1.2 Патогенные микроорганизмы рода Clostridium
1.2.1 Возбудитель ботулизма
Ботулизм вызывает Clostridium botulinum, это тяжелое пищевое бактериальное отравление с преимущественным поражением центральной нервной системы и высокой летальностью. Возбудитель болезни открыт в Голландии Э. ван Эрменгемом в 1896 г. Временной интервал между попаданием токсина в организм и появления первых признаков ботулизма, обычно не превышает 24 ч, но может варьировать от 4-6 до 96 часов и более. Ботулизм связан, главным образом, с продуктами домашнего приготовления, заготовленными впрок. Общепринятые в домашних условиях способы обработки пищевых продуктов, такие как консервирование в банках, копчение, маринование, соление, не приводят к уничтожению возбудителей ботулизма и их спор и при длительном хранении в этих продуктах может образоваться токсин.
Возбудители ботулизма широко распространены в природе, нормальные обитатели кишечника животных и человека, попадают в почву с фекалиями. Естественный резервуар-почва. Широкое распространение возбудителей ботулизма в почве ведет к попаданию этих микробов на овощи и фрукты, а также к обсеменению сырья, идущего для приготовления консервов, колбас и других продуктов.
Серологическая идентификация Cl.botulinum основана на выявлении экзотоксинов. В зависимости от антигенных свойств которых разделяют на 7 сероваров: А, В, С, D, E, F, G. Оптимальная температура для токсинообразования вариабельна: для бактерий типов А, В, С, D - 35°С, для типов Е и F - 28- 30°С. Патогенность Cl. botulinum для разных теплокровных различна. Заболевания у человека вызывают бактерии типов А, В, Е, F; бактерии типов С, D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана. Главные факторы патогенности Cl.botulinum – экзотоксины, оказывают нейротоксическое действие на организм, в организме возбудитель практически не размножается. Ботулинические токсины довольно устойчивы к температурным воздействиям. Токсин иногда разрушается только при кипячении в течение 10-15 минут и не разрушается в желудочно-кишечном тракте под влиянием пищеварительных ферментов. Ботулинический токсин – самый сильный из всех биологических ядов.
Cl.botulinum типов А, В, С, D, E, F - очень близки по морфологии, культуральным свойствам и по действию их токсинов на организм человека и животных. Все они дают одинаковую клиническую картину болезни. Различные типы ботулинического микроба отличаются по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов, токсин каждого типа нейтрализуется сывороткой того же типа.
По морфологии возбудители ботулизма представляют собой небольшие палочки 0,6-1,0 х 3,0-9,0 мкм с закругленными концами. Палочки образуют субтерминальные или терминальные споры, палочки со спорой имеют вид теннисной ракетки, легко окрашиваются различными анилиновыми красками, молодые клетки грамположительны, при старении культуры (через 4-5 суток роста) палочки окрашиваются грамотрицательно, микробы подвижны, имеют от 4 до 35 жгутиков, капсул не образуют.
Возбудители ботулизма - строгие анаэробы, они растут без доступа воздуха, поэтому обычно размножаются и образуют токсин внутри больших кусков рыбы, ветчины, колбасы, либо в герметически закрытых банках консервов. Возбудители ботулизма типа Е, а также непротеолитические штаммы типа В и некоторые штаммы типа F образуют на питательных средах и в пищевых продуктах кроме токсина и нетоксичный предшественник токсина - протоксин, который, не убивая мышей при парентеральном введении, проявляет свою биологическую активность при попадании в желудочно-кишечный тракт человека и животных в результате воздействия на него протеолитических ферментов.
При добавлении протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина) in vitro также происходит активация протоксина, который переходит в токсин. Этот феномен следует учитывать при проведении лабораторной диагностики ботулизма.
Нередко консервные банки, куда вместе с продуктами попадает и возбудитель ботулизма, оказываются бомбажными за счет образования микробом газа, однако, часто при наличии микробов ботулизма и ботулинических токсинов пищевые продукты выглядят совершенно доброкачественными и консервные банки не дают «бомбажа». Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла.
Критерии диагностики. Лабораторная диагностика ботулизма преследует цель обнаружения и идентификации ботулинического токсина и выделение возбудителя. Лабораторному исследованию подлежат остатки пищевых продуктов, материал полученный от больного (кровь, испражнения, моча, промывные воды желудка, рвотные массы) и секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5-10 мл, промывные воды желудка забирают в объеме 50-100 мл, кал 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде. Кровь исследуют только на наличие токсина (для чего проводят биологическую пробу), испражнения только на наличие возбудителя (проводят посев на питательные среды), весь остальной материал на наличие возбудителя и его токсина.
Морфология. Клостридии ботулизма — крупные, полиморфные, с закругленными концами палочки; длина их 4—9 мкм, ширина 0,6—0,8 мкм. Образуют споры овальной формы, которые вместе с вегетативной клеткой напоминают теннисную ракетку. По Граму окрашиваются положительно, подвижные (перитрихи).
Культивирование. Возбудитель ботулизма — строгий анаэроб. Лучше растет на нейтральной и слабощелочной среде. На среде Китта — Тароцци вначале происходит помутнение бульона, затем, после оседания микробов на дно, наступает просветление. Клостридии ботулизма разжижают желатину, пептонизируют молоко. Культура ботулинуса во время роста приобретает запах прогорклого масла.
Токсинообразование. Клостридии ботулизма образуют токсин в кормах и продуктах. Он выдерживает кипячение в течение 10—15 мин. Пищеварительные ферменты (пепсин, трипсин) не разрушают токсины типов А, В, С, D, F и во много раз усиливают активность типа Е. Патогенность микроба обусловливается исключительно его токсинообразованием. Ботулинический токсин — самый сильный из всех микробных ядов. Одного грамма токсина (по данным разных авторов) достаточно, чтобы уничтожить 20—60 млрд. мышей.
В таблице 2 показана токсичность ботулинического токсина в сравнении с другими ядами (данные А. В. Фомина, А. Ф. Коломиец, 1985).
Таблица 2
Токсичность ботулинического и некоторых других ядов для мыши

Вещество	Минимальная летальная доза, микромоль/кг
Ботулинический токсин	3,3-10 -17
Дифтерийный токсин	4,2-10 -12
Кураре	7,2-10 -7
Стрихнин	1,5- 10 -4

Патогенность. К ботулиническому токсину чувствительны животные всех видов. У лошадей наступает паралич глотательной и дыхательной мускулатуры, смертность достигает 100%. У крупного рогатого скота клиника аналогична. У кур наблюдается расслабление шейной мускулатуры и парез ног. Из лабораторных животных к токсину чувствительны морские свинки, белые мыши. Через 3—4 дня после заболевания они погибают. К ботулинической токсикоинфекции чувствителен и человек.
Смертельная доза токсина для человека составляет около 1 мкг (10^-6 г) Устойчивость. Благодаря образованию спор клостридии ботулизма устойчивы к неблагоприятным воздействиям среды. В высушенном состоянии сохраняют жизнеспособность десятилетиями. Хорошо переносят высокие температуры. К низким температурам также малочувствительны, сохраняют жизнеспособность при — 190°С. Температуру — 16°С выдерживают в течение года, но при оттаивании разрушаются и выделяют токсин.
Под действием 20%-ного формалина споры погибают через 24 ч, 10%-ного раствора соляной кислоты — через час, этилового спирта — через 2 мес.(С.244)
Микробиологический диагноз основан на обнаружении токсина в остатках корма (пищи) или в органах павшего животного. Фильтрат подозреваемого материала вводят подопытным животным и по их клинике определяют болезнь.
Иммунитет при ботулизме антитоксический. Человека лечат специфической противоботулинической сывороткой. Животным сыворотку вводят редко. Надежный метод профилактики болезни —иммунизация ботулиническнм анатоксином (Ассонов, 1989).
1.2.2 Clostridium perfringens
Clostridium perfringens – вид бактерий рода Clostridium - один из наиболее распространенных патогенных видов. По способности образовывать четыре главных токсина (α-, β-, ε-, τ-) микроорганизмы разделяют на шесть сероваров: А, В, С, D, E и F. Cl. perfringens распространены повсеместно; бактерии выделяют из воды почвы, сточных вод. Они колонизируют кишечник животных и человека (выделяют у 25-35% здоровых лиц). Других природных резервуаров помимо пищеварительного тракта Cl. perfringens не имеют, почва и другие объекты внешней среды обсеменяются ими только фекальным путем. У человека Cl.perfringens вызывает два типа поражений - газовую гангрену и пищевые токсикоинфекции.
Вегетативные клетки Cl рerfringens представлены короткими крупными палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0х1х1,5 мкм). Отличительные особенности бактерий - строго положительная окраска по Граму и отсутствие подвижности. In vivo образуют капсулу. Бактерии хорошо окрашиваются анилиновыми красителями, в старых культурах могут быть грамотрицательными. Споры крупные овальные расположены центрально или субтерминально. Термоустойчивость спор сероваров В и D относительно невысока, погибают при кипячении в течение 15-30 мин, споры типов А и С более устойчивы и выживают при кипячении в течение 1-6 часов. Cl.рerfringens типа А относительно толерантна к кратковременным кислородным воздействиям и способна расти в высоких столбиках сред, без герметизации вазелиновым маслом. На плотных средах бактерии образуют S-и R- колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями. Сначала они прозрачные, позднее становятся мутными серовато-белыми, R- колонии неправильной формы, бугристые с неровными шероховатыми краями; в глубине агара напоминают комочки ваты. На агаре с кровью обычно окружены зоной гемолиза. Характерное свойство колоний Cl.perfringens типа А, служащие дифференцирующим признаком, - способность менять серовато-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в анаэробных условиях. На желточном агаре бактерии образуют колонии, окруженные зоной перламутрового преципитата, образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы. Культуры Cl.рerfringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум рН 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5. На средах содержащих глюкозу рост происходит очень бурно, с образованием Н₂ и СО₂ и заканчивается через 8-12 часов. Первые признаки роста на среде Китт-Тароцци могут проявляться уже через 1-2 часа (особенно при 43°С) и проявляются помутнением и появлением пузырьков газа. Бактерии ферментируют углеводы с образование кислоты и газа. От прочих Cl.рerfringens отличает способность восстанавливать нитраты, расщеплять лактозу, образовывать лецитиназу. Протеолитическая активность слабая: расжижает желатину, не разлагает казеин, интенсивно створаживает молоко. Cl.рerfringens образует 12 токсинов (ферментов) и энтеротоксинов. Продуцентами энтеротоксина являются бактерии типов А и С, вызывающие пищевые токсикоинфекции.
Cl.perfringens, типов В, Д, Е вызывают тяжелые энтеротоксемии у мелкого и крупного скота, а также у птиц, можно предполагать их этиологическое значение при пищевых отравлениях у людей, в случае употребления в пищу мяса животных, обсемененных штаммами этих типов.
Cl.рerfringens типа А вызывает токсикоинфекции легкой и средней степени тяжести. Заболевание развивается остро, с болями в животе, рвотой и диареей (до 20 раз в сутки). Симптомы исчезают в последующие 12-24 ч, летальные исходы наблюдаются редко. Установлено, что при пищевых токсикоинфекциях, вызываемых Cl.perfringens типа А, основную роль в патогенезе заболевания играет энтеротоксин, вырабатываемый in vivo спорулирующими клетками этих микроорганизмов, которые попадают в желудочно-кишечный тракт при интенсивном обсеменении пищевых продуктов (10⁵ и более в г/см³) указанными бактериями.
Cl.рerfringens типа С вызывает некротический энтерит. При острых формах болезнь может закончиться смертью пациента, в течение 18-24 ч. Симптомы аналогичны поражениям, вызываемым бактериями серовара А. Пищевые отравления чаще имеют место после употребления готовых мясных блюд, а также продуктов растительного происхождения, которые оказываются значительно обсемененными клетками Cl.perfringens типа А в результате нарушения правил приготовления и хранения пищи.
Критерии диагностики. При наличии клинических симптомов заболевания результаты бактериологического исследования подтверждают диагноз пищевого отравления, если получены следующие данные анализа: высокая обсемененность Cl.perfringens (более 10⁵ в г/см³) пищевых продуктов или 10⁶ в 1 г фекалий (ИНСТРУКЦИЯ 4.2.10-15-21-2006).
1.2.3 Возбудитель эмфизематозного карбункула
Эмфизематозный, или шумящий, карбункул (эмкар) вызывают Clostridium cnauvoel, это инфекционная остропротекающая неконтагиозная болезнь крупного рогатого скота в возрасте от 3 мес. до 4 лет. Иногда эмфизематозным карбункулом болеют овцы и козы. Болезнь характеризуется появлением в мышечной ткани газовых отеков, которые при надавливании крепитируют. Эмкар встречается почти во всех странах мира.
Морфология. Возбудитель имеет форму палочки с закругленными концами, ее длина 4—8 мкм, ширина 0,6—0,9 мкм (рис. 45). Клостридия Шово — перитрих. Как в культуре, так и в патологическом материале образует споры, которые придают палочке форму веретена или лимона. Молодые культуры окрашиваются по Граму положительно, старые — отрицательно.
Культивирование. Возбудитель эмфизематозного карбункула — строгий анаэроб, растет при температуре 36— 38°С. Культуру микроба выращивают на мясопептон-ном печеночном бульоне (МППБ). На среде Китта — Тароцци вначале появляется муть, затем, после оседания спор на дно пробирки, наступает ее просветление. Под вазелиновым или парафиновым маслом образуются пузырьки газа. Культура приобретает запах прогорклого масла. На глюкозокровяном агаре колонии чаще образуют зону гемолиза и возвышение в центре, напоминающее перламутровую пуговицу. Разжижает желатину. Молоко свертывает медленно. Сбраживает глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, галактозу, левулозу с образованием кислоты и газа.
Патогенность. Эмфизематозным карбункулом болеет рогатый скот. Возбудитель в организм попадает с кормом, чаще в летнее время, когда животные находятся на пастбище. Микроб из желудочно-кишечного тракта проникает в подкожную клетчатку и мышцы, где, размножаясь, образует углерода диоксид, водород и другие газы, что и обусловливает крепитацию.
Из лабораторных животных наиболее восприимчива морская свинка, она является хорошей биологической моделью' для воспроизведения болезни. Ее заражают патологическим материалом внутримышечно в области внутренней поверхности бедра. Смерть морской свинки наступает через 16—72 г. На месте инъекции мышцы темно-красного цвета, геморрагически инфильтрированы, иногда крепитируют (образование газа). Возбудитель образует токсины, которые могут вызвать гибель лабораторных и домашних животных.
Устойчивость. Споры микроба более устойчивы, чем вегетативные формы, при кипячении они сохраняются до 2 ч, при 110°С — до 40 мин, в высушенном виде — до 18 лет. Раствор сулемы (1:500) разрушает споры через 10 мин, 3%-ный раствор формалина — через 15 мин.
Микробиологический диагноз ставят комплексно: на основании микроскопии, выращивания культуры возбудителя и биологической пробы. Для исследования направляют пораженные мышцы. Из них делают препараты, посевы на среду Китта — Тароцци и готовят суспензию для заражения морской свинки. Выделение культуры возбудителя из материала от павшей морской свинки служит подтверждением правильности постановки диагноза.
Вакцинация. В настоящее время применяют концентрированную гидроокисьалюминиевую вакцину, которая была усовершенствована Ф. И. Коган и А. И. Колесовой в 1959 г. Крупному рогатому скоту и овцам вакцину вводят внутримышечно однократно в дозе 2 мл. Продолжительность иммунитета не менее 6 мес. Телятам, вакцинированным до 6-месячного возраста, вакцину вводят повторно. Против эмкара имеется сыворотка, но ее используют редко.
Лечение не всегда достигает своей цели, запаздывает, так как болезнь протекает остро. В отдельных случаях в общепринятых дозах применяют антибиотики: стрептомицин, дибиомицин, пенициллин.
1.2.4 Возбудитель столбняка
Столбняк вызывает Clostridium tetani, это раневая неконтагиоэная инфекция, известна со времен Гиппократа. Возбудитель болезни открыт в 1884 г. А. Николайераи, чистая культура получена в 1889 г. Ш. Китазато. Клиника болезни — судороги, уплотнение мышц (жевательных, туловища), искривление шеи, хвоста — следствие поражения нервной системы, образуемого микробом экзотоксином. Заражения животных и человека происходит при травмах и ранениях. Возбудитель в раны попадает из почвы, где и развивается. Токсин столбняка — один из сильных микробных ядов.
Морфология. Возбудитель столбняка — тонкая, подвижная (перитрих) палочка, длина ее 4—8 мкм, ширина — 0,4—0,6 мкм. Образует округлые споры, которые располагаются на конце клетки, придавая ей вид барабанной палочки. Ранее такие бациллы называли плектридиями.
Культивирование. Бациллы столбняка — строгие анаэробы. На среде Китта — Тароцци возбудитель растет медленно, образует газ с неприятным запахом. После оседания микробных клеток на дно пробирки среда просветляется. На агаре столбиком или желатине растет, по уколу елочкой, причем верхушка не достигает поверхности среды. Оптимальная температура роста 35—37°С.
Устойчивость. Вегетативные формы возбудителя столбняка погибают при температуре 60—70°С в течение 30 мин. Споры выдерживают нагревание до 80°С в течение 6 ч, в кипящей воде сохраняются до 40—50 мин, в высушенном состоянии — до 11 лет. При действии раствора сулемы (1:100) или 5%-ного раствора фенола споры погибают лишь через 10—12 ч.
Микробиологический диагноз на столбняк обычно не проводят, так как клиника болезни очень характерна. При необходимости из места ранения готовят мазки, делают посев на среду Китта — Тароцци, а также заражают белую мышь. Симптомы столбняка у белой мыши развиваются на 2—3-й день.
Активная иммунизация против столбняка. Иммунитет у животных и человека против столбняка (его токсина) создается путем введения анатоксина. Его готовят из нативного столбнячного токсина, в который добавляют 0,3—0,5% формалина, алюмокалиевые квасцы, фенол и выдерживают при 37°С в течение 2—3 недель.
Квасцовый (депонированный) анатоксин создает иммунитет продолжительностью от 3 до 6 лет. Его вводят крупным животным в дозе 1 мл, молодняку и мелким животным — 0,5 мл. Противостолбнячную сыворотку применяют в неотложных случаях. Действие ее наступает быстро и бывает эффективным (Ассонов, 1989).
1.3 Значение микроорганизмов рода Clostridium в промышленности
Роль микроорганизмов в микробиологической, пищевой промышленности, в сельском хозяйстве и других областях трудно переоценить. Особенно важно отметить то, что многие микроорганизмы для производства ценных продуктов используют отходы промышленного производства, нефтепродукты и тем самым производят их разрушение, предохраняя окружающую среду от загрязнения.
1.3.1 Возбудители порчи баночных консервов
Общими для всех видов консервов являются такие дефекты, как бомбаж, плоское скисание, а также дефекты тары: ржавчина, деформация корпуса, донышек, фальцов и продольного шва жестяных банок в виде острых граней, называемых "птичками", деформация и перекос крышек стеклянных банок, трещины и скол стекла, пробоины, подтеки, хлопуши. К бомбажным консервам в отличие от хлопуш, банок с вибрирующими концами относятся постоянно вздутые банки, не меняющие своего положения при нажиме на нее пальцами руки.
Бомбаж - это вздутие банок со стороны дна и крышки. В зависимости от происхождения бомбаж бывает микробиологический, химический и физический (ложный) (Ассонов, 1989).
Микробиологический бомбаж – вздутие банок газами (аммиак, сероводород), образовавшимися в результате развития термоустойчивых микроорганизмов. В процессе их жизнедеятельности образуются газы, вызывающие вздутие банки и даже нарушение герметичности, и токсины, опасные для здоровья потребителя. Бомбаж является результатом недостаточно эффективного режима стерилизации, неудовлетворительного санитарного состояния технологического оборудования, использование сильно обсемененного микроорганизмами сырья, тары, нарушение герметичности банок.
К строгим гнилостным бактериям относятся в основном почвенные клостридии: путрификус (Clostridiuum putrificum) и спорогенес (Clostridiuum sporogenes). Оба вида клостридий известны как возбудители порчи баночных консервов – мясных, рыбных.
Гнилостные микроорганизмы играют большую роль в круговороте веществ в природе, разлагая белковые вещества попадающих в почву трупов животных и растительных остатков. Минерализуя белковые вещества с образованием аммиака, они обогащают тем самым почву нужными для растений формами азота. Однако под влиянием тех же гнилостных микроорганизмов может происходить порча мяса и мясопродуктов, рыбы и рыбопродуктов, яиц, молока и других богатых белками продуктов. Одним из показателей порчи служит наличие в них продуктов распада белка (повышенное содержание аминов, NH3, H2S, жирных кислот).
Банки с микробиологическим бомбажом подлежат уничтожению или технической утилизации. Характерными признаками бомбажа, вызванного бактериями Clostridium botulinum, является образование в консервах большого количества газов, при этом может нарушаться герметичность банок, изменяться внешний вид продукта, появляться муть. Образующиеся токсины разрушаются только при кипячении более 10 мин. Токсины ботулинуса вызывают отравление, часто со смертельным исходом (до p5 %).
Порча плодоовощных консервов вызывается и другими термофильными бактериями, например Cl. soroqenes, Cl. jrasterianum, которые также выделяют много газа, но токсинов не образуют. Испорченные консервы приобретают запах прогорклого масла. Последние являются кислотоустойчивыми и могут вызывать порчу томатного сока и консервированных томатов.
Предупреждение порчи консервов указанными бактериями возможно путем соблюдения санитарно-гигиенического режима при производстве, а также подкислением консервов лимонной кислотой.
"Плоское скисание" вызывается термоустойчивыми бактериями, которые обусловливают микробиологическую порчу (брожение) продукта без газообразования и вздутия банок. Дефект можно обнаружить лишь после вскрытия банки. При этом наблюдается помутнение продукта, появление неприятных кислого запаха и вкуса, размягчение консистенции. Причинами порчи является медленное охлаждение после стерилизации, укладка в плотные штабели неохлаждаемых консервов, повышенные температуры транспортирования и хранения.
Микробиологическая порча консервов может также проявляться в виде плесневения, прогоркания, ослизнения продукта, выпадения осадка, коагуляции содержимого и других изменений продукта.
Консервы с химическим бомбажом, в которых обнаруживаются соли олова, железа, алюминия, придающие мясу металлический привкус и вызывающие изменение цвета продукта, органолептически определяют по наличию шероховатости на внутренней поверхности банки; они подлежат использованию по указанию саннадзора. Химический бомбаж отмечается в банках, имеющих внешнюю или внутреннюю коррозию. Отсутствие в этих местах защитных покрытий, контакт металла банок с продуктом приводят к взаимодействию кислот и металлов, выделению водорода. В продукте при этом накапливаются тяжелые металлы (олова и железа в банках из белой жести, хрома и железа — из хромированной жести, алюминия — из сплавов алюминия).
Физический бомбаж консервов является следствием вздутия банок в результате замораживания их содержимого, деформации корпуса или переполнения банок; такие консервы подлежат реализации по указанию саннадзора.
Физический бомбаж вызывается расширением продукта при замораживании, переполнении тары. В отличие от консервов с микробиологическим и химическим бомбажом, которые относятся к критическим дефектам и не разрешаются для реализации, консервы с физическим бомбажом реализуются с разрешения органов здравоохранения после соответствующей проверки.
Банки хлопуши и с вибрирующими концами относят к физическому, браку консервов. Хлопуши — это консервы с постоянно вздувшимися концами, приобретающими нормальное положение при нажиме, за счет чего вздувается противоположный конец (крышка) и раздается характерный щелкающий звук. Банки с вибрирующими концами приобретают вздутие на противоположном конце лишь при нажиме на них. После снятия нажима банки возвращаются в исходное положение, а вздутие исчезает.
Кроме общих дефектов, консервы могут иметь и специфические, характерные только для отдельных групп или видов. К ним относят потемнение консервов вследствие меланоидинообразования, изменение цвета при взаимодействии фенольных соединений с металлами, сульфидных групп белков с металлами (мраморность тары у зеленого горошка), помутнение сиропа, заливки у натуральных консервов, компотов и маринадов за счет размягчения сырья и перехода твердых частиц в жидкую фракцию консервов (Рогачева,1953).
1.3.2 Получение ацетона и бутанола в ходе бактериального брожения представителей рода Сlostridium
Ацетон и бутанол – единственные важные химические вещества, которые в больших количествах получают путем бактериального брожения.
Ацетоно-бутиловое брожение вызывают бактерии рода Сlostridium, а именно Сlostridium acetobutylicum и другие виды. Бутанол-изопропаноловое брожение вызывает Сl. butulicum, а масляно-уксуснокислое брожение – Сl. buturicum.
Продуценты. Почти все виды рода Сlostridium осуществляют ацетоно-бутанол-этанольную ферментацию. Но для получения растворителей используют два вида – это Сl. acetobutulicum McCoy et. al. и Сl. beijerinckii Donker. Недавно обнаружены новые виды, полезные для получения ацетона и бутанола: Сl. aurantibutyricum и Сl. tetanomorphum (группа Накамуры, Япония). Штамм Сl. tetanomorphum образует бутанол как главный продукт брожение при небольшом количестве этанола, уксусной и масляной кислоты, но не ацетона.
Споры клостридий широко распространены в почве. Большое число штаммов (240) выделено из жидкости рубца. Бактерии ферментируют глюкозу, целлобиозу, крахмал. Известны три штамма с целлюлазной активностью.
Сl. acetobutylicum – спорообразующий, облигатный анаэроб, имеет форму сигареты, размеры клеток 0,6 – 0,9 X 2,4 – 4,7 мкм. Грамположительные клетки, подвижные за счет перитрихиального жгутикования, делятся поперечной перегородкой, образуя цепочки. Хотя споры не образуют растворители, наиболее сильные спорообразователи синтезируют наибольшее количество растворителей. Сl. acetobutylicum при высеве на плотную среду образуют колонии 4 типов: I – с темным центром и свелым краем, после нескольких пассажей на богатой среде появляются колонии типа II – с коричневым центром и узкой зоной периферического роста, типа III – с коричневым центром без светлого края и типа IV – светло-коричневые без периферического роста. Способность к образованию растворителей снижается в ряду I > II > III. Колонии IV типа практически не образуют растворителей. Из колоний типа II и III реверсий к типу I не обнаруживается.
Оптимальная температура для роста 37°С, рН 6,5. Сl. acetobutylicum сбраживает крахмал, гексозы или пентозы с превращением их примерно на 30% в смесь растворителей, а остальное составляют газы Н₂ и СО₂ в соотношении 40 : 60. Смесь растворителей состоит из н-бутанола (60%), ацетона (30%) и около 5–10% приходится на этанол. Сl. beijerinckii сбраживает глюкозу и крахмал с образованием главным образом н-бутанола и в меньших количествах изопропанола и этанола. Необычный вариант Сl. saccharo-butyl-liquefaciens плохо сбраживает мелассы, но дает прекрасный выход продуктов в крахмальной среде и высокое образование бутанола; соотношение ацетон : бутанол : этанол равно 19 : 78 : 3. У Сl. toanum при росте в сахарной среде с добавлением обезжиренных рисовых отрубей выход растворителей составляет ~ 30%, а их соотношение как 52,9 (бутанол) : 42,5 (изопропанол) : 3,2 (этанол) : 1,4 (ацетон). Для производства бутанола в промышленности используют Сl. acetobutylicum. При росте, в фазе образования кислот и бутанола, одновременно из глюкозы и реассимилированного бутирата Сl. acetobutylicum образует внеклеточный полимер, который может реутилизироваться культурой как резервный источник углерода. Предположительно полимер представлен ацетилированным полисахаридом.
 Обнаружено, что промышленный штамм в конце экспоненциальной фазы роста выделяет вещество аутобактериомицин, обладающий антибиотическим действием по отношению к продуценту, а также к четырем штаммам сем. Baciallaceae. Бактериологический эффект аутобактериомицина возрастает с возрастом клеток и концентрации бутанола. Это аутолизин. Аутобактериомицин оказывает влияние на концентрацию биомассы и образование растворителей. Причем установлено, что если аутолизин прикреплен к клеточной стенке, то он играет положительную роль для роста. Если он освобождается и выделяется в среду в конце экспоненциальной фазы, то он вызывает лизис клеток. Освобождение аутолизина происходит в связи с отсутствием дивалентных катионов в среде. Если в среду добавить Mg²⁺, то увеличивается устойчивость культуры к бутанолу. Тот же результат получают с помощью ультрафильтрации, которая позволяет термально денатурировать аутолизин в течение всей ферментации.
Ингибирование синтеза бутанола аутолизином служит первостепенным ограничением типичной ацетоно-бутаноловой ферментации. Поэтому ведутся исследования по получению Lyt^–- штаммов, и один такой «без аутолизиновый» штамм получен.
Методом химического мутаногенеза нитрозогуанидином в присутствии бутанола получен мутант Сl. acetobutulicum штамм 77. У мутанта более высокая удельная скорость, в два раза больше накопление биомассы по сравнению с исходным типом. В процессе ферментации дикий штамм потребляет 65г глюкозы, образуя при этом 20 г·л ^-1 растворителей в течении 53 ч. Рост мутантного штамма менее подвержен ингибирующему действию бутанола.
Получение растворителей в промышленности. Для приготовления инокулята есть разные способы. Например, проводят тепловой шок, а затем последовательные пересевы для уничтожения вегетативных клеток, слабых спор, а также для индукции прорастания спор. Нагревание осуществляют по-разному: 100°С – 50 с, 100°С – 2 мин, 95°С – 30 мин, 80°С – 5 мин, 75°С – 2 мин и 70°С – 90 с. Считают, что увеличение времени теплового шока при каждом субкультивировании способствует отбору самых «сильных» спор и, возможно, самых активных бродильщиков. На производстве культура бактерий хранится в виде спор. Инокулят вносится в ничтожном количестве 1 : 3000, но его специальная подготовка имеет решающие значение для процесса. Замечено, что лучшими продуцентами нейтральных продуктов служат культуры, споры которых выдерживают наиболее высокую температуру. Считают, что клетки инокулята должны быть подвижными. С сильно подвижными клетками получают больше растворителей. Важно также последовательные манипуляции делать во время максимальной подвижности клеток и минимального значения рН. Если в качестве посевного материала используют клетки в стадии максимальной подвижности, то выход бутанола увеличивается 2,5 – 3 раза. Первую, вторую и третью генерации проводят в лаборатории. Для Сl. acetobutulicum первая генерация проводится в среде, приготовленной на 5% сухих злаков и без питательных добавок, при температуре 37°С в течении 24 ч. Содержимое пролбирки вносят в 300 мл мелассной или крахмальной среды с питательными добавками, налитой в колбу на 500 мл и инкубируют в течении 24 ч. Далее содержимое колбы вносят в 4-литровую колбу, содержащую 2900 мл той же среды. Одна из таких колб с культурой служит инокулятом для первого сосуда на заводе. Через колбы интенсивно продувают инертный газ и рН снижается до 3,9-4,5. Когда посевной материал переносят из колбы, количество углеводов должно быть наполовину потреблено.
Культивирование. Периодическое выращивание. При периодическом выращивании следят за уровнем источника углерода и рН. Определенный исходный уровень источника углерода обусловлен токсичностью образуемых из него продуктов. Растворители, и в первую очередь бутанол, ингибируют процесс, поэтому при периодическом выращивании редко образуются более 20 кг растворителей в 1 м³. Типичные выходы для этого режима: 0,2 – 0,6 кг/м³*ч в зависимости от субстрата и условий культивирования. Для удаления конечных продуктов ферментации в качестве экстрактантов в ферментер добавляют несмещивающиеся органические растворители. Наилучшие результаты получены при добавлении олеилового спирта и смеси олеилового спирта (50%) в бензилбензоате. В обычной ферментации в периодических условиях поглощения глюкозы приблизительно 80 кг/м³. Удаление бутанола в процессе в процессе экстракции увеличило скорость его образования, и максимальная объемная производительность по бутанолу увеличилась более чем на 60% по сравнению с обычной периодической ферментацией.
Проточное культивирование. Чтобы увеличить продуктивность и снизить цены на продукты ферментации, предложено проточное культивирование.
При одностадийном проточном культивировании с низкими скоростями протока можно одновременно достигать роста клеток и максимального превращения сахаров в растворители. Но при низких скоростях разведения, благоприятных для синтеза растворителей, возникает нестабильность процесса и достичь стационарного состояния бывает очень трудно. Для промышленного применения такой проточный процесс не подходит, так как он должен быть стабильным в течение нескольких недель или лучше нескольких месяцев. Стабильность – один из важнейших критериев непрерывного процесса.
Причину нестабильности усматривают в токсичности бутанола на клетки при его высокой концентрации и во флоккуляции бактерий. Для устранения флоккуляции клеток, которая возникает в условиях высокой концентрации растворителей, рекомендовано добавление к синтетической среде солей хлора (NaCl, KCl, CaCl₂).
При высокой концентрации растворителей стабильность ферментации можно улучшить в двустадийном проточной культуре: рост клеток оптимизируют в первой стадии, а продукцию растворителей – во второй.В оптимальных условиях такая конфигурация приводит к длительной стабильности на более чем один месяц, даже при высокой концентрации растворителя (21 г/л). При одностадийном проточном культивировании 20% глюкозы не используется клетками и остается в среде. В двустадийном процессе 87,5% глюкозы превращается в растворители. Комбинируя две техники: двустадийный проточный реактор и рециклирование клеток во втором ферментере, достигают как увеличенную продуктивность, так ихорошую стабильность с высокой концентрацией растворителей (17 г/л).
Проточный процесс ведут при лимитизации по фосфатам (или по сульфатам, но не по азоту или субстрату) в синтетической среде. Растворители образуются в пределах рН 4,3 – 4,7. Первая стадия – это индукция к синтезу растворителей, вторая – непосредственно образование растворителей. Поскольку фосфор почти полностью исчерпан ко времени второй фазы, рост клеток останавливается. При низкой концентрации протока выход растворителей в непрерывной культуре такой же, как в периодической: 0,29 г/г глюкозы.
При культивировании Сl. acetobutylicum в хемостате на синтетической среде с витаминами – биотином (0,01 мг/л) и р-аминобензойной кислотой (1 мг/л) – установили, что рост и образование растворителей лимитируется витаминами. продуктивность увеличивается в 4 раза приувеличении концентрации витаминов в среде. В строго анаэробных условиях выход растворителей в 1,5 раза выше, чем при доступе воздуха. В оптимальных условиях продуктивность растворителей равна ~2,0 г/л·ч.
Среды. Ферментация. Используют три типа сырья как источников углерода и энергии: зерно (крахмал), паточную (неочищенную мелассу) и очищенную мелассу. В качестве субстратов будущего рассматривают различные отходы, гидролизованную древесину, гидролизаты отбросов, сыворотку, сульфитные жидкости: гидрол – побочный продукт производства глюкозы из зерна. Среды из зернового крахмала готовят следующим образом. Мука вносится в количестве 60% к воде, туда же добавляют сброженным остаток ферментации после отгонки растворителей. Конечная концентрация должна составить 8,5% исходного зерна.
При использовании мелассы концентрация сахара должна быть 5,5-7,5%. К среде добавляют суперфосфат и аммоний. Последний вносят постепенно в случае очищенных меласс для поддержания рН на уровне 5,6–6,0 в количестве 2,2–1,3% NH₃ по отношению к концентрации сахара или сразу в случае паточных меласс, которые сильно забуферены. В среду вносят 25–50% горячего остатка после отгонки растворителей. Это увеличивает выход растворителей, снижает количество добавляемых питательных веществ, сокращает затраты на нагревание и дает большую экономию пара, необходимого для выпаривания остатка. Ферментер и среду стерилизуют. Брожение протекает под избыточным давлением газов для создания анаэробных условий. Начальный рН 6,0, который снижается до ~ 5,4 через 24 ч.
Концентрация растворителей (при использовании крахмальной среды) через 50–56 ч ферментации 22,5 г/л, а соотношение ацетона, бутанола и этанола 30 : 60 : 10. Ферментация в мелассных средах завершается за 40–45 ч, а в крахмальных (с питательными добавками) – за 50–60 ч, в крахмальной без питательных добавок за 70–80 ч. Проточное выращивание бактерий ведется с работой серии из пяти ферментеров. За 18 дней получают продуктивность в 3 раза выше, чем при периодическом культивировании, но выходы растворителей низкие в связи с высоким образованием кислот в начальной фазе.
Выделение продуктов. Дистилляция – традиционный способ выделения этанола, ацетона, бутанола из разведенных водных растворов. При дистилляции продуктов ацетоно-бутилового брожения можно использовать тепло, выделяющиеся при охлаждении стерилизованного нагреванием ферментера. Дистилляция – достаточно гибкий процесс, при котором возможно фракционирование и выделение каждого продукта.
Более современными методом выделения продуктов являются мембранные процессы, например ультрафильтрация и обратный осмос. Выделение продуктов проводятся по принципу первапорации; это мембранный процесс, в котором движущей силой служит большой вакуум с одной стороны мембраны, свойства которой определяют эффективность разделения.
Хорошие результаты получают при селективной адсорбции растворителями на силикате (цеолите). Этот процесс можно интегрировать с ферментацией и работать с боле концентрированными растворами. Комбинирование ферментации и выделения продуктов возможно только при проточном культивировании. Возможно применение химического выделения. Это новый метод, основанный на обратимой химической реакции.
Хотя многие из перечисленных методов применяют в лабораториях и на пилотных установках, в большой промышленности они не внедрены в силу недостаточности данных или высокой стоимости. Наиболее реально внедрение в промышленность способа предварительного удаления воды (обратный осмос) с последующей традиционной дистилляцией (Воробьева, 1989).
 
1.4 Применение ботулинического токсина в медицине
О существовании ботулинического токсина было известно на протяжении сотен лет, однако его благотворное воздействие было оценено по достоинству лишь в последние десятилетия. В 1895 году бельгийский профессор Эмиль Пьер Ван Ерменгем (Emile Pierre van Ermengem) из городка Элизель, Бельгия, идентифицировал бактерию Bacillus botulinus. Эта бактерия, впоследствии переименованная в Clostridium botulinum, производит нейротоксин, который является основной частью комплекса токсина ботулизма типа А.
В 1946 году доктор Эдвард Шанц (Edward J. Schantz) и его коллеги получили очищенный токсин ботулизма типа А в кристаллической форме. Таким образом, у исследователей впервые появился необработанный материал, который был необходим им для более детального изучения. Первый серьезный результат исследований появился в 1950-х годах, когда доктор Вернон Брукс (Vernon Brooks) обнаружил, что при введении в гиперактивную мышцу токсин ботулизма типа А блокирует высвобождение ацетилхолина из окончаний двигательных нервов, вызывая тем самым временное расслабление инъецированной мышцы. Открытие доктора Брукса вызвало новый интерес к ботулиническому токсину как к потенциально значимому терапевтическому средству.
В 1960-1970-х годах офтальмолог Алан Скотт (Alan B. Scott) из Центра исследования глаза Смита Кеттлуэлла (Калифорния,США) провел на приматах ряд опытов по введению токсина ботулизма типа А для лечения косоглазия. Целью опытов было определить возможность применения препарата для лечения косоглазия типа «офтальмологической дистонии» у людей.
В конце 1970-х годов доктор Скотт организовал собственную компанию - Oculinum, Inc., где продолжил изучение токсина ботулизма типа А. В 1978 году доктор Скотт получил разрешение FDA (Управления по контролю за продуктами и лекарствами) на исследование использования ботулинического токсина типа А на людях-добровольцах.
В 1988 году компания Allergan приобрела права на распространение разработанного доктором Скоттом препарата Oculinum, основанного на токсине ботулизма типа А, и проведение клинических исследований эффективности препарата при других показаниях, включая цервикальную дистонию.
В 1989 году компания Oculinum, Inc. получила разрешение FDA на продажу препарата Oculinum в США, как препарата для лечения косоглазия и блефароспазма, включая идиопатический блефароспазм или нарушение VII нерва у пациентов в возрасте от 12 лет.
Вскоре после этого компания Allergan Inc. приобрела компанию доктора Скотта. На основе успешного применения токсина ботулизма типа А в лечении косоглазия и блефароспазма, связанных с дистонией, компания Allergan получила разрешение FDA на изменение названия препарата на BOTOX®. Эта замена названия отразила стратегию Allergan, касающуюся развития других областей применения препарата.
BOTOX® используется в России уже более 10 лет с момента его первой регистрации в 1994 году для лечения блефароспазма и гемифациального спазма. В течение последних 10 лет неизменно возрастало количество показаний для применения BOTOX®. В настоящее время они включают цервикальную дистонию, детский церебральный паралич, спастичность, возникшую в результате инсульта, и подмышечный гипергидроз.
Перед употреблением нейротоксин ботулизма проходит специальную очистку и связывается с альбуминами. Такая связь делает токсин более устойчивым, сохраняет его биологическую активность, обеспечивает локальное действие препарата. Нейротоксин блокирует передачу двигательного импульса с нерва на мышечное волокно. После введения препарата наступает выраженное расслабление мимических мышц. Атрофии мышц не наблюдается, так как их кровоснабжение остаётся прежним. В среднем максимум терапевтического эффекта проявляется на 14-15 день. Нейротоксин блокирует передачу импульса не только на мышцы, но и на потовые железы и, т.о., уменьшает потоотделение. Препараты успешно применяются для лечения повышенного потоотделения на ладонях, в подмышечных впадинах и на стопах.
Продолжительность действия составляет 6-9 месяцев, иногда — до 1 года. Подвижность мускулатуры частично восстанавливается через 3-4 месяца, полное восстановление наблюдается через 5-8 месяцев. После повторных инъекции продолжительность эффекта доходит до 6-12 месяцев. Для достижения стойкого и длительного эффекта рекомендуется введение препаратов 2-3 раза в течение года. При местном введении в терапевтических дозах ботулинический токсин типа А не вызывает системного (на весь организм) действия, продолжительность лечения им неограниченна.
Относительные противопоказания: миастения, нарушения свёртываемости крови, воспалительный и/или инфекционный процесс в областях предполагаемых инъекций, общие заболевания в стадии обострения, приём лекарственных средств (антибиотиков, антикоагулянтов, антиагрегантов, реланиума, баклофена), хронические обструктивные заболевания лёгких, беременность и период грудного вскармливания, возраст младше 12 лет, нежелательно проводить процедуру в первые дни менструального цикла.
Возможные осложнения, такие как обратимое опущение верхнего века(частота возникновения 0,14%), опущение бровей (менее 1%), двоение в глазах (2%), отёк век (0,14%), не связаны с самими препаратами, они могут возникнуть при неправильном выборе способа и места введения, неадекватной дозе или при несоблюдении стерильности. Важно помнить, что все они бесследно исчезают со временем. Побочные эффекты: болезненность в месте инъекции (частота возникновения 1,3%), головная боль (2%), кровоизлияния в месте введения (6%), онемение в месте инъекции (менее 1%), аллергия (менее 1%). Нечувствительность к нейротоксину встречается редко (менее 0,1%) (www. BOTOX.com).
Род Clostridium включает анаэробные, грамположительные спорообразующие палочки, широко распространенные во внешней среде. Они обнаруживаются в почве, отложениях морских и пресных вод, кишечном тракте людей и животных. Представители рода могут быть патогенны для человека и животных, вызывая раневую инфекцию или кишечные заболевания, однако находят и практическое применение в промышленности (в парфюмерной промышленности, для получения в промышленном масштабе ацетона и бутанола), в медицине (для лечения блефароспазма, гемифациального спазма, цервикальной дистонии, детского церебрального паралича, спастичности, возникшей в результате инсульта, и подмышечного гипергидроза). Описано много видов, их количество в настоящее время превышает 100, однако многие из них остаются слабо изучены (Пивоваров, 2000).

Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1 Объекты исследования
Использовались различные объекты, такие как почва из ясеневого леса и поля, растительные волокна, а также пищевые продукты, а именно консервы: килька в томатном соусе и баклажанная икра.
2.2 Выявление мезофильных анаэробных микроорганизмов
(ГОСТ 10444.4)
Метод предназначен для определения стерильности и промышленной стерильности консервов, для выяснения причин возникновения дефектов консервов.
Проведение анализа. Для выявления анаэробных микроорганизмов посев производится в две пробирки со средой Китта-Тароцци с добавлением 0,15% агара. Непосредственно перед посевом агаризованную (полужидкую) среду Тароцци прогревают 25 мин в кипящей водяной бане и затем быстро охлаждают до температуры 30-40°С. Засеянные пробирки помещают в термостат. Термостатирование посевов консервов с рН выше 4,4 проводят при 37±0,5°С, контролируя ежедневно в течение 5 суток появления в них признаков роста микроорганизмов. Развитие мезофильных анаэробных микроорганизмов в посевах сопровождается помутнением среды, выделением газа, появлением посторонних запахов (гнилостный, сырный, маслянокислый), в некоторых случаях разложением печени, реже почернением среды.
Муть появляется почти по всей толще столбика, иногда отступая от его поверхности на 0,5 – 1,0 см. в дальнейшем клетки мезофильных анаэробных микроорганизмов оседают на дно и помутнение может исчезнуть.
При исследовании под микроскопом мазков из культуры 18-24 возраста можно обнаружить палочки, положительно окрашивающиеся по Грамму и образующие споры. Количество палочек со спорами невелико, а при выявлении Cl. perfringens споры обычно отсутствуют. Для подтверждения принадлежности выявленных спорообразующих микроорганизмов к мезофильным облигатным анаэробам из рода клостридиум проверяют отсутствие в них каталазы. Если в посевах обнаружены спорообразующие грамположительные микроорганизмы, но каталаза не выявлена, то анализ на выявление прекращают и считают, что в посевах присутствуют мезофильные облигатно-анаэробные микроорганизмы из рода клостридиум.
Если при микроскопировании посевов спорообразующие микроорганизмы не обнаружены, то отрицательная проба на каталазу не является достаточной для заключения о присутствии в посевах мезофильных облигатно-анаэробных микроорганизмов и анализ продолжают. Анализ на выявление мезофильных облигатно-анаэробных микроорганизмов продолжают в случае присутствия в посевах смешанной микрофлоры и положительной пробы на каталазу.
После появления признаков роста. из посевов 1 мл переносят в стерильную пробирку и заливают расплавленным агаром температурой не более 45 °С. Пробирку заливают до верха и закрывают пробкой так, чтобы не осталось пузырьков воздуха. Посевы термостатируют 24-48 часов при 37 ± 0,5°С. При обнаружении разрывов в агаре считают, что в посеве присутствуют мезофильные облигатно-анаэробные микроорганизмы (методическое указание, АГТУ,1998).
2.3. Выявление термофильных анаэробных микроорганизмов
( ГОСТ 10444.6)
Метод предназначен: для определения стерильности или промышленной стерильности консервов, предназначенных к реализации в условиях с температурой 30°С и выше; для выяснения причин возникновения дефектов томатопродуктов и консервов с рН выше 4,6.
Сущность метода: выявление в консервах жизнеспособных термофильных анаэробных микроорганизмов размножаться при температуре 55 °С и давать рост на жидких питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. В жидких питательных средах Cl. termosaccharolyticum вызывает обильное газообразование, помутнение среды и ее подкисление.
Проведение анализа. Непосредственно перед посевом питательную среду (Китт-Тароцци) регенерируют, прогревая ее 25 мин в кипящей водяной бане и быстро охлаждая до 40 °С.
Для установления промышленной стерильности и при выявлении возбудителей порчи по 2 см³ пробы высевают в две пробирки с 12-13 см³ регенерированной питательной среды (стерильности по 30 см³ в три флакона с 200 см³ питательной среды).