовують у суміші з ферментними препаратами з мікроскопічних грибів чи бактерій [4].
1.3 Мікроскопічні гриби
Для отримання амілаз широко застосовують мікроскопічні гриби роду Aspergillus, видів: niger, oryzae, usamii, awamori, batatae, роду Rhizopus, видів: delemar, tonkinensis, niveus, japonicum та ін, А також окремі штами Neurospora grassa і Mucor.
Мікроскопічні гриби дуже широко поширені в природі; основне місце їх проживання – грунт.
Всі роди і види мікроскопічних грибів характеризуються нитковидною будовою тіла і специфічною будовою плодоносних органів. Тіло гриба складається з довгих переплетених ниток сіруватого або білого кольору, що називаються гіфами. Вони поширюються по поверхні поживного субстрату, утворюючи міцелій, і частково вростають в нього. Деякі гіфи, що піднімаються над поверхнею у вигляді легкого пуху, мають більш складну будову і мають органи плодоношення, що називаються конідіями або спорангієносцями. У мукорових грибів на спорангієносця знаходиться кулевидне здуття, оточене оболонкою, всередині якого утворюються спори. У аспергіллів кінець конідієносця має булавкоподібні потовщення, від якого відходять подовжені клітини, звані стеригмами; від стеригм відшнуровуются більш дрібні круглі клітини – конідії
Відокрелені конідії або спори, потрапляючи у сприятливі умови, починає проростати, потім гіфи гілкуються, утворюючи міцелій; при виснаженні живильних речовин у середовищі гриб переходить у стадію споро- або конідієутворення. Спори і конідії мікроскопічних грибів містять пігменти, що і додає зрілим культурам характерного забарвлення. Спори розвиваються трьома різними способами, в залежності від виду мікроскопічного гриба:
· як круглі ділянки в межах мережі гіфів;
· як речовина в торбинці на кінці антени Гіфа;
· як схожі на ланцюгу ділянки на кінці антени Гіфа
Аспергілли - типові аерофіли, тому вони можуть розвивватись тільки на поверхні твердого або рідкого середовища або в рідкому середовищі, що аерується. Оптимальна температура для більшості аспергіллів +25 - +30 ° С, для деяких - до 35 ° С. Більшість грибів при поверхневому культивуванні можуть переносити короткочасне підвищення температури до 40 ° С і навіть 45 ° С без помітної втрати активності ферментів. Оптимальна вологість середовища для них близько 65%.
Для живлення аспергіллів необхідні вуглеводи, азотисті і мінеральні речовини. Як джерело вуглеводу, крім моносахаридів, багатьох оліго- і полісахаридів, можуть бути спирти і органічні кислоти, однак для накопичення амілази в середовищі обов'язково повинні бути присутніми крохмаль, декстрини або мальтоза. У середовищах, що містять інші цукри, в тому числі глюкозу, гриби не утворюють амілази. Джерелом азоту можуть бути білки і їх гідролізати, амонійні солі та нітрати.
Середа повинні містити сполуки, до складу яких входять сірка, фосфор, калій, магній і мікроелементи. Більшість мікроскопічних грибів засвоюють сірку з сульфатів, а фосфор – з фосфатів. Аспергілли не потребують готових вітамінах та фактори росту, тому що здатні самі синтезувати їх з більш простих сполук, що є в середовищі. Препарати ферментів з мікроскопічних грибів включають, як правило, широкий набір ферментів, тому можуть повністю замінювати зерновий солод[4,5].
1.4 Патентний пошук
1.4.1 Штам цвілевого гриба Aspergillus аwamori IMBF-100017 - продуценту амілолітичних ферментів
Суть винаходу: Винахідвідноситься дохарчової промисловості, зокрема до спиртової, і може бути використаний на спиртових заводах для оцукрювання крохмалемісних субстратів. Відомі продуценти амілолітичних ферментів Asp. niger, Asp. oryzae, Rhizopus, Asp. awamon штам 224-21, 78-2, AK-1 (Глюкоамипаза микроорганизмов - M 1975 -C 6-10) Відомий штам Asp. awamon № 466, якийзастосовується на спиртових заводах дляодержання ферментів глкжоамілазного комплексу (Промисловий регламент виробництва аміпоглюкавамаріну Гх-466, Київ, 1995 - С 3 -4), але цей штам має не дуже високу активність синтезу амілолітичних ферментів За 120 -144 год росту накопичує 140-180 од/см3 активності
Задача винаходу – селекція нового штаму Asp. awamon з підвищеною бюсинтетичною активністю і швидкістю росту культури. Технічний результат, який одержують від реалізації винаходу полягає в підвищенні ферментативної активності штаму та швидкості його росту.
Описання винаходу: Досягається технічнийрезультат використанням нового штаму Aspergillus awamon IMBF 100017 – продуцента амілолітичних ферментів для оцукрювання крохмалю з підвищеною бюсинтетичною активністю. При цьому виникає пов'язана з технічним результатом споживча властивість заявляемого об'єкту – підвищення виходу і активності цільового продукту. Штам пліснявого гриба Aspergillus awamon IMBF 100017 відселекційоновано шляхом багатоступінчатого відбору з виробничої популяції продуценту амілолітичних ферментів Одержаний штам гриба Aspergillus awamon IMBF 100017 має такі морфологічні та фізіологічні ознаки.
Культурально-морфолопчні ознаки.На середовищі Чапека із сахарозою гігантська колонія на 12 добу росту при температурі 30°С має розмір 39,0 - 43,0мм, форма колоній кругла, колір колонії від темно-коричневого до чорного, край колонії нерівний, поверхня колонії плоска, складчастість слабо виражена, переважно в центрі колони, пігмент із зворотної сторони колони світлокоричневий, ексудат відсутній, конідії утворюються по всій поверхні колонії, більш щільно в центрі колонії, колір конідій від темно-коричневого до чорного. Через 12 діб проводять мікроскопічне дослідження колоній гриба на чашках Петрі з метою вивчення органів розмноження. При спостереженнікраюколонії виявлено сегментований міцелій, від якого вертикально відходять конідієносці На їх вершинах утворюються розширення у вигляді головок, або булав, на поверхні яких з'являються чисельні дрібні вирости-стеригми Стеригми прості, не розгалужуються Від стеригм відшнуровуються ланцюжки округлих гладеньких темнокоричневих або чорних конідій. Розмноження безстатеве, вегетативне, шляхом утворення конідій. Фізіологічні ознаки. На рідких поживних середовищах культура здатна утилізувати крохмаль, сахарозу, глюкозу, мальтозу.
Оптимальна температура росту на рідких поживних середовищах - 30°С.
Тип дихання – аеробний.
Технологічнахарактеристика: При вирощуванні гриба штаму 1MB F 100017 на водно-борошняній суспензії (концентрація сухих речовин кукурудзяного, житнього або пшеничного сусла повинна бути не менше 18 - 20%) культура активно синтезує ферменти глюкоамілазного комплексу При глибинному культивуванні на 5 добу в умовах інтенсивної аерації глюкоамілазна активність досягає 200 - 220 од/см3). Біотехнологічні показники заявленого штаму 1MB F 100017 ілюструються прикладом.
Приклад: Оцінку виробничих якостей штаму 1MB F 100017 проводили методом глибинного культивування на розвареній оцукреній водно-борошняній суспензії Співвідношення борошна і води 1 2,5, оцукрювали бактеріальною а-амілазою (1,5 од/г крохмалю) Витрати повітря на аерацію 25 - ЗО м3/м3/год при постійному перемішуванні 110-120 об/хв.
Температура культивування - 35°С
Тривалість процесу -120 годин
В культуральній рідині (в кінці вирощування) визначали активність амілолітичних ферментів. Дані, які підтверджують перевагу заявленого штаму в порівнянні зі штамом-прототипом, наведені є таблиці 1.1.
Таблиця 1.1. Показники продуктивності шатму гриба Asp. awamon
| Показники | Штами гриба Asp. awamon | |
| (заявлений) | (прототип) | |
| Тривалість процесу, год | 120 | 144 |
| а-аміпазна активність, од/см3 | 50 ±5 | 30 ±5 |
| Глюкоамілазна активність од/см3 | 150±10 | 110 ± 10 |
| Сумарна амілолггична активність, од/см3 | 200 - 220 | 140-180 |
Як видно з таблиці, при використанні заявленого штаму а-амілази накопичусться на 15% більше ніж за прототипом Глюкоамілазна активність - на 36% більше, ніж за прототипом Тривалість процесу накопичення ферментів скорочується на 20%
Таким чином застосування заявленого штаму дозволяє збільшити на 20 - 30% накопичення амілолггичних ферментів, а також скоротити тривалість їх накопичення на 20%
Номер патенту: 47822
Клас (и) патенту: C12N 1 / 14, C12R 1 / 665, C12P 7 / 06
Номер заявки: 2001096648
Дата подачі заявки: 28.09.2001
Дата публікації: 15.07.2002
Заявник (и): Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів.
Автор (и): Олійнічук Сергій Тимофійович; Левандовський Леонід Вікторович; Ткаченко Алла Феодосіївна; Рудніченко Людмила Вікторівна; Коваль Катерина Олександрівна; Бейко Наталія Євгенівна
Патентовласник (и): Український науково-дослідний інститут спирту і біотехнології продовольчих продуктів.
1.4.2 Штам бактерій Васillus licheniformis – продуцент комплексу термостабільним амілолітичні і протеолітичних ферментів
Суть винаходу: винахід відноситься до біотехнології і може бути використане в спиртовому, крохмале-патоковому, пивоварному, хлібопекарському, кондитерському, плодово-ягідному, текстильному виробництвах, де потрібні ферменти, стійкі до підвищених температур. Штам бактерій Bacillus licheniformis ВКМ У-2184 Д виділений селекційним шляхом при вивченні природної мінливості штаму МКПМ В-6508 із застосуванням методів ефективного мутагенезу. Продукує комплекс, що містить не менше п'яти термостабільних амілолітичних і протеолітичних ферментів. Активний діапазон значень рН 5,0-11,0 і температури 30-105 є С з максимальною активністю альфа-амілази при 90-95 є С, пуллуланази - при 75 є С, протеази - при 60 є С. Перспективний для одночасної обробки крохмалю або крохмалевмісних сировини з метою його глибокого гідролізу і як продуцент лужних протеаз для глибокого розщеплення білків до амінокислот. Штам має підвищену здатність синтезу комплексу термостабільним амілолітичні і протеолітичних ферментів, що володіє також бета-глюканазной і ламінаріназной активностями.
Номер патенту: 2177995
Клас (и) патенту: C12N1/20, C12N9/28, C12N9/44, C12N9/56, C12N1/20, C12R1: 10
Номер заявки: 98102082/13
Дата подачі заявки: 05.02.1998
Дата публікації: 10.01.2002
Заявник (и): Товариство з обмеженою відповідальністю Науково-виробнича компанія "Фермтек"
Автор (и): Цурікова Н.В.; Нефедова Л.І.; Окунєв О.Н.; Синицин А.П.; Черноглазов В.М.
Патентовласник (и): Товариство з обмеженою відповідальністю Науково-виробнича компанія "Фермтек"
Опис винаходу: винахід відноситься до галузі біотехнології, а саме до отримання комплексу амілолітичних і протеолітичних ферментів, і може бути використане в мікробіологічнійпромисловості. Амілолітичні ферменти широко використовуються для розрідження або перетворення крохмалю і крохмалевмісної рослинної сировини в такі продукти, як мальтодекстрин, цукрові сиропи, декстрозу, мальтозу, глюкозу та ін При промисловому використанні амілолітичних ферментів необхідні термостабільні ферменти, що обумовлені їх здатністю вести гідроліз сировини при високих температурах - 80-100 є С, що дуже важливо з точки зору ведення процесу клейстерізації крохмалю. При цьому поєднуються два процеси: клейстерізація крохмалю і його ферментативний гідроліз. Значно знижується вартість ферментативного процесу за рахунок скорочення дозування ферменту і тривалості гідролізу крохмалю, більш якісно ведеться підготовка сировини до розварювання - забезпечується висока ступінь гідролізу крохмалю і, як наслідок цього, збільшується вихід цільового продукту. Для переважної більшості продуцентів амілолітичних ферментів характерний переважний біосинтез одного з ферментів. Здатність до утворення комплексу ендогенних амілолітичних ферментів, особливо термостабільності, виявляється дуже рідко. У цьому зв'язку можна назвати ряд термостабільним анаеробів з роду Clostridium. Відомий штам Clostridium thermohidrosulfuricum, що синтезує комплекс, що містить термостабільні пуллуланазу і глюкоамілазу. У літературі описано декілька анаеробних термофілів з роду Clostridium, що здійснюють біосинтез амілази і пуллуланази або альфа-амілази і глюкоамілази, активних при високій температурі. Однак складність культивування анаеробних бактерій в заводських умовах робить цей спосіб отримання препарату амілолітичних ферментів практично непридатним. З літературних даних відомо, що найбільш термостабільними гідролітичними ферментами, такими як альфа-амілази, пуллуланази, а в ряді випадків і протеази є ферменти, які продукують термофільних бактерій Bacillus licheniformis. Відомий аеробний Термофіл Bacillus licheniformis, який при культивуванні на середовищі з кукурудзяної борошном оптимального для отримання продукту складу синтезує комплекс позаклітинних амілолітичні ферментів - альфа-амілазу і пуллуланазу в кількості 2 од / мл і 0,68 од / л відповідно (5). Недоліком цього штаму є низька активність продукуються ферментів, вузький спектр дії комплексу і тривалість процесу культивування (144 години). Недоліками штаму є порівняно низький рівень активності, а також висока вартість культивування через застосування висококонцентрованою живильного середовища та тривалості процесу.
Культурально-морфологічні ознаки: Клітини являють собою грампозитивні, поодинокі рухливі палички розміром 0,6-0,8 і 0,2-0,3 мк, спороутворюючі. У перші години зростання (логарифмічна фаза) утворюються ланцюжки з 2-3 клітин більш витягнутої форми, до 48-56 години зростання (стаціонарна фаза) ланцюжка розпадаються, клітини товщають, з'являються спори, що мають центральне положення і овальну форму.
2. МЕХАНІЗМ ДІЇ ТА ВЛАСТИВОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ
2.1 Властивості та структура ферментів
Принципова структура ферменту наступна: кожен фермент складається з апофермента і коферменту, які, кожен окремо, не активний, але виявляють свою дію в комплексі - холоферменті. Всі ферменти мають білкову природу. Вони являють собою або прості білки, цілком побудовані з поліпептидних ланцюгів і розпадаються при гідролізі тільки на амінокислоти (наприклад, гідролітичні ферменти трипсин і пепсин, уреаза), або - в більшості випадків - складні білки, що містять разом з білкової частиною (апоферментом) небілкової компонент (кофермент або простетичної групу). Багато ферменти з великою молекулярною масою проявляють каталітичну активність тільки у присутності специфічних низькомолекулярних речовин, які називаються коферментом (або кофактором). Роль коферментів грають більшість вітамінів і багато мінеральних речовин. Вітаміни РР (нікотинова кислота, або ніацин) і рибофлавін, наприклад, входять до складу коферментів, необхідних для функціонування дегідрогеназ. Цинк - кофермент карбоангідрази, ферменту, який каталізує вивільнення з крові діоксиду вуглецю, який видаляється з організму разом з повітрям, що видихається. Залізо і мідь служать компонентами дихального ферменту цитохромоксидази. Речовини, яка піддається перетворенню в присутності ферменту, називають субстратом. Субстрат приєднується до ферменту, який прискорює розрив одних хімічних зв'язків в його молекулі та створення інших; що утворюється в результаті продукт від'єднується від ферменту. Продукт теж можна вважати субстратом, оскільки всі ферментативні реакції в тій чи іншій мірі оборотні.
За типом реакцій, що каталізуються ферменти підрозділяються на 6 класів згідно ієрархічної класифікації ферментів (КФ, EC - Enzyme Comission code). Кожен клас містить підкласи, так що фермент описується сукупністю чотирьох чисел, розділених крапками. Перше число грубо описує механізм реакції, що каталізується ферментом:
КФ 1: оксидоредуктаиз, каталізують окислення або відновлення.
КФ 2: трансферази, каталізують перенос хімічних груп з однієї молекули субстрату на іншу.
КФ 3: Гідролази, каталізують гідроліз хімічних зв'язків. Приклад: естерази, пепсин, трипсин, амілаза, ліпопротеінліпаза
КФ 4: Ліази, каталізують розрив хімічних зв'язків без гідролізу з утворенням подвійного зв'язку в одному з продуктів.
КФ 5: Ізомерази, каталізують структурні або геометричні зміни в молекулі субстрату.
КФ 6: Лігази, каталізують утворення хімічних зв'язків між субстратами за рахунок гідролізу АТФ.
Будучи каталізаторами, ферменти прискорюють як пряму, так і зворотну реакції, тому, наприклад, ліази здатні каталізувати і зворотну реакцію – приєднання по подвійним зв'язкам.
Ферменти являють собою біокаталізатори білкової природи. Каталізуючи переважна більшість біохімічних реакцій в організмі, ферменти регулюють обмін речовин і енергії, граючи тим самим важливу роль у всіх процесах життєдіяльності. Всі функціональні прояви живих організмів (дихання, м'язова скорочення, передача нервового імпульсу, розмноження і т.д.) забезпечуються дією ферментних систем. Сукупністю ферментних реакцій, що каталізуються, є синтез, розпад та інші перетворення білків, жирів, вуглеводів, нуклеїнових кислот, гормонів та інших сполук.
Активність ферментів визначається їх тривимірної структурою [3]. Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюжка амінокислот, яка згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим чином, і виходить молекула (білкова глобула) має унікальні властивості. Кілька білкових ланцюгів можуть об'єднуватися в білковий комплекс. Третинна структура білків руйнується при нагріванні або дії деяких хімічних речовин.
Щоб каталізувати реакцію, фермент повинен зв'язатися з одним або декількома субстратами. Білковий ланцюг ферменту згортається таким чином, що на поверхні глобули утворюється щілина, або западина, де зв'язуються субстрати. Ця область називається сайтом зв'язування субстрату. Зазвичай він збігається з активним центром ферменту або знаходиться поблизу нього. Деякі ферменти містять також сайти зв'язування кофакторів або іонів металів.
Фермент, з'єднуючись з субстратом:
• очищає субстрат від водяної «шуби»
• має у своєму розпорядженні реагують молекули субстратів в просторі за потрібне для протікання реакції чином
• готує до реакції (наприклад, поляризує) молекули субстратів.
Зазвичай приєднання ферменту до субстрату відбувається за рахунок іонних або водневих зв'язків, рідше – за рахунок ковалентних. Наприкінці реакції її продукт (або продукти) відділяються від ферменту.
У результаті фермент знижує енергію активації реакції. Це відбувається тому, що в присутності ферменту реакція йде іншим шляхом (фактично відбувається інша реакція), наприклад:
У відсутності ферменту:
А + В = АВ
У присутності ферменту:
А + Ф = АФ
АФ + В = АВФ
АВФ = АВ + Ф
де А, В - субстрати, АВ - продукт реакції, Ф - фермент.
Ферменти не можуть самостійно забезпечувати енергією ендергонічні реакції (для протікання яких потрібна енергія). Тому ферменти, що здійснюють такі реакції, сполучати їх з екзергонічними реакціями, що йдуть з виділенням більшої кількості енергії [2,7].
2.2 Класифікація амілолітичних ферментів
Амілолітичні ферменти об'єднують велику групу ферментів, які здійснюють гідроліз переважно α-(1,4)-Глікозидних зв'язків амілози, амілопектину, глікогену та інших мальтоолігосахаридів. До групи амілолітичних ферментів відносяться наведені нижче і деякі інші ферменти:
КФ 3.2.1.1 α-амілаза
КФ 3.2.1.2 β-амілаза
КФ 3.2.1.3 Глюкоамілаза
КФ 3.2.1.41 Пуллуланаза
КФ 3.2.1.68 Ізоамілаза
КФ 3.2.1.20 α-глюкозидази
КФ 3.2.1.11 Декстраназа
КФ 2.4.1.19 Амілаза Bacillus macerans (циклодекстроглюканотрансфераза)
Амілази бувають двох типів: ендо-і екзоамілази. Чітко вираженої ендоамілазой є α-амілаза, здатна до розриву внутрішньомолекулярних зв'язків у полімерних ланцюгах субстрату. Глюкоамілаза і β-амілаза є екзоамілазами, тобто ферментами, що атакують субстрат з нередукуючого кінця.
Субстратами для дії амілаз є крохмаль, що складається з амілози і амілопектину, продукти часткового гідролізу крохмалю і глікоген. Крохмаль - рослинний полісахарид з дуже складною будовою. Цей двокомпонентний з'єднання, що складається з 13-30% амілози і 70-85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса (М. м.) коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю. Амілоза - це необертающийся полімер, в якому залишки глюкози Сполучених α-1,4-Глікозидний зв'язком; ступінь полімеризації близько 2000. У «аномальних» амілози з однією-двома α-1,6-зв'язками полімеризація може зрости до 6000. Амілоза практично не має відновлюючої здатності, тому що в кожній молекулі амілози є тільки один вільна альдегідна група [8].
Реакції, що каталізуються амілазами, мають дві стадії: коротку передстаціонарну і тривалу – стаціонарну. Під час першої стадії ендоамілаза швидко зменшує молекулярну масу субстрату, утворюючи суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи[9].
Рисунок 2.1. Механізм дії α-амілази[2]
β-амілаза (β -1,4-глюкан мальтогідролаза, КФ 3.2.1.2) - активний білок, що володіє влатсивостями альбуміну. Каталітичний центр ферменту має сульфгідрильні і карбоксильні групи і імідозольний цикл залишків гістидину. β-Амілаза –екзофермент кінцевої дії, що виявляє спорідненість до передостаннього β -1,4-зв'язку з нередукуючого кінця лінійного ділянки амілози і амілопектину.
На відміну від α-амілази β-амілаза практично не гідролізують нативний крохмаль, тоді як клейстеризований крохмаль гідролізуєтся нею з утворенням мальтози β-конфігурації. Якщо гідролізу піддається амілоза, то гідроліз йде повністю до мальтози. Незначна кількість декстринів може здіснюватися при гідролізі «аномальної» амілози, тому що гідроліз β-амілазою йде тільки по лінійній ланцюга до α -1,6-зв'язків. Якщо субстратом для β-амілази служить амілопектин, то гідроліз йде в значно меншому ступені. β-Амілаза відщеплює фрагмент з нередукуючим кінцем ділянки від зовнішніх лінійних гілок, які мають по 20-26 глюкозних залишків, з утворенням 10-12 молекул мальтози. Гідроліз призупиняється на передостанній α -1,4-зв'язку, що межує з α -1,6-зв'язком. У гідролізаті накопичується 54-58% мальтози, решту становлять високомолекулярні декстрини, що містять значну кількість α -1 ,6-зв'язків – так звані β -декстрини.
β-амілази виявляють більшу стабільність у відсутність іонів Са2+. Молекулярна маса β-амілази рослин досить висока, вона складає від 50000 до 200000. Фермент може складатися з однієї або чотирьох субодиниць до 50 000 кожна. Фермент містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Вважається, що (β-амілазу має високу здатність до нескінченої атаки субстрату. Для амілози середньої молекулярні маси в одному при з'єднанні ферменту до субстрату можливо відчеплення до чотирьох залишків мальтози. При збільшенні молекулярної маси субстрату можлива і більша кількість місць атаки.
Продукт реакції – мальтоза – має β-конфігурацію. Гідроліз іде по лінійному ланцюзі тільки до α-1,6-зв'язків. При гідролізі крохмалю утворюється 54-58% мальтози і 42-46% високомолекулярних декстринів (β-декстринів). β-амілази виявляють більшу стабільність у відсутність іонів Са. Фермент може складатися з однієї або чотирьох субодиниць, містить SH-групи та чутливий до дії важких металів. Властивості β-амілаз залежать від джерел їх виділення. Для отримання мальтози з крохмалю використовують бактеріальні β-амілази[5].
Рисунок 2.2. Принциповий механізм дії β-амілази[2]
Глюкоамілаза (1,4-α-D-глюканглюкогідролаза) широко рас-розлогий в природі. Вона синтезується багатьма мікроорганізмами і утворюється в тканинах тварин. У літературі фермент відомий під різними назвами: амілоглюкозідаза, γ-амілаза, лізосомальних α-глюкозидази, кисла мальтаза, матулаза, екзо-α-1 ,4-глюкозидази. Глюкоамілаза каталізує послідовне відщеплення кінцевих залишків α-D-глюкози з нередуцірующіх решт субстрату. Цей фермент проявляє екзогенний механізм впливу на субстрат. Багато глюкоамілази володіють також здатністю гідролізувати α-1 ,6-глюкозідние зв'язку. Однак це відбувається в тому випадку, коли за α-1 ,6-зв'язком слід α-1 ,4-зв'язок, тому декстран ними не гідролізується. Глюкоамілаза значно швидше гідролізують полімерний субстрат, ніж оліго-і дисахариди. Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди- і моносахаридів.
Майже всі глюкоамілази є глікопротеїдів, що містять від 5 до 35% вуглеводів, які складаються з оліго-, ди-і моносахаридів. Угле ¬ водний компонент може бути цілісним фрагментом або ж розбитими на індивідуальні сполуки, які прикріплюються до білка через треонін і серин. Наприклад, у глюкоамілази A. niger їх 20. Більшість відомих глюкоамілаз має оптимум при рН 4,5-5,2, рідше - при 5,7-6,0, в основному для дріжджових глюкоамілаз[8].
Рисунок 2.3. Принциповий механізм дії глюкоамілаз[2]
Фермент пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогідролаза) раніше був відомий під назвами: R-фермент, гранична декстриназа або амілопектин-6-глюканогідролаза. Пуллуланаза, як і α-амілаза, є ендогенних ферментом, але на відміну від неї здатна невпорядковано гідролізувати α-1 ,6-зв'язку в пуллулані, амілопектину, глікогену та граничних декстрину, одержуваних при спільному впливі на крохмаль і глікоген α-і β - амілаз. Якщо між двома α-1 ,6-зв'язками розташовано більше трьох залишків глюкози, то розрив α-1 ,6-зв'язку йде значно повільніше, тому амілопектин гідролізується пуллуланазой гірше за інших розгалужених полісахаридів. Найбільш частим відщеплює фрагментом є мальтотріоза. Пуллуланази з різних джерел мають різні властивості[7].
Ізоамілаза (глікоген-6-глюканогідролаза), або дебранчінг-фермент, гідроліз α-1 ,6-зв'язку в розгалужених полісахаридів, таких як амілопектин, глікоген, β-граничні декстрини. Відмінною особливістю ізоамілази в порівнянні з пуллуланазой є те, що вона не здатна гідролізувати пуллулан і слабко діє на граничні β-декстрини. Бактеріальна ізоамілаза розщеплює α-1 ,6-зв'язку в глікогенній повністю, а пуллуланаза діє на цей субстрат слабо. Ізоамілазу утворюють багато мікроорганізмів, такі як B. amyloliquefacie, Cytophaga, Streptomyces, Pseudomonas amyloderamosa, Saccharomyces cerevisiae та ін, ферменти яких мають здатність гідролізувати субстрат при рН від 3,5 до 6,5 і температурах від 25 до 53 ° С. Ізоамілаза не стабілізується кальцієм, за винятком ферменту з Cytophaga. Молекулярна маса ізоамілаз коливається від 90 до 120 кДа.
α-глюкозидази (α-D-глюкозідглюкогідролаза) має здатність гідролізувати α-1 ,4-зв'язку від нередуцірующего кінця субстрату з відщеплення залишку глюкози. Фермент проявляє найбільшу спорідненість до низькомолекулярним субстрату, легко гідролізують мальтозу, олігосахариди, а полісахариди гідролізують повільно або зовсім не гідролізують. α-глюкозидази об'єднує групу ферментів і має ряд інших назв: мальтаза, глюкоінвертаза, глюкозідосахараза. Властивості ферментів, які продукуються різними мікроорганізмами, можуть значно відрізнятися. Фермент має здатність до перенесення α-D-глюкозільних залишків на відповідні акцептори, часто з утворенням α-1 ,6-зв'язків[5].
Декстраназа (1,6-α-D-глюкан-6-глюканогідролаза) каталізує розщеплення α-1 ,6-зв'язків у бактеріальному полісахариди декстрану. Серед продуцентів декcтраназ слід зазначити B. subtilis, B. megaterium, Lactobacillus befidus, Streptococcus mutans, Bravibacterium fuscum, Pseudomonas UQM-733, різні грунтові бактерії, а також численні види мікроскопічних грибів роду Penicilium, Aspergillus і Fusarium. Декстранази мають молекулярну масу від 35 до 71 кДа; вони є слабокислими білками. Ізоелектричної точка для всіх грибних декстраназ лежить в діапазоні від 4,0 до 4,6. Для більшості бактеріальних декстраназ оптимальна температура каталітичної дії 35-37 ° С; для грибних продуцентів температура трохи вище - 55-60 ° С. Оптимальне значення рН коливається в залежності від виду продуцента від 4,4 до 7,5. За допомогою ендодекстраназ можна отримувати з декстрану кровозамінники необхідної молекулярної маси; їх також використовують у стоматології для зняття зубних бляшок, що складаються з декстраноподобних глюканов[5].
Рисунок 2.4. принциповий механізм дії декстранази[2]
Амілаза B. Macerans [1,4-α-D-глюкан-4-α-(1,4-α-глюкану) трансфераза (ціклізующая)] Ця унікальна амілаза, яка вперше була знайдена в культурі B. macerans. Вона циклізує частину ланцюга 1,4-α-глюкану шляхом утворення 1,4-α-глюкозідной зв'язку. Робоча назва цього ферменту – циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ-аза). При дії на крохмаль і аналогічні субстрати утворюються циклічні нередукуючі декстрини (декстрини Шардінгера) різних розмірів.
Фермент діє на лінійні полісахариди, гідролізуючи насамперед α-1 ,4-зв'язок, і потім переносить звільнився редукуючий кінець ланцюга на НРК. Фермент також здатний перебудовувати лінійну структуру мальтодекстрин без циклізації, може переносити залишки глюкози і мальтози на олігосахариди, тобто має за певних умов трансферазну активність і здатний ввести реакцію конденсації[7].
Рисунок 2.5. Принципова схема дії ферменту амілази B. Macerans[2]
2.3 Механізм дії амілолітичних ферментів
При вивченні механізму дії амілолітичних ферментів є певні складності, і перш за все вони полягають у тому, що субстрат – крохмаль неоднорідний і має різні характеристики за ступенем полімеризації Глікозидний ланцюга і кількості розгалужень.
Реакції, що каталізується амілазами, мають дві стадії: коротку -передстаціонарну і тривалу - стаціонарну. Під час першої стадії ендоамілаза швидко зменшує молекулярну масу субстрату, утворюючи суміш лінійних та розгалужених олігосахаридів. Другий етап реакції триває, поки продукти гідролізу не перестануть забарвлюватися йодом; він протікає значно повільніше і залежить від індивідуальних властивостей ферменту та його природи. Тому кінцеві продукти гідролізу а-амілазами можуть бути різними. Перша стадія впливу ферменту на субстрат хоча і носить неупорядкований характер, має для всіх видів -амілаз схожий механізм.
Існує дві гіпотези про механізм дії екзоамілаз на субстрат. Перша гіпотеза припускає, що, впливаючи на субстрат по одноланцюжкові або «молніеобразному» механізму, екзоамілаза утворює фермент-субстратний комплекс із захопленням нередукуючого кінця ланцюга.
Подальше просування ферменту з цього ланцюга відбувається до повного її гідролізу. За другою гіпотезою (α- і глюкоамілаза діють на субстрат шляхом механізму множинної атаки, тобто фермент утворює комплекс з молекулою субстрату, потім через кілька етапів цей комплекс розпадається і фермент зв'язується з новою молекулою субстрату. Іншими словами, при множинної атаці відбувається щось середнє між неврегульованим механізмом і одноланцюжкові, «молніеобразной» атакою. Для повного гідролізу з цього механізму одна молекула субстрату повинна утворювати багато разів фермент-субстратні комплекси. При цьому можливий гідроліз декількох зв'язків в одному каталітичному акті.
Механізм впливу амілаз на субстрат може бути розглянуто з не-скількох позицій:
1) вид що розривається зв'язку (α -1,4 або α-1,6);
2) тип впливу на субстрат (ендо- або екзо-);
3) вплив на швидкість гідролізу ступеня полімеризації субстрату;
4) можливість гідролізу олігоcахаридів;
5) здатність ферменту до множинної атаці субстрату.
Наявність ознак амілаз, відображених в 3 і 4 позиції, при дії на лінійні субстрати може свідчити про існування у цих ферментів подцентровой структури. Ймовірно, активний центр амілази може складатися з декількох підцентру, кожен з яких може вступати в контакти з глюкозних залишком. Енергія взаємодії (А;), виражена в одиницях вільної енергії (кДж / моль), визначає подцентровое спорідненість ферменту до субстрату. Це спорідненість індивідуально і може бути як позитивним, так і негативним. Ймовірність існування підцентрових структур амілаз допомагає встановити будову активного центру амілаз, дає чітке пояснення субстратної специфічності, але не дає пояснень механізму гідролізу розгалужений ¬ них субстратів[9,10].
3. ФІРМИ ВИРОБНИКИ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
3.1 Українські виробники
«Ензим», ДП:
Ладижинський завод біо- і ферментних препаратів – є найбільшою біотехнологічним промисловим майданчиком на території України, що здатним випускати до 6000 товарних тонн продукції на рік. На сьогоднішній день виробляє 24 препарати гарантовано високої якості для різних галузей господарства.
Підприємство відрізняє: суворий контроль якості продукції; автоматизація технологічних процесів; наявність сучасного устаткування і кваліфікованих кадрів; індивідуальний підхід до споживача.
Основні види продукції, що випускаються Ладижинським заводом біо- та ферментних препаратів: ферментні препарати для різних галузей промисловості; ферментні препарати для сільського господарства; ферментні комплекси для годівлі сільськогосподарських тварин; пробіотичні препарати; біологічні засоби захисту рослин; препарати для очищення води та грунту; готові лікарські форми і медичні субстанції.
Споживачами продукції Ладижинського заводу біо- та ферментних препаратів «Ензим» є: птахівницькі і тваринницькі господарства; виробники комбікормів і преміксів; зернові господарства, тепличні комбінати; овочівницькі господарства; особисті підсобні господарства; спиртові заводи; виробники соків і вин; легка промисловість; шкіряна промисловість; виробники синтетичних миючих засобів; підприємства нафтовидобувної і нафтопереробної промисловості; екологічні організації; організації охорони здоров'я.
Для птахівництва та тваринництва:
1) ферментні комплекси:
- Ладозім Респект,
- Ладозім Проксі;
2) пробіотичні препарати:
- Пробіол;
3) антигельмінтні засоби:
- нематоциди;
Для сільського господарства:
1) азотофіксатори:
- Біомаг
- Біомаг-соя,
2) біофунгіциди:
- Фітодоктор,
3) біологічний консервант силосу:
- Литос.
Спиртова промисловість, виробництво соків та вин:
1) ферментні препарати:
- Альфалад БТ,
- Альфалад БН,
- Глюколад
- Протолад К,
- Беталад,
- Целлюлад,
- Ксілолад,
- Пектофоетідін.
Хімічна, легка, нафтовидобувна промисловість, екологія:
1) ферментний препарат:
- Лужні протеази
- Протосубтілін ДЗГ (нейтральна протеаза)
- Альфа амілаза,
2) препарат для збільшення нафтовіддачі:
- Ксаладан.
Фармацевтична продукція:
1) імуномодулюючий препарат:
- Ліастен
2) комплексний пробіотичні продукт:
- БіоСім'я
3) пробіотичні засіб:
- біфідумбактерій.
Адреса: 24320, Вінницька обл., Тростянецький р-н, м. Ладижин, вул. Хлібозаводська, 2, тел: (04343) 61056, (04343) 61078, керівник Погрібний Ігор Якович
Альфалад БТ: Рідкий концентрований амілолітичний препарат для низькотемпературної схеми розварювання крохмалевмісної сировини. Препарат гідролізують внутрішні альф -1,4 зв'язки крохмалю, що призводить до швидкого зниження в'язкості сусла, і готує його до дії глюкоамілази. Кінцевими продуктами дії препарату є декстрини різної молекулярної маси і олігосахариди. Оптимальними умовами дії для Альфалада БТ є: рН = 5,5-6,5 і температура 90-95°С. Ефективність препарату зберігається і при рН = 4,0-7,2 і температурі 70-95°С. Альфалад БТ рекомендований для використання на етапі приготування замісу при низькотемпературної схемою розварювання. Подавати його можна в чан замісу або безпосередньо в варильний апарат. Препарат вноситься з розрахунку 0,55-0,65 л на тонну умовного крохмалю. Термін зберігання: 12 місяців при температурі від +5 ° до +15 ° C.
Альфалад БН: Рідкий концентрований амілолітичний препарат для високотемпературної схеми розрідження крохмалевмісної сировини. Оптимальними умовами дії для Альфалада БТ є: рН = 5,0-6,0 і температура 55-62°С. Ефективність препарату зберігається і при рН = 4,5-7,0 і температурі 45-70°С. Препарат вноситься з розрахунку 0,3-0,5 л на тонну умовного крохмалю. Термін зберігання: 12 місяців при температурі від +5 ° до +15 ° C [19].
ВАТ «Восток», Україна, Росія:
У новому столітті використання сучасних технологій, а в тваринництві в першу чергу – біотехнології, стане неодмінною умовою успіху. Біотехнологія сьогодні дозволяє вітчизняному виробнику вирішити таке гостре питання, як підвищення коефіцієнту корисної дії корму для птахів, свиней, великої рогатої худоби при одночасному зниженні втрат його енергії, а отже, зменшення собівартості продукції.
Отримати реальну економічну вигоду дозволяють мультиензимні композиції найбільшого і найдавнішого в Росії виробника мікробіологічної продукції ВАТ «Восток» (колишній Омутнінскій хімічний комбінат). Завод успішно діє на російському та українському ринку вже більше тридцяти років (рівно стільки, скільки існує в нашій країні біотехнологія) і випускає високоефективні добавки біологічного походження до кормів. Це як традиційні ферменти, так і ензимні препарати нового покоління, які знаходять все більш широке застосування в годівлі сільськогосподарських тварин в Росії і в інших країнах.
Що випускаються ВАТ «Восток» мультиензимні препарати (МЕК) - найбільш ефективні і сучасні комплексні ферментні добавки до кормів для тварин та птиці. Мультиензимні композиції (МЕК СХ-1, МЕК СХ-2, МЕК СГ-3) мають спрямовану дію на негативні антипоживні фактори, що містяться в зернових компонентах. При цьому корми засвоюються повністю, а витрачати їх потрібно менше - тут у наявності пряма економічна вигода. ВАТ «Восток» виготовляє МЕК на основі ферментних препаратів власного виробництва, вони розроблені спеціально для умов нашої зернової бази і дозволяють використовувати комбікорми з підвищеним вмістом жита, ячменю, вівса, пшениці та висівок, істотно збільшуючи продуктивність тварин та птиці. Дані вітчизняні біопрепарати за своєю ефективністю не поступаються закордонним аналогам, а з економічної віддачі перевершують. Дані біопрепарати безпечні (на відміну від хімічних), не накопичуються в організмі і не мають побічних ефектів, використовуються в складі комбікормів і преміксів. Вперше в нашій країні мультиензимні композиції багатьох ферментів були створені в НДІ «Біотехнологія». В даний час ефективність і безпека застосування цих препаратів у тваринництві доведені як серйозними науковими дослідженнями, так і досвідом застосування в багатьох птахівницьких і тваринницьких господарствах Росії та України.
Адреса: ТОВ "Восток биотех" ТОВ "Схід Біотех" Наша адреса: Україна, 02096, Київ-096, вул.Ілліча, 4 / 6 (з двору) Тел. / Факс: (38044) 537 21 00
Препарат Амілосубтілін Г3Х: комплексний ферментний препарат, що продукується мікробною культурою Bacillus subtilus. Містить у своєму складі: α-амілазу від 1000 до 1600 од /г, глюкоамінолазу - до 100 од /г, β-глюканазу - до 50 од /г, целюлазу - до30 од /г, ксиланазу - до 10 од /г, нейтральну протеазу до 20 од/м. α-амілаза гідролізує внутрішні α-1,4-глікозидні зв'язки крохмалю (амілози і амілопектину) та продуктів їх послідовного розщеплення. Кінцевими продуктами дії Амілосубтіліну Г3Х на крохмаль є декстрини різної молекулярної маси та олігосахариди. Амілолітична активність (АС), од. / Г 1000 ± 100, 600 ± 60. Гарантійний термін зберігання: 6 місяців з дня виготовлення при температурі (-25) – (25)єС в упаковці заводу-виробника. Упаковка: по 15 кг у герметично запаяні поліетиленові мішки, потім у багатошарові паперові мішки.
Інша продукція: мультиензимні композиції, МЕК СХ-3, Протосубтілін, Целловірідін, експрес-тести на наявність мікотоксинів, біопрепарати, азотобактера, бактеріальна силосна закваска [20].
ВАТ «Вітаміни», Україна
ВАТ "Вітаміни" – фармацевтичне підприємство з виготовлення готових лікарських засобів, що займає на фармацевтичному ринку України позиції лідера з виробництва ферментних препаратів. Діяльність спрямована на створення та виробництво ефективних, безпечних і якісних лікарських препаратів, що відповідають рівню і потребам сучасної медицини.
Історія: завод був заснований в лютому 1953 р. як один з перших в Радянському Союзі підприємств з виробництва вітамінів. Початок діяльності підприємства пов'язане з освоєнням нових для країни промислових технологій: виробництва нікотинової кислоти і нікотинаміду, ментолу рацемічного, DL-кальцію пантотенату, Д (+) кальцію пантотенату. Колектив заводу нараховував 67 чоловік. Їм треба було освоїти технологію таблетування вітаміну "С". У липні 195З р. були випущені перші тонни вітаміну "С" з глюкозою. Перший рік ознаменувався випуском 50 тонн таблеток, які були направлені в Україну, РРФСР, Грузію, Естонію, Узбекистан. Обсяги виробництва швидко нарощувалися і досягли до 1954 143 тонн. У 1955 році колектив заводу вперше в СРСР почав промисловий випуск нікотинової кислоти. До 1960 року було освоєно виробництво таблеток вітаміну "С" з глюкозою, нікотинової кислоти, вітаміну "С" для вітамінізації їжі. Частина цієї продукції експортувалася в НДР, Угорщину, В'єтнам. Асортимент продукції постійно розширювався і в 1963 році на заводі було вироблено 83 кг рідкого ментолу, а до 1965 року його обсяги збільшилися в 6 разів. Першість у виробництві пантотенату кальцію (вітаміну "Вз") також належить нашому заводу. Перша партія цього вітаміну отримана в 1964 році. Завод розширювався. До 1968 року на повну потужність працювали цехи: нікотинової кислоти і нікотіноміда, пантотенату кальцію, ментолу, ремонтно-механічний цех і прирейкових база. Виготовлені перші партії оптично активного (медичного) пантотенату кальцію, який до цього випускався тільки в Японії і США. Напередодні 1972 було прийнято в експлуатацію будівлю цеху ГЛП (готових лікарських препаратів), де почався випуск полівітамінних препаратів у формі таблеток і драже. Всього в той період випускалося 17 найменувань лікарських засобів. У 1994 році відповідно до Указу Президента України "Про корпоратизацію" на базі вітамінного заводу створено відкрите акціонерне товариство "Вітаміни".
Сьогодні ВАТ "Вітаміни" – добре відоме всім операторам фармацевтичного ринку стабільне і фінансово незалежне підприємство, впевнено входить до десятки провідних виробників лікарських засобів України. Завдяки традиціям і досвіду, накопиченим колективом за п'ять десятків років, а також новітнім технологіям виробництва, кількість що випускаються найменувань продукції постійно збільшується і становить сьогодні 48 препаратів 15-ти фармакологічних груп. Виробництво здійснюється на обладнанні італійських фірм "Pellegrini", "Neri", "Alfa", "BFB", "Marchesini", "Carmatic". Пріоритетними напрямками діяльності підприємства є розширення виробництва препаратів для лікування ендокринної системи та органів травлення, антибіотиків і вітамінів. Постачання сировини здійснює 100 вітчизняних і зарубіжних компаній. Для розширення номенклатури лікарських засобів та більш повного забезпечення населення високоякісними препаратами ВАТ "Вітаміни" тісно співпрацює з такими всесвітньо відомими компаніями, як Amano Enzyme Inc. (Японія), TEVA Pharmaceuticals Inc. (Ізраїль) та ін
Число постійних покупців продукції складає більше ніж 200 фармацевтичних фірм України та зарубіжжя. За останні роки компанія помітно розширила власні ринки збуту і успішно працює на фармацевтичних ринках Росії, Білорусі, Молдови, Казахстану, Латвії, Тукрменістана. Сьогодні експортує більше 16% реалізованої продукції.
Одночасно з розширенням виробництва компанія постійно працює над підвищенням якості виробництва лікарських засобів. ВАТ "Вітаміни" впроваджує в життя нові підходи до забезпечення якості, що відповідають світовим стандартам GMР, ISO 9001 та ISO 14001. Основна мета – створення фармацевтичного підприємства європейського рівня з урахуванням інтересів споживачів, працівників і акціонерів. В даний час триває реконструкція і технічне переоснащення діючих виробництв відповідно до вимог виробничої практики GMР, оснащення контрольних і дослідних лабораторій сучасним обладнанням, удосконалюється інтегрована система менеджменту.
Продукція: препарати, що сприяють травленню, препарати для лікування захворювань серцево-судинної системи, антибактеріальні засоби, протигрибкові засоби, препарати, що діють на центральну нервову систему, анальгетики та антиревматичні препарати, антиастматичні і протиалергічні препарати, антианемічні препарати, вітаміни, муколітичні засоби, засоби для лікування ран і виразкових уражень.
Адреса: 20300 Україна, м. Умань, ул.Ленінской Іскри, 31, Тел: (04744) 3-63-22, E-mail: [email protected]
Препарат Сомілаза: таблетки, вкриті оболонкою, кишковорозчинні, 1 таблетка містить ферменти мікробного походження: ліпази - 60000 ЛЕ; амілази - 1500 АЕ
Дія: препарат поповнює дефіцит ферментів підшлункової залози. Ферменти, що входять до складу препарату - ліпаза і амілаза - гідролізують відповідно рослинні та тваринні жири (до гліцерину і жирних кислот), крохмалю (до декстринів і моноцукри), сприяючи більш повному всмоктуванню харчових речовин у тонкому кишечнику. При прийомі препарату нормалізується процес травлення, поліпшується функціональний стан травного тракту.
Показання до застосування: екзокринної недостатність підшлункової залози при хронічному панкреатиті; диспептичні явища, обумовлені ахілії, резекцією або опроміненням шлунка і тонкого кишечника, функціональними порушеннями моторики кишечнику, дискінезією жовчних протоків, вживанням труднопереваріваемой жирної або незвичної їжі; метеоризм; підготовка до рентгенологічного та сонографічного дослідженню органів черевної порожнини.
Протипоказання: гострий панкреатит, хронічний панкреатит у фазі загострення. Гіперчутливість.
Спосіб застосування та дози: внутрішньо, під час їжі або безпосередньо після їжі; по 1-2 таблетки 3 рази на добу. Таблетку ковтають цілими, не розжовуючи, запиваючи невеликою кількістю рідини. Тривалість прийому визначається тяжкістю захворювання і може варіювати від декількох днів до декількох місяців і більше (при необхідності постійної замісної терапії).
Побічна дія: в окремих випадках - алергічні реакції.
Упаковка: по 10 таблеток у контурній чарунковій упаковці, по 2 контурних упаковки в пачку [21].
ЗАТ «Технолог», Україна:
Закрите акціонерне товариство «Технолог» можна назвати ровесником українського фармацевтичного ринку. Підприємство було засновано в 1991 році в м. Умань. Завод починався з ідеї заповнити нішу якісних генеричних препаратів на фармацевтичному ринку. Роки розвитку підприємства характеризуються перш за все високою динамікою. Якщо на початку своєї діяльності «Технолог» – це орендовані виробничі потужності і 10 ентузіастів, об'єднаних спільною ідеєю, то сьогоднішній «Технолог» – фармацевтична компанія, що володіє власним значним потенціалом: у 2006 році побудований з "нуля" і зданий в експлуатацію цех з виробництва готових лікарських засобів твердих форм, адміністративна будівля з лабораторіями ВТК, закінчується будівництво ділянки з виробництва рідких лікарських форм та дільниці по виробництву драже. Впускаємо Асортимент продукції нараховує більше 60 препаратів різних фармацевтичних груп.
Виробничою програмою охоплено виготовлення:
-Твердих лікарських форм для внутрішнього споживання у вигляді таблеток і капсул;
- Моно-і полівітамінних драже;
- Масляних розчинів;
- Сиропів;
- Крем-шампунів.
ЗАТ "Технолог" поставляє свою продукцію 15 оптовим покупцям в різних містах нашої країни і за кордоном. Обсяги виробництва постійно зростають, розширюється ринок збуту. Компанія постачає свою продукцію в Білорусь, Казахстан, Туркменістан, Росію, Молдову, Грузію, Узбекистан, Вірменію, Туркменістан. У перспективі - Азербайджан, Киргизстан. На підприємстві впроваджуються у виробництво нові лікарські засоби. У 2006 році зареєстровано Кораргін, Ранитидин, Печаевскій валідол - новий без цукру, Омікс. У 2007 році - Солізім форте, ортофен форте. В даний час реєструється Печаевскій Валідол-натур, Струкнотін, Карбоцістеін. Сьогодні ми ставимо перед собою реальні і досяжні цілі. Перш за все, виробнича база ЗАТ «Технолог» буде приведена у відповідність до стандартів GMP. Планується освоєння нових, актуальних для ринку, лікарських засобів. Рух уперед стосовно до нашого підприємства передбачає гармонійний розвиток всіх його підрозділів: виробництва, продажу і звичайно ж контролю якості.
Продукція: анальгетики та антипіретики, антианемічні кошти, фолієва кислота, антибактеріальні засоби, антидіабетичні засоби, біологічно активні добавки (БАДи), вітамінні засоби, протизапальні та протиревматичні засоби, Противиразкові засоби, засоби, що впливають на серцево-судинну систему, ферментні засоби (Креазім 10000 і Креазім 20000, Панкреазім, Панкреатин 8000, Солізім Форте).
Адреса: вул. Мануїльського, 8, м. Умань, Черкаська обл., Україна, 20300
Панкреатин 8000: 1 таблетка містить панкреатину - 0,24 г з мінімальною ферментної активністю: ліпази - 8000 МО FIP; амілази - 5600 МО FIP; протеази - 370 МО FIP; допоміжні речовини: натрію хлорид, аеросил, целюлоза мікрокристалічна, коллідон ЦЛ, натрію кроскармелоза, коллідон 25, магнію стеарат, коллікоат МАЕ 30 ДП, пропіленгліколь, тальк, титану діоксид, кислотний червоний 2 С.
Фармакологічні властивості: що входять до складу препарату панкреатичні ферменти (ліпаза, амілази і протеази) полегшують перетравлення жирів, вуглеводів і білків, що сприяє їх повному всмоктуванню в тонкому кишечнику. При захворюваннях підшлункової залози препарат компенсує недостатність її зовнішньосекреторної функції і сприяє поліпшенню процесу травлення. Таблетки мають захисну оболонку, нерозчинну в кислому середовищі шлунка, яка охороняє травні ферменти від руйнування під дією рН шлункового соку.
Показання: недостатність зовнішньосекреторної функції підшлункової залози (хронічний панкреатит, муковісцітоз). Хронічні запально-дистрофічні захворювання шлунка, кишечнику, печінки, жовчного міхура, стан після резекції або опромінення цих органів, що супроводжується порушеннями перетравлення їжі, метеоризмом, діареєю (у складі комбінованої терапії). Для поліпшення перетравлювання їжі у пацієнтів з нормальною функцією шлунково-кишкового тракту у разі погрішностей в харчуванні, а також при порушеннях жувальної функції. Підготовка до рентгенологічного та ультразвукового дослідження органів черевної порожнини.
Протипоказання: підвищена чутливість до компонентів препарату.
Спосіб застосування та дози: доза підбирається індивідуально, залежно від ступеня недостатності функції підшлункової залози. Зазвичай препарат призначають дорослим у дозі 1 - 4 таблетки (що відповідає 8 000 - 32 000 ОД FIP по ліпазі) при кожному прийомі їжі. Призначають таблетки внутрішньо перед або під час їжі, не розжовуючи, запиваючи великою кількістю рідини, бажано не лужної: вода, фруктові соки. Добова доза для дорослих становить 48 000 - 150 000 ОД FIP (6 - 18 таблеток). При повній недостатності зовнішньосекреторної функції підшлункової залози (наприклад, кістозного фіброзу) доза повинна бути збільшена до 400 000 ОД FIP на добу, що відповідає добовій потребі дорослої людини в ліпазі.
Побічні ефекти: препарат звичайно добре переноситься, але можуть виникнути реакції підвищеної чутливості. При тривалому застосуванні високих доз препарату можливий розвиток гіперурикозурії [22].
3.2 Закордонні виробники
«Novo Nordisk», Данія:
Novo Nordisk є компанією, що займається охороною здоров'я і явлдяється світовим лідером в галузі лікування діабету. Крім того, компанія Ново Нордіск займає провідну позицію в таких областях, як управління гемостазу, лікування гормоном росту, ферментними препаратами і гормональної терапії.
Novo Nordisk "виробляє і продає фармацевтичні продукти та послуги, що забезпечують значну різницю для пацієнтів, медичних працівників та суспільства. У штаб-квартирою в Данії," Ново Нордіск "працює понад 29000 співробітників у 81 країнах і продає свої продукти в 179 країнах.
Акції Novo Nordisk котируються на фондових біржах у Копенгагені і Лондоні. Її АДР котируються на Нью-йоркській фондовій біржі під символом "НВО".
Адреса:
Corporate Headquarters
Novo Nordisk A / S
Novo Allй
2880 Bagsvжrd
DENMARK
Tel: +45 4444 8888
Fax: +45 4449 0555
«Genom Biotech», Індія:
Genom починали з малого, але домігся більш ніж 100% зростання щороку & стала одним з провідних гравців серед індійських фармацевтичних експортних компаній в СНД, з річним оборотом у 14 мільйонів доларів США. Компанія має широкий спектр продуктів, таких як ін'єкції, таблетки, капсули, рідини та мазі, які обслуговують різні захворювання, такі як серцево-судинні, неврологічні і шлунково-кишкові, що охоплюють всі основні терапевтичні сегменти
Препарат Ензімтал: серед розмаїття ферментних препаратів, що пропонуються цією компанією, можна виділити ензимної препарат Ензімтал, який не містить тварин ферментів. Ферментні препарати з аналогічною комбінацією діючих речовин на ринку України відсутні, оскільки поряд з травними ферментами до складу Ензімтала входять активні речовини, що сприяють усуненню метеоризму і абдомінального дискомфорту. Переваги ферментного препарату Ензімтал:
- Основу препарату складають ферменти нетваринного походження;
-Завдяки комбінації двох ферментів (грибкової амілази і папаїну) досягається більш повний вплив на процеси травлення;
-Ферменти не роблять пептичної впливу на тканини слизової оболонки шлунково-кишкового тракту, тому препарат можуть приймати пацієнти з ерозивно-виразкові ураження або запальними захворюваннями шлунково-кишкового тракту;
- Препарат можна застосовувати в педіатричній практиці;
- Нормалізує процеси всмоктування вітамінів і мікроелементів;
- містить ефективний засіб для усунення метеоризму - симетикон.
Склад:
Амілаза грибкова (1:1200) 50 мг
Папаїн 30 мг
Вугілля активоване 75 мг
Симетикон 50 мг
Нікотинаміду 25 мг
Дія і фармакологічні властивості компонентів Ензімтала:
Амілаза – амілолітичний фермент, який отримують із грибів Aspergillus oryzae і непатогенних бактеріальних культур Bacillus subtilis. Сприяє засвоєнню їжі, багатої вуглеводами, проявляє специфічну активність у процесі перетворення крохмалю в декстрозу, мальтозу. Папаїн - очищена протеолітична субстанція, що отримується з молочного соку динного дерева (папайї) - Carica papaya. Має широкий спектр протеолітичної активності, в тому числі стосовно гідролізу білків. Максимальну активність фермент проявляє в інтервалі рН 5,0-8,0. Симетикон - кремнійорганічного з'єднання, що відноситься до групи піногасники. Зменшує метеоризм шляхом зниження поверхневого натягу пухирців газу, сприяючи їх об'єднання, що призводить до ослаблення болю в області живота і усунення нудоти. Активоване вугілля забезпечує адсорбцію газів та токсинів, що утворюються при розладах травлення. Нікотинамід - коферментних форма нікотинової кислоти (вітаміну РР) бере участь в окисно-відновних процесах. Сприяє нормалізації мікрофлори кишечнику, стимулює продукцію соляної кислоти при гіпоацидному гастриті.
Основні показання до призначення препарату:
• порушення процесів перетравлення білків, вуглеводів та жирів;
• здуття живота, абдомінальний дискомфорт, печія, відрижка;
• метеоризм.
Ензімтал приймають внутрішньо по 1-2 драже під час їжі. Драже слід ковтати не розжовуючи, запиваючи водою. При необхідності доза, тривалість прийому і кількість курсів лікування визначаються лікарем індивідуально. Препарат протипоказаний при підвищеній чутливості до будь-якого з його компонентів. Ензімтал завдяки комбінації що входять до його складу ферментів не подразнює слизову оболонку травного тракту. Крім того, Ензімтал не містить таких речовин, як соляна кислота або компоненти жовчі, тому його можна використовувати при розладах травлення у осіб з гастритом, гепатитом або жовчнокам'яної хворобою. Препарат можна призначати як дорослим, так і дітям. Ензімтал не всмоктується в кишечнику, не проникає через гематоенцефалічний і гематоплацентарний бар'єр, що дозволяє застосовувати його для нормалізації процесу травлення в період вагітності або годування груддю. З огляду на особливості терапевтичної дії препарату, а також велику кількість хворих з порушенням процесів травлення і всмоктування, можна припустити, що препарат Ензімтал буде користуватися великим попитом в Україні.
Препарат Пепзим: численна група ферментних препаратів, зареєстрованих в Україні, поповнилася препаратом Пепзим. Він відрізняється оригінальним складом, особливою комбінацією компонентів, які визначають "власне обличчя" Пепзиму і логічно поміщають його у відповідну "фармакологічну нішу". Важливо, що всі компоненти Пепзиму а мають рослинне або фунгальне походження. Основними компонентами є папаїн і фунгальна діастаза, власне ферменти. Доведено, що рослинні і фунгальні ферменти більш стійкі в кислому середовищі, ніж тварини, більш резистентні до інгібіторів тварин панкреатичних ферментів, а також мають більш широкий спектр субстратної специфічності. Папаїн - протеолітичний фермент із соку недозрілих плодів папаї (Carica papaya). Папаїн проявляє як кислотні, так і основні властивості; він гідролізують білки, аміди й ефіри, особливо у зв'язках лейцину і гліцину. Максимальну активність папаїн проявляє при pH 5-8. Важливо, що папаїн не тільки сам має протеолітичну активність, але ще потенціює дію інших протеаз. Фунгальная діастаза - амілолітичні фермент, гідроліз крохмаль, глікоген (полісахариди) на мальтозу, мальтріозу (дисахариди). Папаїн і діастаза розщеплюють білки і вуглеводи до молекул, які готові для всмоктування.
Родзинкою Пепзиму є наявність у його складі рослинних ефірних масел - кориці, кардамону і кмину. Оскільки подібні компоненти введені до складу ферментного препарату вперше, охарактеризуємо їх докладніше. Область зростання - Індія, Танзанія, Шрі-Ланка, Центральна Америка. Широкий спектр ефектів ефірної олії кмину визначає його терапевтичні можливості і доцільність комбінування з іншими ефірними маслами (наприклад, кориці і кардамона), що й здійснено фармацевтичною компанією "Дженом Біотек ПВТ ЛТД" (Індія) в препараті Пепзим. Особливість складу Пепзиму – в комбінації ферментів з невисокою (в порівнянні з тваринами) активністю та ефірних олій, що стимулюють секреторну і моторну функції органів травлення (збуджують апетит, посилюють шлункову секрецію і жовчоутворення, моторику тонкої і товстої кишок). Загалом, Пепзим забезпечує як мобілізацію власних можливостей травної системи, так і сам "допомагає" гідролізувати білки і вуглеводи їжі. Такий склад препарату доцільний з наступних позицій. Хоча Пепзим не може бути призначений для замісної терапії через відсутність ліполітичних ферменту і невисокої активності протеолітичної і амілолітичні ферментів, його доцільно застосовувати в реабілітаційному періоді після перенесеного гострого панкреатиту або купуювання атаки хронічного рецидивуючого панкреатиту (ГРП). На висоті панкреатиту, гіперферментемії основним принципом лікування є створення "функціонального спокою" підшлунковій залозі, і призначення жовчогінних препаратів, що стимулюють секрецію панкреатичну, в цей час протипоказано. Після зменшення болю, нормалізації показників панкреатичних ферментів в крові призначення Пепзиму стає за доцільне для "допомоги" підшлунковій залозі з метою оптимізації відновлення її функції і компенсації мальдигестии.
Важлива також форма випуску Пепзиму – сироп з приємним смаком і запахом. Це забезпечує зручність прийому для дітей, пацієнтів з порушеннями ковтання твердих інгредієнтів, спінальних та інших хворих, змушених тривалий час знаходиться в ліжку (вони нерідко мають потребу в ферментних препаратах через метеоризму на фоні кишкової гіпомоторики). Нарешті, рідка форма полегшує введення Пепзиму через зонд хворим, що знаходяться у важкому стані або на ентеральному живленні (наприклад, при гострому панкреатиті), забезпечує швидкість його дії. Приємний смак має деякий психотерапевтичний значення, настільки важливе для багатьох гастроентерологічних хворих. Пепзім вже не сприймається ними як "хімія", особливо після пояснення лікаря про природне походження компонентів препарату.
Пепзим показаний при хронічних гастритах зі зниженою кислотоутворюючою функцією шлунка, тому що ефірні олії стимулюють шлункову секрецію. У той же час, ферменти Пепзіма беруть участь у компенсації нестачі хлористоводневої кислоти і пепсину. Пепзім показаний при колітах і ентеритах з мальабсорбцією. Недорасщепленние нутрієнти є живильним середовищем для мікрофлори і сприяють розвитку дисбіозу. Ферментні препарати, сприяючи гідролізу накопичуються продуктів, полегшують всмоктування і зменшують прояви ентериту (діарея, метеоризм). Слід зазначити, що при всіх перерахованих вище захворюваннях Пепзім є не головним, а допоміжним засобом. Його слід призначати в комплексі з основними для кожного захворювання препаратами. При цьому Пепзім сприятиме зменшенню вираженості симптомів і, перш за все, диспептичних явищ. Основні показання для Пепзіма - диспепсія, здуття живота, тяжкість у шлунку, порушення стільця при переїданні. Абсолютних протипоказань для лікування Пепзімом немає, його можна комбінувати з іншими препаратами без порушення їх ефективності. І все ж слід враховувати, що ферментні препарати недоцільні при гострому панкреатиті і вираженому загостренні ХРП. Ефірна олія кориці протипоказано при вагітності, проведення хіміотерапії пухлин [11].
Компанія «Novozymes», Данія:
Ця компанія вважається неперевершеним лідером в області отримання ферментів для виробництва етилового спирту, пива, хліба. Інноваційні ферментні препарати компанії «Novozymes» забезпечують скорочення витрат і збільшення ефективності підприємства. Співпрацюючи з компанією «Novozymes» і його дистриб'ютором компанією ТОО «Еліта Трейд» за напрямком спирту і пива, можна отримати багато переваг від комбінованих ресурсів технічного сервісу і нових технологій.
Контакти: ТОО «Еліта-Трейд», Адреса: м. Алмати 050060, Пр. Аль-Фарабі 95, 2 під, 12 пов., Офіс 42, Тел / факс: 269-48-12, Тел: 269-48-17, 269-48-19, E-mail: [email protected]
Амілолітичні ферментні препарати фірми «Novozymes» представлені:
Фунгаміл: це препарат α-амілази грибного походження, який продукується штамом Aspergillus oryzae. Фунгаміл гідролізують 1,4 а-глюкозідние зв'язку амілози і амілопектину крохмалю з утворенням мальтози і декстринів. Це сприяє підвищенню газоутворюючих здатності борошна, інтенсифікації процесу бродіння тіста при виробництві хліба.
Фунгаміл Супер: ферментний препарат α-амілази і ксіланази, гідроліз α-1 ,4-глюкозідние зв'язку в амілози і амілопектину, одночасно модифікує некрохмальние полісахариди борошна, утворюючи мальтозу, декстрини і покращуючи еластичність клейковини.
Ферментний препарат АМГ: це глюкоамілаза грибного походження, що продукується Aspergillus niger. Він гідролізують 1,4 - і 1,6-α-глюкозідние зв'язку в амілози і амілопектину з утворенням глюкози і декстринів. Внесення цього ферменту в борошно сприяє поліпшенню газоутворюючих здатності борошна. Внаслідок збільшення вмісту цукрів під дією амілолітичні ферментів, підвищується цукрово-і газоутворюючих здатність борошна, збільшується об'єм хліба, поліпшується структура пористості.
Термаміл СЦ ДС: це вдосконалений розріджуючі ферментний препарат, який в порівнянні зі звичайними термостабільним альфа-амілазами може діяти при більш низькому рівні рН, також він незалежний від вмісту іонів кальцію в розчині, що дає ряд технологічних переваг і веде до зменшення поточних витрат. Застосовується при температурах 65-950С та рівень рН 5,0-7,5. Термаміл СЦ ДС має подвоєну активність в порівнянні з Термаміл СЦ. Термаміл СЦ ДС зберігає частину своєї активності навіть при 105-1100С. Дозування препарату звичайно становить 0,2-0,35 л / т крохмалю (0,24-0,42 кг / т крохмалю). БАН-480Л - ендоамілаза, які гідролізують альфа-1 ,4-глюкозідние зв'язку в амілози і амілопектину, що призводить до швидкого падіння в'язкості і розрідження крохмалю. Продуктами розпаду є декстрини з різною довжиною ланцюга і олігосахариди. Застосовується при температурах 55-90 є С і рН 5,0-7,0. Дозування ферментного препарату становить 0,15-0,45 л / т крохмалю (0,18-0,54 кг / т крохмалю).
Фунгаміл 800л: це грибна альфа-амілази. Фермент гідролізують альфа-1 ,4-глюкозідние зв'язку в амілози і амілопектину з утворенням великих кількостей мальтодекстрин. Застосовується при температурах 50-60 є С і рН 4,0-6,0. Дозування препарату становить 0,10-0,20 л / т крохмалю (0,13-0,25 кг / т крохмалю).
Сан Супер 360 Л: поліпшений комплексний ферментний препарат, що містить головним чином амілоглюкозідазу, альфа-амілазу, протеазу і глюканазу, що забезпечують максимальний гідролітичні ефект і найбільш гнучке ведення процесів дрожжегенераціі і бродіння зернового сусла за рахунок сталого синергетичного ефекту. Протеолітична активність гідролізують білки в продукти, легко ассіміліруемие дріжджами. Сан Супер 360 Л проявляє достатню активність при температурах 30-65 є С і рівні рН 4,0-6,0. Дозування препарату звичайно становить 0,60-0,75 л / т крохмалю (0,72-0,90 кг / т крохмалю).
Сан Екстра Л: комплексний ферментний препарат. Основний компонент Сан Екстра Л - амілоглюкозідаза-гідроліз, як альфа-1 ,4-зв'язку, так і альфа-1 ,6-зв'язку в клейстерізованном крохмалі, також він містить кислотостійкою альфа-амілазу. Препарат проявляє активність в температурному діапазоні 30-700С та рівень рН 3,0-6,0. Дозування препарату звичайно становить 0,43-0,6 л / т крохмалю (0,5-0,7 кг / т крохмалю) [12,14].
3.3 Російські виробники
ТОВ ВО «Сиббиофарм»
- Виробниче Об'єднання «СИББИОФАРМ» – провідне підприємство Росії, що має 45-річний досвід виробництва мікробіологічної продукції.
- ТОВ ВО «Сиббиофарм» – сучасна біотехнологічна компанія, що відповідає вимогам ринку і споживачів:
- Здійснює виробництво продукції за технологіями, що забезпечує асептичні умови культивування мікроорганізмів і підтримання параметрів в автоматичному режимі.
- Проводить модернізацію виробничих потужностей. Обсяг інвестицій близько 10 млн. доларів в 2006 - 2007 роках
- Впроваджує сучасні системи контролю якості продукції
- Проводить навчання персоналу в Росії, США, Німеччини, Швейцарії
- Співпрацює з провідними науково-дослідними та освітніми центрами в Росії і за кордоном
- Надає консультації господарствам з оптимізації раціонів годівлі, використання сучасних ферментних препаратів, кормових антибіотиків та іншої продукції підприємства.
Одним з досягнень компанії є розвиток в галузі спиртової промисловості. Виробничим об'єднанням «Сиббиофарм» була розроблена «Програма застосування ферментних препаратів у виробництві спирту» спільно з Всеросійським НДІ харчової біотехнології (Москва) з урахуванням результатів багаторічного успішного застосування ферментних препаратів ВО «Сіббіофарм» у виробництві спирту.
Бактеріальні ферментні препарати
1. АмілоЛюкс-А
2. Альфа-амілаза LTAA
3. Альфа-амілаза термостабільна HTAA
4. Амілосубтілін Г3х
Для розрідження крохмалю застосовуються амілолітичні препарати, що містять альфа-амілазу: альфа-амілаза гідролізують внутрішні альфа-1 ,4-Глікозидний зв'язку крохмалю, приводячи до швидкого зниження в'язкості клейстерізованних розчинів крохмалю, тим самим забезпечуючи підготовку сусла до дії глюкоамілази. Кінцевими продуктами дії бактеріальної альфа-амілази на крохмаль є низькомолекулярні розчинні декстрини з невеликим змістом моно-і дисахаридів (глюкози і мальтози). Виходячи з характеру дії, альфа-амілазу називають ще ендогенної, або декстріногенной амілазою.
Характеристика препаратів: АмілоЛюкс-А і Альфа-амілази (LTAA і HTAA) рідини від бежевого до коричневого кольору.
Амілосубтілін Г3х – порошок від світло-бежевого до світло-коричневого кольору.
Застосування комплексу ферментних препаратів дозволяє:
- підвищити ефективність використання сировини за рахунок більш глибокого гідролізу
- скоротити тривалість бродіння на 10-20 годин
- стабілізувати технологічний процес
- збільшити вихід спирту на 1-4%
- підвищити якість готової продукції
- забезпечити безпечну експлуатацію обладнання
- підвищити культуру виробництва.
Переваги ферментних препаратів:
- Адаптовано до гідролізу вітчизняного зернового сировини
- Використовуються при будь-якій схемі підготовки сусла
- Це дозволяє впроваджувати технології виробництва на підвищених концентраціях сусла (до 24 ° Б)
- Чи не інгібують один одного і можуть використовуватися спільно
- Це дозволяє переробляти такі проблемні види зерна, як жито та ячмінь
- Продовжують працювати в процесі бродіння і проводять догідроліз сусла до повної відсутності забарвлення в йодної пробі
- Дають глубокоосахаренное сусло - 79-86% моносахаридів
- Містять у своєму складі біологічно активні речовини, необхідні для росту дріжджів, і іони кальцію - ефективні стабілізатори та активатори ферментів на стадії застосування
- Не поступаються імпортним препаратам по набору ферментів, тривалості і глибині гідролізу
- Чи мають конкурентні ціни.
Таблиця 3.1. Склад препаратів ТОВ ВО «Сіббіофарм»
| | Амілосубтілін Г3х | АмілоЛюкс-А | α-амілаза LTAA | α-амілаза HTAA |
| α-амілаза | 1500 | 1500 | 1500 | 1000 |
| Ксиланаза | до 100 | до 1000 | до 100 | до 200 |
| β-глюканаза | до 500 | до 500 | до 70 | до 50 |
| Целюлаза | до 30 | до 50 | до 40 | до 40 |
| Глюкоамілаза | до 100 | до 150 | до 100 | до 200 |
| Протеаза | до 15 | до 20 | до 15 | до 15 |
Адреса:
Росія 633004 м. Бердськ, Новосибірської області, вул. Хімзаводская, 11.
Телефон / факс: приймальня +7 (38341) 5-80-00, 5-80-23, відділ збуту: +7 (38341) 2-96-17 E-mail: [email protected] www.sibbio.ru
Компанія ТОВ «РУСФЕРМЕНТ»
Основною традиційною діяльністю компанії ТОВ «РУСФЕРМЕНТ» залишається реалізація ферментних препаратів широкого спектру дії для спиртової, пивоварної та виноробної галузей харчової промисловості. Фахівці компанії широко використовують практичний досвід застосування ферментних препаратів, накопичений нею за двадцятирічний термін роботи на світовому ринку. У своїй роботі компанія використовує всі останні досягнення науки і техніки в галузі промислової ензимології та біотехнології, підключаючи для цього спеціалістів Європи, США, Мексики, Росії.
Адреса: 17437, м. Москва, ул.Профсоюзная, 104, Телефон / факс: (495) 276-03-25
Препарати α-амілази:
Лікваміл1200 - бактеріальна мезофільні aльфа-амілаза, спеціально розроблена для схем, переробних крохмалисті сировину під тиском. Використовується для розрідження і декстрінізаціі крохмалю.
Амілаза НТ 4000 G - грибна aльфа-амілаза. Використовується на схемах з рециркуляцією барди; при низьких рН змусив або рН технологічної води нижче 5,0.
Амілаза НТ 4000 N - бактеріальна aльфа-амілаза. Використовується на різних схемах переробки крохмалистою сировини під тиском для оцукрювання зернового крохмалю.
Амілаза НТ 4000 - бактеріальна aльфа-амілаза. Використовується для розрідження крохмалю на "м'яких" схемах переробки зерна.
Зімаджунт НТ-340С + - бактеріальна aльфа-амілаза. Використовується для розрідження крохмалю на "м'яких" схемах або періодичних схемах (Разварнік Генце).
Препарати глюкоамілази:
Глюкоза Л-400С+ – грибна глюкоамілаза. Унікальність препарату - у високій реакційної здатності впливу на частково розщеплений крохмаль. Незаперечно його перевага перед іншими препаратами на етапах дрожжегенераціі і бродінні. При мінімальному витраті ферменту відбувається глибоке доосахаріваніе сусла, що дуже важливо для розвитку та розмноження дріжджової клітини.
Глюкоза Н – це харчова глюкоамілаза, отримана шляхом глибинного культвірованія штаму-продуцента Aspergillus niger. Препарат містить комплекс амілолітичні ферментів, що каталізують розщеплення крохмалю і декстринів до глюкози: α-амілазу, глюкоамілазу і пуллуланазу.
Конверзім АМГ 300 – грибна глюкоамілаза. Маючи в своєму комплексі α-амілазу, препарат добре працює з зерновим суслом, що містить недостатньо прогідролізувати крохмаль.
Конверзім АМГ 300 N – препарат грибний термостабільної глюкоамілази, здатний осахарівать напівпродукти крохмалю при підвищеній температурі, володіє аналогічними властивостями по відношенню до крохмалю з препаратом Конверзім АМГ 300. Свою максимальну активність препарат виявляє при 70 є С.
Лікваміл 1200 – препарат сертифікований Міністерством Охорони здоров'я РФ. Лікваміл 1200 отримують шляхом глибинного культивування штаму бактерій Bacillus subtilis origin. Зовнішній вигляд - прозора рідина від бурштинового до світло-коричневого кольору. Ферментна активність (ГОСТ 20264.4-89) не менше 2500 од. АС/см3. Робочий діапазон рН 5.5 - 8.0. Робоча область температур 60 - 70 є С.
Область застосування: Лікваміл 1200 допущений до використання на території Російської Федерації, що підтверджується гігієнічним висновком, виданим Департаментом Державного санітарно-епідеміологічного нагляду. На кожну партію надається лист безпеки з вказівками щодо використання даного продукту.
Термін зберігання: при зберіганні в сухому прохолодному місці (температура нижче 25 оС), у добре закритому контейнері втрата активності за 12 місяців гарантовано не перевищить 10% [17].
ТОВ Науково-виробнича фірма «Дослідницький центр»:
Фірма створена 6-го вересня 1993 року. Основна сфера діяльності фірми - наукові дослідження в різних галузях знань і виробництво продукції на основі власних патентів на винаходи. Фірма пропонує продукцію, виготовлену на основі пробіотичних мікроорганізмів:
- Біологічно активні речовини для людини (Ветом 1.1, Ветом 2, Ветом 3, Ветом 4, косметичний гель Біосептін);
- Ветеринарні препарати для тварин (Ветом 1.1, Ветом 2, Ветом 3, Ветом 4, гінекологічні свічки Ветомгін, порошок Комарова, мазь Біосептін та ін);
- Добрива для рослин (порошок Фітоп-Флора-С).
Основні виробничі та лабораторні площі розташовані в наукогради Кольцово, Новосибірської області на території Державного наукового центру вірусології та біотехнології «Вектор» - одного з найбільших у світі науково-виробничих комплексів, основними напрямками діяльності якого є проведення фундаментальних і прикладних досліджень в галузі медицини, ветеринарії та сільського господарства. Фірма скористалася природним для природи шляхом підтримки здоров'я макроорганізму, а саме - з природного середовища виділили бактерії - сапрофіти, що мають властивість пригнічувати ріст і розвиток патогенної, умовно-патогенної і гнильної мікрофлори, в тому числі і в шлунково-кишковому тракті теплокровних. Деякі з використовуваних нами штамів бактерій модифіковані таким чином, щоб серед продуктів їх життєдіяльності містилися речовини стимулюють належним чином імунітет теплокровного. Мільйони років еволюції живого на планеті створили такі чудові і досконалі механізми придушення патогенної мікрофлори непатогенних, що сумніватися в успіху такого підходу не доводиться. Непатогенних мікрофлора в конкурентній боротьбі перемагає у безспірному більшості випадків і, якщо б це було не так - нас з вами не було б сьогодні на нашій планеті. У зв'язку з вищесказаним результати праці, представлені у вигляді препаратів пробіотиків, виконані в різних препаративних формах (порошки, капсули, рідини, гелі і т.д.), призначені для придушення росту і розвитку патогенної і умовно - патогенної мікрофлори в місцях її проживання (шлунково -кишковий тракт теплокровних, шкіра, статеві органи, грунт і т.д.).
Адреса: Росія, 630559, Новосибірська область, Новосибірський район, р.п. Кольцово, промзона, корпус 200, Телефон / факс: (383) 325-30-76, 336-52-65, 336-71-32, 306-14-47, 336-52-66, 306-15-61, 306-15-46, E-mail: [email protected]
Біологічно активна речовина Ветом 1.1: застосовується як додаткове джерело пробіотичних мікроорганізмів. Оздоровчий ефект забезпечується властивостями бактерій Bacillus subtilis, які, розмножуючись переважно в товстому відділі кишечнику, виділяють: протеолітичні, амілолітичні, целлюлозолітіческіе ферменти; інтерферон а-2 лейкоцитарний людський; бацитрацин, що пригнічують ріст і розвиток патогенної та умовно патогенної мікрофлори; інші біологічно активні речовини. Внаслідок цього процесу мікробний склад кишечника трансформується до відповідного еволюційно склалася нормі, очищаються його стінки від нетравне залишків їжі, що сприяє активному виводити токсини з організму, безперешкодної доставки біологічно активних і поживних речовин. Під впливом Ветом 1.1 нормалізуються: травлення, всмоктування і метаболізм заліза, кальцію, жирів, білків, вуглеводів, тригліцеридів, амінокислот, дипептид, cахаров, солей жовчних кислот, кислотність середовища в шлунково-кишковому тракті. Ветом 1.1 стимулює напрацювання організмом ендогенних інтерферонів, що забезпечує оптимальне функціонування імунної системи.
Склад: Цукроза, екстракт кукурудзяний, крохмаль картопляний, і висушена біомаса бактерії Bacillus subtilis (рекомбінантного штаму МКПМ 7092, яка продукує інтерферон альфа-2-лейкоцитарний людський).
Властивості:
• Має високу антагоністичною активністю до широкого спектру патогенних і умовно-патогенних грибків і бактерій, противірусної активністю, а також протеолітичної, амілолітичні, целлюлозолітіческой активністю
• стимулює клітинні і гуморальні фактори імунітету
• підвищує неспецифічну резистентність організму
• стабілізує алергічну резистентність
• нормалізує обмін речовин
• стимулює регенераційні процеси
Форма випуску:
1. Порошок, розфасований по 5 г, 50 г, 500 г.
2. Капсули - 50 шт по 33 мг.
Препарат являє собою дрібний кристалічний продукт, який містить мікробну масу живих клітин спорових форм бактерій Bacillus Subtilis. Препарат має солодкий смак і легко розчиняється у воді.
Механізм дії: При прийомі препарату Ветом-1.1 бактерії Bacillus subtilis, заселяють шлунково-кишковий тракт, розмножуються в ньому протягом двох-п'яти діб і потім повністю виводяться з організму в основному нирками шляхом клубочкової фільтрації. У процесі життєдіяльності ці бактерії виділяють Літичні ферменти, здатні знищувати патогенну мікрофлору, елементи пухлинних новоутворень та інші дефективних клітини. Препарат починає діяти через 15-20 хвилин після прийому. Ферменти, що виробляються бактеріями, сприяють більш активному перетравлення рослинної й тваринної їжі, забезпечуючи більш якісне харчування організму в період застосування препарату. Ці ж ферменти сприяють відновленню функцій стінок шлунково-кишкового тракту, що дозволяє біологічно активних і поживних речовин безперешкодно потрапляти в кров, а також посилюють еллімінацію і детотоксикацію ксенобіотиків різного походження (токсинів патоненних мікроорганізмів, пестицидів, продуктів життєдіяльності клітин організму та ін.) У хворих із злоякісними пухлинами препарат застосовується як загальнозміцнюючого і детоксикуючі кошти та кошти, відновлюючого протипухлинну резистентність організму.
Спосіб застосування та дозування: кратність прийому Ветом 1.1 знаходиться в прямій залежності від стану організму людини. Порошок застосовувати протягом 10 днів з розрахунку 1 чайній ложці або 1 капсула від 3 до 10 разів на день залежно від захворювання.
Побічна дія: при прийомі препарату можливе виникнення больових відчуттів в уражених частинах організму. При деяких типах дисбактеріозів на першому етапі спостерігається сильний пронос або рясне газовиділення. Після прийому препарату істотно знижується ступінь і швидкість алкогольного сп'яніння при вживанні спиртних напоїв. Концентрація спирту етилового в повітрі, що видихається орієнтовно в 200 разів знижується щодо аналогічних показників у людини яка не брала Ветом.
Протипоказання: препарат не рекомендується застосовувати при цукровому діабеті. Протипоказанням служить тільки індивідуальна непереносимість діючого початку. Вона може бути виражена у вигляді алергії па сінну паличку. Цей вид захворювання зустрічається вкрай рідко і може бути виражений у вигляді висипки на тілі. У цьому випадку застосування препаратів необхідно припинити. Висипання пройде через кілька днів. Термін придатності 2 роки від дати виготовлення [16].
4. ГАЛУЗІ ВИКОРИСТАННЯ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
Ня сьогоднішній день амілолітичні ферментні препарати мають широкий спектр застосування в різних галузях промисловості. Великий відсоток застосування ферментів припадає на харчову промисловість, наприклад на виробництво спирту як каталізатора процесу розрідження і оцукрювання сировини. Також ферменти застосовуються в технічний цілях, хімічної промисловості, фармацевтичних цілях, а також у якості діагностичних препаратів. [5].
4.1 Хлібопекарська і крохмалепаточна промисловість
Дія всіх ферментних препаратів тим помітніше, чим довший процес дозрівання тіста. У зв'язку з чим необхідно встановлювати кількість ферментного препарату в залежності від способу виготовлення тіста і тривалості бродіння напівфабрикатів[5].
Так, ферментні препарати, що містять мальтогенну β-амілазу, призначені для подовження терміну зберігання свіжості хліба за рахунок істотного зниження швидкості рекристалізації амілопектинової фракції крохмалю. При температурі клейстерізаціі крохмалю цей фермент розщеплює амілози і амілопектин з освітою в основному олігосахаридів, які сповільнюють процеси черствіння хліба. Внесення цього препарату в тісто робить позитивний вплив на обсяг хліба, суттєво покращує структурно-механічні властивості м'якушки, збільшує термін зберігання свіжості готових виробів до 5-7 діб.
β-Амілаза, оцукрюючи крохмаль, що міститься в тісті, сприяє накопиченню цукрів, необхідних для спиртового бродіння в тісті. Ферментні препарати з амілазою будучи додані в кількості 20-25 г на 1 т борошна, покращують якість і аромат хліба, прискорюють дозрівання тесту на 30%, скорочують витрати на виробництво цукру вищих сортів булочних виробів вдвічі, збільшують пористість м'якушки та об'єм хліба на 20% [1, 22].
Амілолітичні ферментні препарати використовують також у крохмалепаточному виробництві для отримання різних видів паточно- і глюкозо-фруктозних сиропів[5].
4.2 Пивоваріння та спиртова промисловість
Амілолітичні препарати широко випускаються в нашій країні і за кордоном. В основному це великотоннажне виробництво. Амілази зна ¬ дят застосування майже у всіх областях, де переробляється крахмалсо-тримає сировину. Амілази використовують для оцукрювання зернового і картопляного крохмалю. Найбільшим споживачем амілолітичні ферментів є спиртова і пивоварна промисловості, де на сьогоднішній день солод (пророщене зерно) успішно замінюється амілолітітичними ферментними препаратами. Амілази – ферменти прискорюють реакцію оцукрювання крохмаль. Економічний ефект застосування амілаз досить значний. У пивоварінні використання ферментних препаратів дозволяє економити 165 г ячменю при виробництві кожного декалітра пива. Застосування амілази в спиртовій промисловість можливість повністю відмовитись від зернового солоду і одночасно збільшити вихід спирту із сировини на 1,5% при зниженні собівартості декалітра спирту. Широкі перспективи обіцяє використання ферментів у виноробстві [4, 24].
4.3 Текстильна промисловість та побутова хімія
Також ферменти використовують в текстильній промисловості для розшліхтування тканин і приготування висококонцентрованих клейстером крохмалю в процесі фарбування тканин[8].
Амілолітичні ферменти застосовують у виробництві пральних порошків. Амілаза виводить з білизни крахмалсодержащіе залишки їжі. Виробництво ферментів при виробництві пральних порошків просто необхідно, щоб підвищити миючу здатність. За оцінками фахівців - технологів частка ферментів в загальній миючої здатності порошку становить 30-35%. Навіть незначне додавання ферментів в пральний порошок значно збільшує його миючу здатність [2, 6].
4.4 Фармацевтична промисловість
Амілолітичні ферменти широко використовують для лікування захворювань шлунково-кишкового тракту. Використання цих ферментів у медицині вельми перспективно, і, безсумнівно буде розширюватися. Труднощі в застосуванні ферментних препаратів для цілей медицини полягають у необхідності очищення їх від пірогенних речовин, токсинів та інших домішок [36]. Амілаза - фермент, гідролізується Глікозидний зв'язку в полісахариду. Основна функція даного ферменту полягає в переварюванні крохмалю і глікогену. У зв'язку з наявністю полісахаридних фрагментів у складі клітинної стінки бактерій, наголошується розщеплення цих полісахаридів і розвиток бактеріостатичної дії амілази, яка найбільш виражена з ферментів цього підкласу - у лізоциму. Спільна дія цих ферментів забезпечує неспецифічну захист проти бактеріальної інфекції[24].
5. СУЧАСНІ НАУКОВІ ДОСЛІДЖЕННЯ, ПОВ`ЯЗАНІ З РОЗРОБКОЮ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
5.1 Комп'ютерне моделювання структури амілолітичних ферментів
При вивченні механізмів ферментативного каталізу класичними методами (ІЧ і УФ-спектроскопія, електронна спектроскопія, ЯМР і т.д.) додаткову інформацію вносить комп'ютерне моделювання білкових молекул з використанням даних рентгеноструктурного аналізу (РСА). Здатність глобулярних білків утворювати якісні монокристали, в яких всі атоми ідентичні і орієнтовані однаковим чином, дозволила вивчати їх за допомогою методу кристалографії. Відомо, що дані рентгеноструктурного аналізу завжди правильно відображають укладання білкової ланцюга, а в переважній більшості випадків буквально відтворюють активну конформацію ферменту. Отже, вони є надійною і поки що єдиною основою для кількісного опису механізму каталітичного акта на атомно-молекулярному рівні. Метод кристалографії дозволяє розшифровувати тривимірні структури комплексів ферментів з інгібіторами, які в тій чи іншій мірі відповідають хімічним стадіях каталізу. Маючи в своєму розпорядженні рентгеноструктурних даними, одна частина яких відповідає реальному вихідного стану ферменту, а інша - фермент-інгібіторної комплексам, стає можливим відтворення механізму каталітичного акта, а, отже, можна простежити динаміку поведінки білкової макромолекули [1]. Розробляються в даний час програми комп'ютерного моделювання білкових молекул на основі результатів кристалографії дозволяють одержувати наочні тривимірні зображення досліджуваних об'єктів, і по-новому осмислити дані експериментальних досліджень кінетики-термодинамічних властивостей ряду ферментів, отримані за останнє десятиліття, а, отже, виявити додаткові аспекти молекулярних механізмів ферментативного перетворення субстрату. У зв'язку з цим метою даної роботи є аналіз топології амілолітичні ферментів з використанням програми MolScript по даних рентгеноструктурного аналізу. Підвищений інтерес до амілаза зумовлений їх широким застосуванням у медицині, харчовій і легкій промисловості як ефективні біокаталізаторів. Дослідження фізико-хімічних властивостей, кінетика-термодинамічних параметрів, особливостей фермент-субстратні взаємодій при здійсненні акту каталізу амілолітичні ферментами сприяли суттєвому зміни й удосконалення багатьох існуючих технологій і створення нових. Однак, очевидним є брак інформації про просторової організації макромолекул ферментів даної групи.
Об'єктом наших експериментальних досліджень є глюкоамілаза з Aspergillus awamori, препарат Г-20Х виробництва Ладижинського заводу ферментних препаратів. Для визначення активності глюкоамілази використовували глюкозооксідазний метод. Визначення загальної кількості білка в ферментні препарати проводили за методом Лоурі. Дослідження співвідношення типів вторинної структури здійснювали методом інфрачервоної спектроскопії на спектрометрі Specord M-80 (Німеччина). Визначення молекулярної маси глюкоамілази, а також вивчення четвертинної структури ферменту з використанням додецилсульфату натрію у концентрації 3,5 Ч 10-5 моль / л для руйнування надмолекулярних рівня організації, проводили за допомогою гель-хроматографії на сефадексе G-200. Кількісне визначення SH-груп здійснювали методом, заснованому на вимірюванні приросту оптичної щільності в області 255 нм при приєднанні n-меркурібензоата до SH-групам. Для кількісного визначення SS груп використовували метод, заснований на вимірюванні оптичної щільності (l = 412нм.) При утворенні нітротіобензоата. Визначення числа йоногенних груп проводили на автоматичної установки, розробленої на кафедрі біофізики та біотехнології ВДУ, шляхом порівняння кривих титрування білка. Вивчення просторової структури глюкоамілази здійснювали з використанням програми MolScript.
Програма MolScript використовується для моделювання протеїнових і протеідових структур. Вихідними даними для програми є *. in файл, в якому вказується файл рентгеноструктурного аналізу, об'єкти для виводу і точну їх опис за допомогою графічних параметрів. Для створення в першому наближенні вхідних файлів MolScript використовується програма MolAuto. Ця програма розпізнає вторинну структуру у файлі pdb і виводить відповідні команди для схематичного опису даної структури. MolAuto має кілька ключів, які дозволяють впливати на властивості об'єктів. Програма не здатна вибирати зручний ракурс, тому користувачеві необхідно вибирати його самостійно. MolAuto може бути частиною потоку UNIX з програмою MolScript: наприклад для швидкого отримання зображення структури в режимі OpenGL. Кожен формат, підтримуваний MolScript, володіє своїми специфічними властивостями. Тому вибір формату проводиться з урахуванням встановленого програмного забезпечення і бажаного набору властивостей отриманої моделі.
Програма MolScript використовує одну фіксовану правостороннім систему координат з ціною ділення 1 ангстрем. Точка огляду зафіксована і змінитися не може. Для перегляду молекули з різних ракурсів атомні координати необхідно трансформувати, тобто повернути і / або транслювати в межах системи координат. Молекулярні координати зчитуються з pdb файлу, а самі координати атомів і залишків, що входять в дане зображення, використовуються графічними командами. Координати обраних атомів трансформуються матрицею, визначеної однією або кількома операціями.
При вивченні топології для двовимірних статичних і тривимірних моделей проводилося розпізнавання субодиниць ферментів в різних масштабах по різних напрямах. Топологічні питання розглядалися як для фрагментів, так і для цілісних молекул амілолітичні ферментів, що дозволило ввести позначення функціонально значущих груп.
Класичні методи вивчення особливостей перебігу ферментативного каталізу дозволяють розглядати широке коло питань. Так, експериментальним шляхом нами було досліджено вплив різних фізико-хімічних факторів на конформацію макромолекули глюкоамілази з Aspergillus awamori та пов'язаних з нею механізмів активації та інактивації даного ферменту; Вивчено кінетику-термодинамічні аспекти реакції гідролізу крохмалю. Методом гель-хроматографії визначена молекулярна маса глюкоамілази, що становить 106 кДа. Дослідження амінокислотного складу глюкоамілази показало, що молекула ферменту містить 26,8% амінокислотних залишків з алкільних бічними ланцюгами (Ala, Val, Leu, Met, Ile), що визначають високу стійкість ферменту до органічних розчинників. Виявлено високий вміст у молекулі глюкоамілази Ser і Thr. Результати наших експериментів і аналіз даних літератури з секвенування глюкоамілази (А. Е. Альошин та ін, 1994) дозволяють зробити висновок про те, що молекула ферменту має 6 SH-груп та 4 дисульфідних зв'язку, що стабілізують його третинну структуру. Вивчення надмолекулярних рівня організації глюкоамілази показало наявність четвертинної структури, представленої двома ідентичними субодиниця з молекулярною масою 53600Да, що володіють каталітичної активністю. Її стабільність визначається водневими зв'язками і гідрофобними взаємодіями і може залежати від невеликих змін в просторовій структурі кожної з взаємодіючих субодиниць. Причому четвертинна структура, очевидно, має здатність передачі структурних перебудов від однієї субодиниці до іншої і є одним з факторів регуляції функціональної активності молекули білка.
Рисунок 5.1. Просторова структура глюкоамілази
Результати досліджень впливу n-меркурібензоата на каталітичну активність глюкоамілази дозволяють зробити висновок про те, що до складу активного центру даного ферменту не входять імідазольного група гістидину і SH-групи, а в гідролізі крохмалю беруть участь карбоксильні групи аспарагінової і глутамінової кислот.
Використовуючи дані рентгеноструктурного аналізуі програму MolScript, методом молекулярного моделювання показано, що активний центр глюкоамілази розташований в наскрізний порожнини (~ 1,5 нм), обмежену наступними амінокислотними залишками: Leu-58, Leu-130, Leu-177, Leu - 319, Trp-178, Trp-417, Phe-187 (Рис1).
Встановлено, що в гідролізі крохмалю беруть участь карбоксильні групи Asp-55, Glu-179, Glu-400 (рис.2).
Активний центр ферменту розташовується в щілини, прикритій двома кластерами молекул H2O: перше - в області Leu-58 (12 молекул H2O), другий - у поглибленні активного центру (7 молекул). Показано, що з одного боку щілини активного центру зосереджені Asp-55 та Glu-179, а з протилежного - Glu-400.
Результати рентгеноструктурного аналізу (Альошин А.Е. та ін, 1994 [10]) показали, що поверхня молекули глюкоамілази глікозильованого: 10 амінокислотних залишків серину і треоніну мають маноза (Ser-453, Ser-455, Ser-459, Thr-457 і ін).
Цей фермент характеризується наявністю N-термінального домену, що складається з 440 амінокислотних залишків, O-глікозильованої ділянки, що має 70 амінокислот і C-термінального крохмалезв’язуючого домену (100 амінокислот). Каталітичний домен має 2 N-глікозильовані ділянки, причому контакт між N-глікозильованими ланцюгами і поліпептидом стабілізується залишком маннози за допомогою водневого зв'язку або іонізованими молекулами води, чим і визначається стабільність ферменту і можливість утворення надмолекулярних структур. O-глікозильований домен має залишки Gly перед і після C-кінця, які являють собою вигини, що визначають взаємодію крохмалезв’язуючого домену з каталітичним і відповідну орієнтацію молекули субстрату. Глікозилювання запобігає скупчення молекул субстрату в зв'язують центрах і забезпечує стехіометричної зв'язування.
Рисунок 5.2. Просторова структура макромолекули глюкоамілази
Методом комп'ютерного моделювання встановлено, що для молекул глюкоамілази характерна щільна упаковка гідрофобного ядра у вигляді 13 α-спіральних ділянок (рис.3), а так само антипаралельних β-структур, що утворюють 11 петель (рис. 4).
Рисунок 5.3. Топологія α-спіралей в макромолекулі глюкоамілази
Рисунок 5.4. Топологія β-слоїв в макромолекулі глюкоамілази
Під вторинної структурі присутні, крім того, невпорядковані ділянки в кількості 19 (мал. 5). У відсотковому співвідношенні даних структур по протяжності, аморфні ділянки переважають над іншими, що підтверджено також методом ІЧ-спектроскопії.
Рисунок 5. Топологія неупорядкованих ділянок в макромолекулі глюкоамілази
Таким чином, комп'ютерне моделювання дозволяє отримувати додаткову інформацію про структуру білкових макромолекул і проводити розшифровку механізму ферментативного каталізу.
В даний час продовжуються роботи з проблем вивчення топології різних амілолітичних ферментів, таких як α-амілаза, β-амілаза, інулаза та ін. Обговорюються питання топологічної самоорганізації досліджуваних білкових макромолекул, яка визначається взаємозв'язком первинної та вторинної структури[25, 26, 27].
6. ОСОБЛИВОСТІ ТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРОЦЕСУ ВИРОБНИЦТВА АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ
6.1 Виробничі способи культивування мікроорганізмів - продуцентів ферментів
Існує два способи культивування мікроорганізмів - продуцентів ферментів: поверхневий і глибинний.
Перший спосіб, який застосовується для культивування мікроскопічних грибів, характеризується розвитком міцелію на поверхні твердого або рідкого субстрату. На рідкому субстраті утворюється плівка міцелію, яка продукує не тільки амілолітичні ферменти, але й органічні кислоти, що їх інактивують, тому використовують тверді субстрати з розвиненою поверхнею - пшеничні висівки, дробину барди, картопляну мезгу та ін. Максимальна активність ферментів досягається при культивуванні грибів на пшеничних висівках. Дробина барди бідна живильними речовинами, і активність ферментів у культурах грибів, вирощених на ній, в 4-5 разів нижче, ніж на висівках. Зріла культура грибів внаслідок обволікання часток висівок міцелієм має вигляд щільної войлокоподібної маси. При поверхневому культивуванні пшеничні висівки повинні бути зволожені і простерилізовано. У стерильних умовах готують посівну культуру, але вирощують гриби в нестерильних умовах у кюветах, які встановлюються в негерметичних ростильних камерах. Теплоту, що виділяється в процесі росту грибів, видаляють продування через ростильну камеру стерильного кондиціонованого повітря.
Поверхневий спосіб вирощування мікроскопічних грибів має ряд переваг. Так як під час росту гриба висівки не перемішуються, сторонні мікроорганізми не розповсюджується по всій їхній масі і викликають лише незначне місцеве інфікування, яке, як правило, не впливає на активність ферментів. Це, однак, не виключає необхідності ретельної стерилізації повітря, середовища і обладнання. Культуру на висівках висушують до вмісту вологи 10 ... 11%. У такому вигляді вона може зберігатися тривалий час без значної втрати активності. Це дозволяє організувати централізоване постачання спиртових заводів сухий культурою мікроскопічних грибів, що є одним з переваг поверхневого способу вирощування.
Недолік поверхневого способу – необхідність встановлення безлічі кювет, роботу з якими важко механізувати. Собівартість культури гриба-продуцента висока, причому в основному через витрати великої кількості ручної праці. Механізація процесу вирощування можлива шляхом забудівлі безперервнодіючих установок або бескюветних апаратів з вертикальним товстим шаром живильного середовища та інтенсивним продування повітря через цей шар.
Глибинну культуру мікроорганізмів вирощують на рідкому поживному середовищі при енергійної аерації в герметично закритих апаратах та в стерильних умовах. Процес повністю механізований. Стерильність глибинної культури мікроорганізма – продуцента ферментів позитивно відбивається на результатах зброджування сусла дріжджами [2, 28].
Культура, що виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні, представляє собою корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних міцелієм, що зрісся. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм. Культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40оС, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.
6.2 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з глибинних культур мікроорганізмів
Для отримання амілолітичних ферментних препаратів у нашій країні переважно використовується глибинний спосіб культивування. У цьому випадку мікроорганізми вирощуються в рідкому поживному середовищі. Технічно більш досконалий, ніж поверхневий, так як легко піддається автоматизації та механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні, зазвичай, значно нижче, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.
Підготовка живильного середовища: головним джерелом вуглецю для всіх продуцентів α-амілази є крохмаль різного походження, який вводиться в середу в клейстерізованому стані. Може використовуватися і крохмалевмісну сировину. Біосинтез α-амілази протікає більш інтенсивно, якщо крохмаль частково гідролізувати, не допускаючи накопичення в середовищі низькомолекулярних вуглеводів наприклад гідролізат крохмалю. Склад живильного середовища може включати й інші різні вуглеводвмісні речовини: гідролізат крохмалю, кукурудзяної муки, кормових дріжджів, лужний екстракт кукурудзяної муки. Неорганічні речовини: (NH4) 2HPO4, CaCl2, MgSO4, KCl. Деякі компоненти попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для приготування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня обсіменіння об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації та апарати. Повітря очищається до і після аерування. До – тому що містить частинки пилу органічної та неорганічної природи, після – тоу що несе клітини продуцента [2, 6, 29].
Одержання посівного матеріалу: для засіву живильного середовища матеріал готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів це міцеліальна вегетативна маса, для бактерій - молода зростаюча культура на початковій стадії спороутворення. Одержання посівного матеріалу полягає в збільшенні маси продуцента в 3-4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується лише вегетативно, він різко зростає (до 5-20%). Якщо ж відбувається рясне спороношення – скорочується до 1%.
Посівний матеріал як на окремих стадіях, так і готовий піддають ретельному мікробіологічний контроль. Він не повинен бути інфікований сторонньою мікрофлорою, в ньому має міститися певна кількість спор або клітин на одиницю маси, генетично закладені в ньому властивості продукувати ферменти повинні стійко зберігатися [30].
Біосинтез ферментів в глибинній культурі протікає протягом 2-4 діб при безперервної подачі повітря і перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах можуть гальмувати зростання біомаси продуцента, тому часто свіжа середу або деякі її компоненти вводяться в ферментер на стадії активного зростання. Температурний оптимум знаходиться в інтервалі 22-32оС. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості утворилися метаболітів і концентрації клітин. Дані надходять в комп'ютер, який визначає стратегію корекції процесу і автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкращу якість продуктів.
Відомі наступні різновидності глибинного культивування: періодичний, безперервно-циклічний і безперервно-проточний.
1. Періодичний спосіб характеризується незмінність живильного середовища в ферментера, склад якої в процесі розвитку поступово змінюється. Процес протікає постадійно: у ферментер набирають живильне середовище і задають посівний матеріал; після розмноження мікроорганізмів і накопичення продуктів їх обміну зрілу культуру вивантажують, а все обладнання, комунікації та запірні пристрої пормивають, а потім стерилізують парою.
2. При безперервноциклічному способі мікроорганізми, розташовані на нерухомої насадці у ферментері, омиваються середовищем, що протікає в замкнутому контурі, до повного споживання ними поживних речовин. Після цього зрілу культуру вивантажують, починаючи з останнього, апарати промивають, стерилізують і цикл повторюють з останнього голів ¬ ного ферментера. Багата поживними речовинами середу під час такої циклічної ферментації поступово виснажується; за часом перебування середовища в зоні реакції цей процес більш тривалий, ніж періодичний.
3. Безперервно-проточний спосіб культивування мікроорганізмів більш досконалий. Суть його полягає в тому, що мікробна популяція розвивається в проточному поживному середовищі. Спосіб має два різновиди: гомогенно-неперерваним і градієнтні-безперервний. У першому випадку вирощування ведуть в одному ферментері; при ретельному перемішування середовища та аерації забезпечується однакове стан культури в усьому об'ємі рідини. У ферментер при цьому не безперервно надходить свіжа середи, а з нього також безупинно випливає надлишок зрілої культуральної рідини.
4. Градієнтні-безперервне культивування здійснюють в батареї ферментера, з'єднаних переточні трубами. Середовище, що засівають, з великим вмістом вуглеводів і інших інгридіентів безупинно перетікає з одного ферментера в інший і також безперервно витікає у вигляді готової культури.
Безперервним культивуванням у проточних середовищах можна вирощувати мікроорганізми в умовах, оптимальних для їх стадії розвитку. При цьому такі важливі фактори, як концентрація поживних речовин, кількість продуктів обміну, рН, вміст розчиненого кисню, різко змінюються при періодичному способі культивування, підтримуються по стояли на заданому рівні або змінюються по розробленній програмі.
Виділити: У міцелії тридобовий культури зазвичай залишається не більше 15% ферментів. Решта виділяються в навколишнє клітини рідку середу. У цьому випадку препарати ферментів виділяють з фільтратів після відділення біомаси.
Концентрування: для отримання ферментних препаратів з індексом Г3х фільтрат або культуру концентрують, після чого суміш направляється на сушіння. Глибинні культури мікроскопічних грибів в рідкому вигляді не можуть зберігатися тривалий термін без втрати активності, перевозити їх на великі відстані внаслідок значного вмісту в них води (до 85 ... 90%) також економічно не завжди виправдано. Тому при організації постачання культурою спиртових заводів доцільно її попередньо концентрувати.
Концентрування культур можна здійснювати на вакуум-випарних установках з отриманням сиропів при температурах, що забезпечують збереження ферментів, або на розпилювальних сушарках з отриманням порошкоподібного ферментного препарату. Однак ці способи супроводжуються значними втратами активності (до 50%) і тому не знайшли поширення на спиртових заводах. Починаючи з сімдесятих років у ВНІІПрБТ був розроблений і впроваджений на Мічурінському експериментальному заводі спосіб концентрування глибинних культур ультрафільтрації.
Спосіб заснований на проведенні процесу фільтрації через ряд напівпроникних мембран, в результаті чого ферменти та інші високомолекулярні речовини затримуються або виводяться з апарату у вигляді ультраконцентрату (концентрованого сиропу). Вода і частина низькомолекулярних речовин (пермеат) проходять через мембрани і також видаляються.
Втрати активності при ультрафільтрації складають до 15% в перерахунку на первинну активність вихідної висвітленої культуральної рідини.
При використанні концентрованих препаратів на стадії оцукрювання застосовують звичайне обладнання для фармакотерапевтичної групи ферментних оцукрюючих матеріалів [30].
Очищення: для отримання очищених ферментних препаратів використовують традиційні методи, що дозволяє більш ніж у 30 разів підвищити активність препарату. Для відділення амілаз від супутніх ферментів використовується адсорбція домішок на глинистих матеріалах, зокрема на бентоніт. Одним із прийомів очищення термостабільним амілаз від протеаз є термоінактівація останніх. Також використовуються методи біоспеціфіческой хроматографії на природних і синтетичних сорбентах.
Сушка: висушування препарату повинне здійснюватися за температури на вході в розпилюючи сушарку не вище 100-120 ° С, на виході – не більше 50-60 °С. При сушці і концентрування велике значення має правильний вибір стабілізатора ферменту. Введення стабілізаторів у присутності наповнювачів (перліту та каоліну) в процесі розпилювального сушіння дозволяє практично повністю запобігти теплову інактивацію ферментів [30].
6.3 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з поверхневих культур мікроорганізмів
При поверхневому методі культура росте на поверхні твердої зволоженою живильного середовища. Міцелій повністю обволікає і досить міцно скріплює тверді частинки субстрату, з якого отримують поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середу повинна бути пухкої, а шар культури-продуцента невеликим.
Підготовка живильного середовища: середовищем для вирощування продуцентів є пшеничні висівки з додаванням до 25% солодових паростків, зволожених водою, подкисленной 0,1 н. розчином сірчаної або соляної кислоти. Вихід готової культури складає звичайно 70-80 мас. % Від маси середовища. Пшеничні висівки - джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до висівками можна додавати буряковий жом, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середу гострим паром при помішуванні (температура - 105-140 С, час 60-90 хвилин). Після цього середу засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають в растільние камери.
Одержання посівного матеріалу: продуцентами α-амілази і глюкоамілази найчастіше є бактерії B.subtilis і B.amilosolvents. Вирощування виробничої культури відбувається зазвичай в асептичних умовах, але середовище та кювети необхідно простерилізувати. Перед кожним новим завантаженням також необхідна стерилізація устаткування. Переваги поверхневої культури: значно більш висока кінцева концентрація ферменту на одиницю масу середовища (при оцукрювання крохмалю 5 кг поверхневої культури замінюють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.
Посівний матеріал може бути трьох видів:
- Культура, що виросла на твердому живильному середовищі;
- Споровий матеріал;
- Міцеліальних культура, вирощена глибинним способом.
В три етапи отримують і посівну культуру. Спочатку музейну культуру продуцента пересівають на 1 - 1.5 г зволожених стерильних пшеничних висівок в пробірку і вирощують в термостаті до рясного спорообразованія. Другий етап - аналогічно, але в колбах, третій - у судинах з 500 г середовища.
Виробниче культивування: режими вирощування залежать від фізіології продуцента. Культивують протягом 36-48 годин. Зростання ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набухання конідій і їх проростання (температура не нижче 28 є С), потім зростання міцелію у вигляді гармата сірувато-білого кольору (необхідно виводити виділяється тепло) та освіта конідій. Для створення сприятливих умов росту і розвитку продуцента необхідна аерація і підтримання оптимальної вологості (55-70%).
Виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні культура представляє корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних зрослися міцелієм. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм.
Виділення та очищення: процес очищення починається з водної екстракції при 20-25 ° С з відбором 20-22% розчину; середня концентрація СВ в екстрактах - 11-14%. Екстракт може бути використаний для отримання очищених препаратів шляхом осадження ферментів органічними розчинниками або солями. Амілази випадають в осад майже повністю (93-96%) при концентрації етанолу в розчині 69-72%, ацетону - 60-62 і ізопропанол - 54-55%. Як правило, екстраген - вода. При цьому в розчин переходять цукру, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення і очищення завершує сушка.
Сушка: культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40 є С, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.
Стандартизація: стандартизація ферментного препарату - доведення активності ферменту до стандартної, що відповідає вимогам ГОСТ. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі - крохмаль, лактоза та ін [2, 30].
7. МЕТОДИКИ ВИЗНАЧЕННЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЇ АКТИВНОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ
Як правило, ферменти присутні в біологічних об'єктах в мізерно малих концентраціях, тому більший інтерес представляє не кількісний вміст ферментів, а їх активність по швидкості ферментативної реакції (по убутку субстрату або накопичення продуктів).
Для визначення ферментативної активності ферментів застосовуються такі методи, які дозволяють безперервно стежити за ходом перетворення у часі: спектрофотометричні методи, потенціометричні, полярографічні і т.п. Для вимірювання швидкості ферментативної реакції необхідно вибрати буфер, який не гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку рН розчину, близької до оптимальної для даного ферменту. Реакцію проводять при температурі, що лежить в більшості випадків в межах 25-40 є С. При дослідженні ферментів, що вимагають присутності кофакторів (іонів металів, коферментів та ін), концентрація яких може знижуватися в міру очищення ферменту, в реакційну суміш слід додавати відсутні кофактори, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ і т.п. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори до складу досвідчених сумішей[31].
7.1 Спектрофлюрометричні методи
Для цілей визначення ферментів можуть бути використані не тільки вимірювання поглинання світла, але також вимірювання флуоресценції – спектрофлюрометричні методи. Таке визначення активності ферменту в ряді випадків по чутливості перевершує спектрофотометричні методи на цілий порядок величини. Деякі коферменти і субстрати мають сильну флуоресценції. НАД та НАДФ у відновленому стані мають сильну флуоресценцію і не флуорисцують в окисленому стані[31, 33].
7.2 Колориметричні (фотометричні) методи
В основі цих методів лежить вимірювання за допомогою візуального або фотоелектричного колориметр пофарбованого продукту, що утворюється при взаємодії субстрату або продукту дії ферменту зі специфічними реактивами, які зазвичай додаються в фіксовану дослідну пробу, взяту після зупинки ферментативної реакції. Ці методи дуже різноманітні. Розроблені кількісні методи, засновані на біуретової реакції, при якій склад білку, очевидно не повинен позначатися на результатах визначення, тому що ця реакція на пептидні зв'язки, а не на бічні групи в білку. Метод Горнелла і співавторів, заснований на вимірюванні смуги поглинання в області 550-650 нм, використовується для визначення значних кількостей (1-10 мг) білка в пробі. Пропонуються біуретовим мікрометодом, засновані на поглинанні ультрафіолетових променів мідно-білковими комплексами: вони дозволяють визначати 0.1 - 2.0 мг білка в пробі. Число небілкових речовин, які можуть впливати на визначення за допомогою біуретової реакції, невелика, але слід вносити поправки на ті речовини, які присутні у високих концентраціях (солі амонію, сахароза). Найбільш цінними є ті фотометричні методи, які дозволяють стежити в часі за ходом ферментативної реакції без її припинення щодо зміни забарвлення хромогенного субстрату або доданого індикатора. Метод Толіна і Чіокальто, запропонований для визначення кількості білка, заснований на хромогенних природі деяких бокових груп амінокислот, а також на присутності в білках пептидних зв'язків. Цей метод має високу чутливість (на пробу досить 0.01 - 0.1 мг білка), але багато небілкових речовини заважають визначенням.
В даний час для визначення кількості білка широко користуються вимірюваннями інтенсивності поглинання світла при 280 нм, що обумовлено присутністю в білку ароматичних амінокислот. Кількість цих амінокислот у різних білках по-різному і, отже, інтенсивність неоднакова. У кюветі товщиною 1 см у розчину, який містить 1 мг "усередненого" білка в 1 мл, оптична щільність дорівнює 1 при довжині хвилі 280 нм. Нуклеїнові кислоти поглинають при 280 нм, але можна зробити поправку на їх присутність, проводячи вимірювання і при 260 нм і при 280 нм. Дуже важлива швидкість вимірювання активності ферментів. Те ж відноситься і до вимірювання кількості сухого залишку або кількості білка. Тим самим віддають перевагу швидкому метод визначення білка шляхом вимірювання величини поглинання при 280 нм. Виграний час важливіше, за рахунок того, що питоме поглинання виділяється білка іноді значно відрізняється від середньої величини поглинання суміші білків, присутніх у вихідному матеріалі[32, 33].
7.3 Спектрофотометричні методи
Спектрофотометричні методи засновані на поглинанні світла в певних ділянках спектру багатьма сполуками, які є активними групами ферментів, субстратами або продуктами реакції. Положення максимуму поглинання при певній довжині хвилі визначається наявністю в досліджуваному матеріалі певних груп - аналітичних форм. Для вимірювання спектрів використовують спеціальні прилади - спектрофотометри, фотометричні абсорбціометри та ін Цей метод відрізняється високою чутливістю, швидкістю визначення, малим витрачанням ферменту і реактивів і дозволяє стежити за перебігом реакції у часі. Для цього реакційну суміш поміщають в кювету, вставлену в термостатуємий кюветотримач. Через малий проміжок часу після додавання ферменту (або субстрату) і швидкого перемішування вимірюють поглинання при довжині хвилі, характерної для використовуваного субстрату або кінцевого продукту, що утворюється в даній реакції. За допомогою спектрофотометричних методу можна вимірювати безпосередньо концентрацію деяких ферментів (після достатньої очищення) за величиною характерних максимумів поглинання міцно пов'язаних коферментів (простетичних груп). Необхідно мати довільно вибрану одиницю ферменту, за допомогою якої можна було б кількісно виразити чистоту і активність різних фракцій. У більшості випадків вибір одиниці залежить від обраного методу визначення. У разі спектрофотометричних методу такою одиницею може служити кількість ферменту, що викликає певну зміну в оптичної щільності за певний час за даних умов досвіду; якщо визначається продукт реакції, то одиницею буде кількість ферменту, що викликає утворення певної кількості речовини в хвилину, і т.д . Тоді питому активність ферменту, яка є мірилом чистоти ферментного препарату, виражають числом одиниць в 1 мг речовини (білка)[32, 33].
7.4 Манометричні методи і інші методи
Ці методи використовуються при визначенні активності ферменту в тих випадках, коли в досліджуваних реакціях один з компонентів знаходиться в газоподібному стані. До таких реакцій відноситься головним чином ті, що пов'язані з процесами окислення і декарбоксилювання, що супроводжуються поглинанням або виділенням кисню і вуглекислоти, а також реакції, в яких виділення або зв'язування газу відбувається в результаті взаємодії продуктів ферментативного перетворення з доданим до системи реактивом. Спостереження за ходом реакції у часі проводиться в спеціальних приладах – манометричних апаратах Варбурга.
Інші методи: сюди відноситься великий ряд методів, що включають поляриметрії, віскозиметрі, потенції-і кондуктометричні вимірювання і т.п. Також визначення активності можна виконувати, використовуючи методи хроматографії та електрофорезу на папері. Ці методи високочутливі і специфічні, що робить їх у багатьох випадках незамінними; вони дозволяють значно скоротити витрату ферменту на вимірювання активності, але не завжди застосовні через тривалості розділення речовин у процесі хроматографії (та електрофорезу) [32, 33].
ВИСНОВОК
З вище сказаного стає зрозумілим, що важливою ланкою на біотехнологічному ринку було є та буде виробництво ферментних препаратів. По даним досліджень об’єм російського та українського ринків ферментних препаратів на сьогоднішній день складає приблизно 50 млн доларів США. Здебільшого спрямування ринку йде на задоволення потреб спиртової галузі виробництв та кормового виробництва. Але також набирає обертів і потреба у ферментах в медичній та інших промисловостях. З кожним роком розвиток ринку досягається шляхом збільшення ефективності продукованих ферментів, розробка нових, більш дешевих методів виробництва, пошуку нових галузей використання готового продукту.
У науково-дослідних організаціях постійно проводиться робота з поліпшення ефективності виробництва ферментних препаратів, в основному по підвищенню активності, зрілої культури. Це досягається не тільки селекцією штамів мікроорганізмів, але і вдосконаленням умов культивування, в тому числі і зміною складу живильного середовища.
Тому, можна зробити висновок, що амілолітичні ферментні препарати з кожним роком стають все більш використовуваними.
СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ
1. Матвеева И. В. Микроингредиенты и качество хлеба // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2000. - №1. – с. 28-31.
2. Грачева И.М. , Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. – 3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во “Элевар” 2000. 512с. ил.
3. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. – Киев: Наук. думка, 1987. – 192 с.
4. В.Л Яровенко, В.А Марчиненко, В.А Смирнов и др. Под редакцией проф. В.Л Яровенко. Технология спирта. - М.:Колос “Колос-Пресс”, 2002.
5. Жеребцов Н.А. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности.
6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.- М., 1989
7. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: пер.англ.- М.: Мир, 1982.- т.1.- с. 370-375
8. Ковалева Т.А., Селеменев В.Ф., Гречкина В.Р. Некоторые свойства глюкоамилазы // Труды III Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии. – Тбилиси, 1982. – С. 240-241.
9. Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия: Учебник.- М.: Медицина, 1990.- 115с.
10. . Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов.- М.: Мир., 1980.- с. 373-388
11. Офіційний сайт «Ензим» ДП, www.enzim.biz
12. Офіційний сайт ВАТ «Восток»,www.vostokbio.com
13. Офіційний сайт ВАТ «Витамины»,www.vitaminy.com.ua
14. Офіційний сайт ЗАТ «Технолог»,www.technolog.ua
15. Офіційний сайт компанії «Novo Nordisk» www.novonordisk.com
16. Офіційний сайт компанії «Novozymes» www.novozymes.com
17. Офіційний сайт компанії «Genom Biotech», www.genomworld.com
18. Офіційний сайт ТОВ ВО «Сиббиофарм» www.sibbio.ru
19. Компания ООО «Русфермент», www.rusferment.ru
20. ООО «ЭнзимБиоПродукт»,www.enzymebioproduct.ru
21. Офіційний сайт ТОВ науково-виробничої фірми «Дослідницький центр» www.vetom.ru
22. Моноглицеридные продукты в хлебопечение // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2000. - №1. – с. 34.
23. Справочник по производству спирта. Сырьё, технология и технохимконтроль /В.Л Яровенко. Б.А. Устинников, Ю.П. Богданов, С.И. Громов – М.: Легкая пищевая пр-ть
24. Полиферментные препараты в гнойной хирургии, Методические рекомендации под редакцией Главного хирурга МО РФ, доктора медицинских наук, профессора Н.А. Ефименко 336с.
25. Ковалева Т.А., Башарина О.В., Селеменев В.Ф. Исследование структуры глюкоамилазы методом ИК спектроскопии // Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. – Харьков, 1991. – С. 134-135.
26. Ковалева Т.А. Кинетико-термодинамические аспекты катализа полисахаридов свободными и иммобилизованными амилазами // Биофизика. - Т.45, N3, - 2000 - C. 439-444.
27. Ковалева Т.А., Кожокина О.М., Битюцкая Л.А., Дронов Р.В., Мельников Л.Ю. Компьютерное моделирование структуры амилолитических ферментов // Статья
http://www.library.biophys.msu.ru/mce/20022807.htm
28. Матеріали з сайту http://www.prodindustry.ru
29. Матеріали з сайту http://www.ferment.ru
30. Н.С. Егоров. Промышленная микробиология. – М.: Выс. шк., 1989. – 678c
31. А.А. Анісімова. Основи біохімії: Підручник для студ. биол. спец. ун-тов/под ред. - М.: Выс. шк., 1986. - с.133-140
32. Ю.Б. Филлипофич, Основы биохимии. – М.: изд. Агар, 1999. – 512 с
33. ГОСТ 20264.4-89 Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности
