б. ДНК-зависимые РНК-полимеразы
У прокариот синтез всех видов РНК–мРНК, рРНК и тРНК, а также более специализрованных РНК, участвующих в процессинге РНК, – катализируется единственной ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Бактериальные РНК-полимеразы – это сложные белки, состоящие из нескольких разных субъединиц. Наиболее изученный фермент – холофермент РНК-полимераза Е. coli – содержит пять разных полипептидных субъединиц: две а-цепи, одну в- и одну в'-цепи, а- и ю-цепи. Альтернативная, сосуществующая с первой форма фермента, называемая кором, лишена а-субъединицы.
Единицами холофермента изучена роль а-субъединицы. Корфермент, лишенный а-субъединицы, катализирует большинство реакций, необходимых для транскрипции ДНК с образованием РНК, а именно комплементарное копирование матричной цепи, образование фосфодиэфирных связей и терминацию цепи РНК. Однако он не может инициировать синтез РНК в нужном месте, поскольку не способен узнавать промоторные сайты. Точное связывание и инициация в промоторах происходят только после добавления к корферменту а-субъединицы и образования холофермента. Такое поведение можно объяснить, например, тем, что корфермент очень прочно, но неспецифично связывается с ДНК, а поэтому редко оказывается в том месте, где находится промотор. И напротив, холофермент связывается с неспецифическими участками ДНК непрочно и, последовательно связываясь с разными областями ДНК, находит промотор и прочно связывается с ним. После образования нескольких первых фосфодиэфирных связей а-субъединица отделяется от инициирующего комплекса, и дальнейшая транскрипция осуществляется с помощью корфермента. Транскрипция непрерывно продолжается до тех пор, пока фермент не достигнет сайта терминации транскрипции. Итак, а-субъединица обеспечивает эффективное связывание холофермента с промотором, а при ее отсоединении полимераза переключается на элонгацию. А-Субъединица может снова стимулировать инициацию, специфически связавшись с другой молекулой РНК-полимеразы.
Имеются данные о том, что способность РНК-полимеразы узнавать промотор может изменяться при связывании с разными а-субъединицами. Так, после заражения Bacillus subtilis определенными бактериофагами или на ранних стадиях спо-руляции экспрессируются разные а-субъединицы и в результате изменяется порядок транскрипции клеточных и вирусных генов. Использует ли РНК-полимераза других прокариот различные а-субъединицы для регуляции промоторной специфичности, пока неизвестно.
Не все РНК-полимеразы прокариот представляют собой мультисубъединичные ферменты. РНК-полимеразы, кодируемые бактериофагами Т3 и Т7 Е. coli, – это одиночные полипептидные цепи средней длины. Эти ферменты высокоспецифичны в отношении промоторных сайтов, используемых для транскрипции определенного набора вирусных генов. Такие «упрощенные» ферменты обладают всеми активностями мультисубъединичных РНК-полимераз. Они катализируют синтез РНК на ДНК-матрицах и осуществляют правильную терминацию цепей РНК.
в. Транскрипция инициируется в особых нуклеотидных последовательностях
Транскрипция инициируется при образовании стабильного комплекса между холоферментом и специфической последовательностью, называемой промотором и располагающейся в начале всех транскрипционных единиц. Изучение нуклеотидной последовательности более чем 50 разных промоторных сайтов прокариот и мутационный анализ выявили только два консервативных участка, по-видимому играющих ключевую роль в узнавании и функционировании промотора. Одна из этих последовательностей состоит из шести или семи пар оснований и расположена на расстоянии примерно 10 оснований до того нуклеотида, с которого начинается транскрипция; этот сигнал обычно обозначают как –10-последовательность. Сравнительный анализ 10-последовательностей примерно 50 промоторов прокариот показал, что все они немного отличаются от консенсус-последовательности ТАТААТ. Подчеркнутый Т присутствует почти во всех промоторах, тогда как по другим позициям в каждом промоторе может наблюдаться от одного до нескольких вариантов.
Вторая последовательность, длина которой обычно равна девяти нуклеотидам, расположена на расстоянии ~ 35 оснований до сайта инициации и также встречается в большинстве промоторов прокариот. Нуклеотидная последовательность сегмента между –35- и –10-участками не является критической, важно лишь расстояние между этими участками. –35-последовательность участвует в связывании РНК-полимеразы, которое предшествует перемещению фермента в Прибновбокс. Возможно, РНК-полимераза вызывает локальное раскручивание спирали, начиная этот процесс с Прибновбокса, и создает условия для инициации синтеза РНК.
Однако остается открытым вопрос, достаточно ли простого связывания РНК-полимеразы с промотором для локального расхождения цепей вблизи сайта инициации синтеза РНК или РНК-полимераза расплетает спираль в стартовом сайте. Независимо от механизма образование «открытого» промоторного комплекса позволяет РНК-полимеразе осуществить спаривание первого и второго рибонуклеозид-трифосфатов с матричной цепью и катализировать образование первой фосфодиэфирной связи.
Различия в эффективности транскрипции индивидуальных генов отчасти зависят от структуры их промоторов. Как прочность взаимодействия РНК-полимеразы с промоторной последовательностью, так и эффективность образования «открытого» промоторного комплекса определяются конкретными нуклеотидными последовательностями –35- и –10-участков соответственно. Мутации в этих участках приводят к значительным изменениям способности многих промоторов обеспечивать инициацию транскрипции. В некоторых случаях инициацию транскрипции в малоэффективных промоторах облегчают вспомогательные белки, связывающиеся с ДНК вблизи –35-последовательностей. Суть подобного феномена до конца не выяснена, но известно, что иногда белки, связывающиеся с –35-последовательностью, увеличивают вероятность того, что она будет обнаружена РНК-полимеразой и свяжется с ней. Связывание белков-активаторов может привести также к изменению структуры ДНК и тем самым способствовать инициации транскрипции. Изменение топологической структуры ДНК – особенно увеличение числа отрицательных сверхвитков – также может приводить к повышению или снижению эффективности некоторых промоторов.
г. Терминация транскрипции и отделение цепей РНК
Последовательности ДНК, являющиеся сигналами остановки транскрипции, называются транскрипционными терминаторами. Обнаружены два типа сигналов терминации – р-зависимый и р-независимый терминаторы. Оба они имеют некоторые общие признаки. И тот и другой содержат инвертированные повторы, благодаря чему 3'-концы РНК-транскриптов складываются с образованием шпилек разной длины. Стебли шпилек р-независимых терминаторов обычно содержат GC-богатые участки; один из них находится вблизи основания стебля, и к нему примыкает участок, состоящий из четырех-шести уридиловых и одного-двух адениловых остатков. В стебле р-зависимых терминаторов, напротив, содержится лишь несколько GC-пар, а уридиновые 3'-хвосты могут отсутствовать.
Точный механизм р-независимой и р-зависимой терминации транскрипции является пока предметом дискуссий. Наиболее вероятным представляется следующее объяснение р-независимой терминации: РНК-полимераза останавливается после транскрипции инвертированного повтора, потому что шпилечная структура оказывается помехой. В результате сразу после остановки процесса РНК отделяется от матричной цепи вблизи U-богатого участка, который относительно слабо спарен с А-богатым участком матрицы. Этим, по-видимому, объясняется то обстоятельство, что наиболее часто на конце цепи РНК находятся уридиловые или адениловые остатки.
Р – это олигомерный белок, прочно связывающийся с РНК и в этом состоянии гидролизующий АТР до ADP и неорганического фосфата. В одной из моделей действие р-белка объясняется тем, что он связывается с синтезируемой цепью РНК и перемещается вдоль нее в направлении 5' – >3' к месту синтеза РНК; необходимая для его перемещения энергия выделяется при гидролизе АТР. Если р-белок наталкивается на образующуюся в РНК шпильку, он останавливает полимеразу, которая могла бы продолжать транскрипцию. Возможно, для отсоединения РНК от матрицы достаточно этой р-индуцированной остановки, но не исключено, что диссоциации и отделению способствует сам р-белок.
Терминация транскрипции редко является абсолютно зависимой или абсолютно независимой от р-белка. Некоторые р-независимые терминаторы работают в присутствии р более эффективно. А в некоторых условиях так называемые р-зависимые терминаторы вызывают терминацию и в отсутствие р, хотя и не столь успешно.
Терминация, как и инициация синтеза РНК, является регулируемым процессом. Существуют белки, функционирующие как антитерминаторы и предотвращающие терминацию в р-независимых терминаторах; известны также другие белки, ингибирующие р и тем самым обеспечивающие удлинение цепи после сигналов терминации. При определенных обстоятельствах молекулы РНК могут образовывать альтернативные шпилечные структуры на особых последовательностях определенных участков ДНК. Одни из таких структур могут приводить к абортивной терминации, а другие – к продолжению транскрипции.
3. Процессинг РНК у прокариот
Первичные транскрипты, образующиеся при транскрипции прокариотических генов, кодирующих белки, функционируют в качестве мРНК без последующей модификации или процессинга. Действительно, трансляция мРНК часто начинается даже до завершения синтеза 3'-конца транскрипта. Совсем иная ситуация наблюдается для молекул рРНК и тРНК. В этом случае кластеры рРНК-или тРНК-генов или даже перемежающиеся участки этих генов часто транскрибируются с образованием единой цепи РНК. И хотя транскрипция этих генов всегда начинается на определенных промоторах и заканчивается на определенных терминаторах, для образования зрелых функциональных форм должны произойти специфическое надрезание первичных РНК-транскриптов и модификация. Подобные молекулярные события называют общим термином посттранскрипционные модификации или просто процессинг РНК. Механизмы процессинга рРНК и тРНК и ферменты, с помощью которых он осуществляется, наиболее полно изучены у Е. coli, и для иллюстрации особенностей посттранскрипционного процессинга РНК мы используем эту систему. Аналогичные модификации эукариотических РНК; в этом случае помимо процессинга рРНК и тРНК используются более сложные системы созревания транскриптов с образованием мРНК.
а. Группы генов, кодирующих рРНК и тРНК
В геноме Е. coli идентифицированы и картированы семь дискретных транскрипционных единиц, кодирующих рРНК. Каждая транскрипционная единица – это молекула РНК, которая состоит из ~5000 нуклеотидов и содержит по одной копии кодирующих последовательностей для 5S-, 16S- и 23S-pPHK. Транскрипция в этой области осуществляется в направлении 16S –> 23S –> 5S. Помимо этих трех последовательностей, кодирующих рРНК, транскрипты содержат вставки разной длины и одну или более копий тРНК-генов. Спейсеры могут находиться перед последовательностями для рРНК, между ними и после них, а тРНК-гены обычно лежат в пределах вкрапленных или 3'-концевых спейсерных сегментов. Для образования функционально зрелых молекул РНК должен произойти процессинг таких транскриптов. До процессинга или во время него происходит модификация специфических оснований в спейсерах, а также в рРНК- и тРНК-генах.
б. Разрезание рРНК-тРНК-котранскриптов
Начальное расщепление первичных транскриптов на фрагменты, содержащие либо тРНК, либо 16S-, 23S- или 58-рРНК-последовательности, осуществляет эндонуклеаза РНКаза III. Ее мишенями служат короткие дуплексы РНК, образующиеся при внутримолекулярном спаривании оснований в последовательностях, фланкирующих каждый из рРНК-сегментов. Например, комплементарные участки в спейсерных областях, фланкирующих последовательность 16S-pPHK, образуют стебель шпильки, в петле которой находится последовательность 16S-pPHK. Аналогичные шпильки образуют и последовательности 23S- и 5S-pPHK. РНКаза III вносит разрывы в двухцепочечный стебель, в результате образуется цепь РНК, содержащая последовательность той или иной рРНК, фланкированную короткими спейсерными участками с 5'-фосфатным и 3'-гидроксильным концами. Затем лишние нуклеотиды спейсерных последовательностей удаляются, возможно с помощью той же самой РНК-экзонуклеазы, которая катализирует и последние этапы процессинга тРНК. В принципе для того, чтобы произошло ферментативное расщепление, должны быть транскрибированы только те нуклеотидные последовательности, которые образуют шпильки. Однако процессинг происходит лишь после завершения синтеза всего первичного транскрипта, поскольку, по-видимому, для правильной укладки целого РНК-транскрипта, который и распознается эндонуклеазой III, необходимы рибосомные или какие-либо другие белки. Процессинг тРНК-сегментов, выщепляющихся из мультигенных транскриптов, осуществляется так же, как и процессинг тРНК из транскрипционных единиц одиночных генов.
в. Образование зрелых тРНК из более крупных транскриптов
Несмотря на то, что некоторые кодирующие тРНК гены находятся внутри транскрипционных единиц рРНК и экспрессируются совместно с генами рРНК, основная часть тРНК-генов представлена одиночными генами или объединена в кластеры. Одни кластеры содержат множественные повторы одних и тех же генов, другие – различные и неродственные тРНК-гены. В некоторых случаях каждый кластер транскрибируется как одна большая молекула РНК, которая подвергается процессингу с последовательным выщеплением зрелых тРНК-фрагментов. Для образования зрелой функциональной тРНК, по-видимому, должны произойти специфическая модификация оснований и присоединение одного, двух или всех трех нуклеотидов 3'-ССА-конца.
Независимо от того, содержит ли первичный транскрипт одну или более тРНК-последовательностей или эти последовательности внедрены в спейсерные участки рРНК, 5'-концы всех тРНК образуются при участии одной эндонуклеазы, называемой РНКазой Р. По-видимому, РНКаза Р узнает характерную свернутую структуру тРНК в полинуклеотиде-предшественнике и отщепляет лидерную или спейсерную последовательности, расположенные перед 5'-концом зрелой последовательности тРНК. 3'-концы тРНК образуются с помощью нескольких активностей. До сих пор неидентифицированная эндонуклеаза расщепляет предшественник в том месте шпильки, где находится 3'-конец зрелой тРНК, а затем другая эндонуклеаза, РНКаза D, завершает образование правильного 3'-конца. В некоторых случаях экзонуклеазное расщепление прекращается точно у 3'-ССА-конца зрелой тРНК, а в других случаях под действием экзонуклеазы образуется конец, служащий затравкой, к которому тРНК-нуклеотидилтрансфераза добавляет один или более инвариантных концевых нуклеотидов.
Отличительной особенностью РНКазы Р является то, что сайт расщепления для нее формируется в результате правильной укладки молекулы тРНК. Изменения в нуклеотидной последовательности, не приводящие к нарушению этой укладки, не сказываются и на процессинге 5'-конца. Другим необычным свойством РНКазы Р является то, что она состоит из белка и РНК. Эта РНК имеет специфическую последовательность из 377 нуклеотидов и сама транскрибируется РНК-полимеразой с гена чуть большего размера и затем подвергается процессингу до размера зрелой молекулы. Удивительной особенностью этой РНК оказалось то, что она одна может катализировать такую же эндонуклеазную реакцию, что и целый рибонуклеопротеин; белок же не обладает самостоятельной эндонуклеазной активностью. Таким образом, эндонуклеазная активность может быть присуща самой РНК, а белок, по-видимому, необходим для сохранения структуры РНК в максимально активной конфигурации.
Зрелые тРНК не только имеют характерную конформацию, но и содержат модифицированные нуклеотиды. Многие из таких модификаций оказываются существенными для выполнения некоторых физиологических функций тРНК. Сегодня охарактеризованы лишь немногие из целой армии ферментов, катализирующих огромное количество реакций модификации. Однако ясно, что модификации происходят в основном на стадии РНК-предшественника и в полностью процессированной тРНК. Такие модифицирующие ферменты представляют особый интерес благодаря своей необычной специфичности в отношении определенных последовательностей: например, только отдельные урациловые остатки превращаются в тиоурацил, метилируются до тимина или восстанавливаются до дигидроурацила. Еще более загадочным представляется образование псевдоуридилата при модификации обычной связи между урацилом и рибозой.
4. Генетический код
Последовательность аминокислот в белках определяется порядком расположения дезоксинуклеотидов в генах, кодирующих белки, точнее – последовательностью рибонуклеотидов в мРНК-транскриптах. Информационная связь между нуклеотидными и аминокислотными последовательностями осуществляется с помощью генетического кода. Для составления генетического словаря было проведено множество специальных генетических и биохимических экспериментов. Он включает также и знаки препинания – начало и конец участков, кодирующих белки. За исключением незначительных вариаций в использовании нескольких нуклеотидов для кодирования особых аминокислот у митохондрий и некоторых инфузорий, генетический словарь универсален, т.е. конкретная последовательность нуклеотидов задает одинаковую для всех живых организмов аминокислотную последовательность.
Наличие подобной системы кодирования подразумевает существование некоего механизма для перевода информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот. Как и следовало ожидать, этот механизм и реакции, осуществляющие перевод, очень сложны. Несмотря на различия между про- и эукариотами как в том, что касается структуры мРНК, так и в физическом взаимоотношении генов и аппарата трансляции, оба типа организмов используют весьма сходные механизмы для расшифровки генетических посланий.
а. Аминокислотная последовательность белков соответствует нуклеотидной последовательности кодирующих их генов
Предположение о коллинеарности нуклеотидных и аминокислотных последовательностей было высказано в числе первых в дискуссии о природе генетического кода. Догадки такого рода возникли после того, как было показано, что многие мутации проявляются в замене одной-единственной аминокислоты в белках бактерий, растений или животных. Но гипотеза коллинеарности оставалась неподтвержденной до тех пор, пока не были проведены тщательные генетические и биохимические исследования хорошо охарактеризованных генно-белковых систем. Например, было показано, что относительное положение аминокислотных замен в а-субъединице триптофансинтетазы Е. coli согласуется с относительной локализацией на карте соответствующих мутаций в trpA-гене этого микроорганизма. Однако выделить и охарактеризовать мутантную ДНК в то время не удалось, поэтому нельзя было установить соответствие между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными.
Теоретический анализ привел к предположению, что наиболее подходящей по размеру для генетической кодирующей единицы, или кодона, является последовательность из трех нуклеотидов. В основе этого вывода лежали три соображения. Во-первых, четыре нуклеотида, взятые по одному, могут кодировать только четыре разные аминокислоты. Сочетания из двух нуклеотидов могут кодировать только 4², или 16 аминокислот, а это меньше, чем те 20 аминокислот, которые, как было известно, присутствуют в белках. И только совокупности трех нуклеотидов дают 64 возможных кодона, т.е. число, более чем достаточное для кодирования 20 разных аминокислот. Генетические эксперименты, выполненные на мутантах с делециями или вставками длиной один, два или три нуклеотида в генах, кодирующих белки, позволили доказать, что наиболее подходящий размер для кодона – три нуклеотида. Более того, из этих исследований был сделан вывод, что нуклеотидная последовательность считывается расположенными один за другим триплетами с фиксированной точки. Все эти выводы наряду с данными о том, что полипептидные цепи синтезируются последовательно путем соединения аминогруппы одной аминокислоты с карбоксильной группой другой, послужили краеугольным камнем в расшифровке генетического кода.
б. Соответствие между аминокислотами и их кодонами
Одним из загадочных моментов кодирования было отсутствие структурной комплементарности между нуклеиновыми кислотами, с одной стороны, и аминокислотными цепочками – с другой. Выход из этого концептуального тупика–ответ на вопрос, как аминокислоты спариваются с соответствующими кодонами, – был найден, когда появилась идея о существовании адаптора. Согласно этой идее, аминокислоты сначала связываются с молекулами РНК, а затем такие гибриды выстраиваются вдоль мРНК, соединяясь с ней путем комплементарного спаривания нескольких оснований в адапторной молекуле РНК с соответствующим кодоном в мРНК. Адапторная гипотеза получила строгое экспериментальное подтверждение после того, как были обнаружены тРНК и ферменты, ответственные за связывание аминокислот и тРНК, и показано, что присоединенные к тРНК аминокислоты являются прямыми предшественниками при сборке полипептида.
Если тРНК – это адапторы, то каждая аминокислота должна присоединяться только к специфической тРНК, а каждая тРНК – спариваться только с одним, соответствующим ей кодоном. Правильность первого из этих положений была доказана с открытием особых ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз, каждый из которых связывает одну-единственную аминокислоту с одной или несколькими родственными тРНК. Эти ферменты и катализируемые ими реакции более детально будут рассмотрены в разд. 3.5.а. Здесь достаточно сказать, что связывание аминокислот с молекулами тРНК – это первый шаг в процессе расшифровки. Правильность второго положения адапторной гипотезы – о том, что тРНК сама определяет место своей аминокислоты в полипептидной цепи – была подтверждена с помощью простого эксперимента. Одна из аминокислот, будучи связанной с соответствующей тРНК, была химически превращена в другую. После включения этой модифицированной аминокислоты в белок in vitro была установлена ее локализация в белковой цепи. Оказалось, что после превращения цистеинил-тРНК в аланил-тPHK остаток аланина, связанный с тРНК, обнаруживается в тех сайтах белковой цепи, которые обычно занимает цистеин, а не в сайтах, где обычно находится аланин. Стало ясно, что именно тРНК с присоединенной к ней аминокислотой, а не сама аминокислота определяет, с каким кодоном должно произойти спаривание.
в. Расшифровка генетического кода
Предпосылками для расшифровки кода послужили два открытия. Во-первых, было установлено, что мРНК – это информационный посредник между генами и белками. Во-вторых, обнаружилось, что мРНК, введенная в бактериальные экстракты, транслируется с образованием соответствующих белков. Прорыв в этой области произошел, когда с помощью экстрактов из клеток Е. coli была осуществлена трансляция синтетических РНК-полиуридилата, полиаденилата и полицитидилата – с образованием полифенилаланина, полилизина и полипролина соответственно. Это привело к заключению, что триплеты, состоящие только из U, А и С, кодируют соответственно фенилаланин, лизин и пролин. Затем были проделаны эксперименты с применением смешанных полимеров с варьирующим соотношением двух и трех нуклеотидов; в результате был определен состав кодонов. Однако эти данные позволили установить лишь нуклеотидный состав кодонов, но не порядок следования нуклеотидов в них. Все кодоны были в конце концов идентифицированы при помощи следующих двух экспериментов. В экспериментах первого типа сравнивали аминокислотную последовательность полипептидов, полученных in vitro с использованием синтетических мРНК, содержащих определенные повторы из двух или трех нуклеотидов. В экспериментах другого типа определяли, какая именно из аминоацил-тРНК связывается с рибосомами в присутствии каждого из возможных тринуклеотидов. Эти эксперименты позволили составить непротиворечивый словарь, в котором 61 трехнуклеотидный кодон соответствует 20 аминокислотам, а три кодона – окончанию кодирующей последовательности. В коде заложена некая неоднозначность, которая связана с точкой начала трансляции, а не с соответствием кодон-аминокислота. Эта неоднозначность обусловлена наличием альтернативных наборов триплетов, или рамок считывания, для любой полинуклеотидной последовательности. Большинство прокариотических генов транслируется при одной непрерывной рамке считывания; при альтернативных рамках на каждые 20 нуклеотидов приходится в среднем по одному терминирующему кодону.
В экспериментах по расшифровке кода, описанных выше, синтетические полинуклеотиды транслировались в условиях, не требующих точной инициации. Однако in vivo и в соответствующих условиях in vitro инициация происходит только с правильной рамкой считывания. Однозначность прочтения белок-кодирующей последовательности обеспечивается тем, что трансляция мРНК начинается только со специфического триплета – AUG, и далее расшифровывается каждый последующий триплет в направлении от 5'-конца молекулы мРНК к 3'-концу. Позднее был разработан метод быстрого секвенирования нуклеиновых кислот и белков, который позволил проверить систему кодирования непосредственно, путем сравнения последовательностей ДНК, РНК и кодируемых ими белков. Сравнительные исследования подтвердили также и то, что кодирующие последовательности действительно читаются от 5'- к 3'-концу мРНК.
г. Избыточность генетического кода
Удивительной особенностью кода оказалось то, что все аминокислоты, кроме двух, кодируются более чем одним кодоном. Эти две составляющие исключение аминокислоты, метионин и триптофан, встречаются в белках достаточно редко. Наибольшее число кодонов имеют серин и лейцин, которыми белки изобилуют. Такие достаточно часто встречающиеся аминокислоты, как цистеин, аланин, глицин, валин, а также дикарбоновые кислоты и их амиды, кодируются двумя-четырьмя кодонами каждая. Из-за такой избыточности разные нуклеотидные последовательности могут при трансляции давать одну и ту же аминокислотную последовательность. Итак, если мы знаем нуклеотидную последовательность, то можем однозначно определить последовательность белка, обратное же проделать невозможно.
Сигналом для остановки синтеза белка служит любой из трех кодонов: UAA, UAG или UGA. Кодон AUG выполняет двойную функцию: он детерминирует аминокислоту метионин и в определенных последовательностях обозначает начало сегмента, кодирующего белок.
Избыточность кода имеет одну интересную особенность: наибольшее число вариаций в кодонах, детерминирующих данную аминокислоту, приходится на третью позицию. Например, аминокислоты глицин, валин, пролин, аланин и треонин кодируются четырьмя кодонами каждая, и в каждом случае эти четыре кодона различаются только нуклеотидами в третьей позиции. Если какая-то аминокислота кодируется двумя кодонами, то последние различаются только пуринами или пиримидинами, находящимися в третьей позиции. И только кодоны для лейцина, серина и аргинина различаются нуклеотидами, находящимися в первой, второй или обеих позициях. Поэтому мутации, приводящие к заменам нуклеотидов в третьей позиции, часто не сопровождаются изменением аминокислотной последовательности. Кроме того, код устроен так, что при замене нуклеотидов даже в первой или второй позиции некоторых кодонов в полипептид включается структурно родственная аминокислота, сводя тем самым к минимуму нарушения во вторичной структуре белка. Кодоны для гидрофобных аминокислот, например фенилаланина, лейцина, изолейцина и валина, различаются только одним нуклеотидом. Аналогичная ситуация наблюдается и для кодонов серина и треонина или аланина и глицина.
д. Универсальность генетического кода
По-видимому, все прокариоты, а также большинство эукариот пользуются одним и тем же словарем кодонов независимо от того, представлен ли их геном ДНК или РНК. В этом смысле нередко говорят, что код универсален. Тем не менее частота использования кодонов-синонимов варьирует как на уровне организмов, так и на уровне мРНК. Если действительно какие-то кодоны используются в большинстве кодирующих белки последовательностей чаще, чем другие, то это должно найти отражение в относительном содержании в клетке различных тРНК, расшифровывающих кодоны-синонимы. Так, если кодон AGA встречается в мРНК какого-либо организма сравнительно редко, то и содержание тРНК, расшифровывающей AGA, должно быть невелико. В некоторых случаях выбор кодонов для конкретной кодирующей последовательности определяется задачами, не связанными с их трансляцией. Например, определенное взаимное расположение кодонов может благоприятствовать образованию специфической вторичной структуры мРНК; таким образом, присутствие конкретных кодонов может влиять на готовность мРНК к трансляции и тем самым играть регуляторную роль. В некоторых случаях экспериментальная замена существующих кодонов их синонимами приводит к изменению стабильности мРНК при полном сохранении ее способности к правильной трансляции.
Редкие исключения в стандартном словаре кодо-нов обнаружены у инфузорий и в митохондриальных генах. Например, в митохондриях млекопитающих кодон UGA читается как триптофан и митохондриальная ДНК кодирует тРНК, чей антикодон UCA спаривается с UGA почти так же прочно, как с нормальным триптофановым кодоном UGG. В митохондриях млекопитающих кодоны AGA и AGG прочитываются как сигналы терминации. AUU, AUC, AUA и AUG служат инициирующими кодонами, a AUA кодирует метионин вместо изолейцина. В митохондриях дрожжей триплеты CUU, CUC, CUA и CUG кодируют треонин, а не лейцин.

5. Аппарат трансляции
Основными участниками процесса считывания информации, закодированной в последовательности мРНК, являются аминоацил-тРНК-синтетазы, тРНК, рибосомы, белки, связанные с рибосомами, и некоторые другие белки. Они ответственны за инициацию, элонгацию и терминацию сборки полипептида. В этом разделе мы опишем свойства каждого из перечисленных компонентов, а в следующем обсудим, как они функционируют на разных этапах процесса трансляции.
а. Присоединение аминокислот к «родственным» тРНК
Функционирование тРНК при трансляции сводится к двум уникальным процессам. Первый из них состоит в присоединении аминокислоты к 3'-концу родственной тРНК с помощью специфической аминоацил-тРНК-синтетазы, второй – в специфическом связывании аминоацил-тРНК с соответствующим кодоном мРНК, находящейся в комплексе с рибосомой. Ключевой особенностью обеих реакций является их специфичность, поскольку сбои в образовании аминоацил-тРНК или связывании аминоацил-тРНК с соответствующим кодоном приведут к ошибкам в экспрессии генов. Поэтому очень важно понять природу такой специфичности, механизм ее обеспечения и последствия нарушений точности на этих двух этапах трансляции.
Основные особенности структуры тРНК. В любой клетке присутствует очень много разных тРНК. Молекула тРНК состоит обычно из 75–85 нуклеотидов и содержит уникальный тринуклеотид, который определяет, какую аминокислоту эта тРНК присоединяет и с каким кодоном она может спариться. На основании данных о нуклеотидной последовательности более чем 150 отдельных видов тРНК, выделенных из клеток про- и эукариот, были построены компьютерные модели внутримолекулярного комплементарного спаривания оснований в молекуле тРНК. Был сделан вывод, что практически все тРНК, независимо от их нуклеотидной последовательности, обладают характерной вторичной структурой, которую называют структурой «клеверного листа» из-за наличия в ней трех шпилек. Реальность предсказанной структуры была подтверждена данными о разной химической чувствительности оснований, одни из которых спарены, а другие нет.
Большинство молекул тРНК, имеющих форму клеверного листа, содержат четыре области, каждая из которых обладает инвариантными свойствами независимо от аминокислотной специфичности тРНК. 1. На 3'-конце молекулы всегда находятся четыре неспаренных нуклеотида, причем три из них–это обязательно ССА. 5'- и 3'-концы цепи РНК образуют акцепторный стебель. Цепи удерживаются вместе благодаря комплементарному спариванию семи нуклеотидов 5'-конца с семью нуклеотидами, находящимися вблизи 3'-конца. 2. У всех молекул имеется шпилька РфС, обозначаемая так потому, что она содержит два необычных остатка: риботимидин и псевдоуридин). Шпилька состоит из двухцепочечного стебля из пяти спаренных оснований, включая пару G-C, и петли длиной семь нуклеотидов. Тринуклеотид Т всегда расположен в одном и том же месте петли. В антикодоновой шпильке стебель всегда представлен семью спаренными основаниями. Триплет, комплементарный родственному кодону, – антикодон – находится в петле, состоящей из семи нуклеотидов. С 5'-конца антикодон фланкируют инвариантный остаток урацила и модифицированный цитозин, а к его 3'-концу примыкает модифицированный пурин, как правило аденин. 4. Еще одна шпилька состоит из стебля длиной три-четыре пары нуклеотидов и петли варьирующего размера, часто содержащей урацил в восстановленной форме – дигидроурацил.
Наиболее сильно варьируют нуклеотидные последовательности стеблей, число нуклеотидов между антикодоновым стеблем и стеблем ТфС, а также размер петли и локализация остатков дигидроурацила в DU-петле.
Рентгеноструктурный анализ некоторых молекул тРНК позволил выявить их характерную четвертичную структуру. Эта структура более компактна, чем структура «клеверного листа». Она образуется благодаря внутримолекулярным взаимодействиям, сближающим DU- и Т| С-шпильки. В результате молекула тРНК выглядит так, как будто она состоит из двух взаимно перпендикулярных частей – в одной из них находится акцепторный участок, в другой – антикодон. Из-за такого общего вида молекулы структура получила название L-конфигурации. L-структура представляется более адекватной, чем «клеверный лист», особенно если учесть, что тРНК играет роль адаптора при взаимодействии кодона и антикодона на рибосоме.
Обычно акцепторами для одной и той же аминокислоты служат несколько разных тРНК, имеющих разные антикодоны, что позволяет им спариваться с кодонами-синонимами. Отчасти этим объясняется и вырожденность кода, т.е. способность разных антикодонов детерминировать одну и ту же аминокислоту.
Этерификация молекул тРНК. Для выполнения функции адаптора в процессе трансляции мРНК тРНК должна связаться с аминокислотой, соответствующей своему антикодону. Это происходит в результате АТР-зависимой реакции, катализируемой специфическими ферментами аминоацил-тРНК-синтетазами. В ходе реакции АТР расщепляется на 5'-адениловую кислоту и неорганический фосфат, а высвобождаемая при этом энергия используется для присоединения карбоксильной группы аминокислоты к одной из гидроксильных групп рибозы на 3'-конце тРНК. На самом деле образование аминоацил-тРНК проходит в два этапа. На первом этапе карбоксильная группа аминокислоты присоединяется к а-фосфату АТР, что сопровождается высвобождением неорганического фосфата и образованием аминоацил-аденилата. Аминоацил-аденилат обладает очень высокой реакционной способностью и стабилизируется благодаря прочному связыванию с ферментом. Второй этап состоит в переносе аминоацильной группы от связанного с ферментом аминоацил-аденилата на 2'-или 3'-ОН-группу концевой рибозы тРНК. Потенциала переноса ацильной группы аминоацил-тРНК более чем достаточно для образования пептидной связи без дополнительного поступления энергии.
Ключевой особенностью реакции, приводящей к аминоацетилированию тРНК, является специфичность участвующих в ней ферментов. Присоединение к тРНК каждой из 20 аминокислот, встречающихся в белках, катализируется определенной аминоацил-тРНК-синтетазой. Фермент должен отличить одну аминокислоту от 19 других и перенести ее к одной или нескольким изоакцепторным тРНК из имеющихся примерно 75 других тРНК. Вспомним при этом, что многие аминокислоты очень сходны по структуре: лейцин, валин и изолейцин; валин и треонин; аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Аминоацил-тРНК-синтетазы должны отличить «свои» тРНК от всех других, несмотря на удивительное сходство их вторичной и третичной структур. Поэтому необходимо, чтобы ферменты обладали очень высокой специфичностью, позволяющей им сделать правильный выбор из столь родственных структур и избежать ошибок при синтезе белка.
Комментарий по поводу структур аминоацил-тРНК-синтетаз и их способности к узнаванию аминокислот и родственных тРНК. Многие аминоацил-тРНК-синтетазы удалось очистить. Некоторые из них состоят из одной полипептидной цепи, другие – из двух или четырех идентичных цепей, каждая мол. массой от 35 до 115 кДа. Некоторые димерные и тетрамерные ферменты состоят из субъединиц двух типов. Четкой корреляции между размером молекулы фермента или характером его субъединичной структуры и специфичностью не существует.
Исследования взаимодействия между аминоацил-тРНК-синтетазами и родственными им тРНК не позволили выяснить природу их высокой специфичности. Большинство работ показало, что специфичность фермента определяется его прочным связыванием с акцепторным концом тРНК, DU-участком и вариабельной петлей. Некоторые ферменты, по-видимому, не распознают антикодоновый триплет и катализируют реакцию аминоацетилирования даже при измененном антикодоне. Однако отдельные ферменты проявляют пониженную активность по отношению к таким модифицированным тРНК и при замене антикодона присоединяют не ту аминокислоту. Следовательно, в некоторых случаях существенным оказывается и взаимодействие с антикодоновой петлей. В любом случае акцепторный конец тРНК должен быть ориентирован так, чтобы каталитический центр фермента смог перенести связанный аминоациладенилат к концевому нуклеотиду тРНК.
В какой-то степени способность фермента присоединять нужную аминокислоту к родственной тРНК зависит от специфического связывания аминокислоты. Однако, если безошибочное распознавание родственных аминокислот невозможно, синтетазы могут исправлять ошибки, происходящие при присоединении. Например, нельзя полностью исключить возможность связывания валина изолейцил-тРНК-синтетазой из-за сходства размера и структуры изолейцина и валина. Дефект в специфичности обнаруживается в первой же реакции: изолейцил-тРНК-синтетаза образует ферментсвязанный валил-аденилат, хотя и с меньшей эффективностью, чем изолейцил-аденилат, однако такой активированный валин не связывается ни с TPHK, ни с тРНК. Вместо этого ферментсвязанный валил-АМР быстро гидролизуется в присутствии тРНК, и образование валил-тРНК предотвращается. Подобный механизм позволяет валил-тРНК-синтетазе различать валин и треонин, а метионил-тРНК-синтетазе отличать треонин от метионина. Очевидно, что аминоацил-тРНК-синтетазы пользуются механизмом коррекции с целью предотвращения неизбежных ошибок в аминоацетилировании тРНК. И напротив, механизм, с помощью которого удалялась бы уже присоединенная к тРНК неправильная аминокислота, отсутствует. В таких случаях аминокислота занимает неправильную позицию в белке. Частота таких ошибок очень низка. В гемоглобине кролика, например, валин оказывается в местах, обычно занимаемых изолейцином, только в одном из 25000–50000 возможных случаев. Таким образом, точность первого шага на сложном пути считывания генетической информации обеспечивается четкой работой разных аминоацил-тРНК.
б. На рибосомах осуществляются спаривание аминоацил-тРНК с кодонами и сборка белковых цепей
Во всех клетках имеются рибосомы, играющие ключевую роль в синтезе белка; их число колеблется от 20000 до 50000 в зависимости от белоксинтезирующей активности клеток. Рибосомы индифферентны в отношении синтезируемых ими белков или тех клеточных мишеней, к которым они направляют синтезированные продукты. Тип синтезируемого рибосомой белка в каждом синтетическом цикле диктуется мРНК, с которой рибосома оказалась связанной. Внутри- или внеклеточная локализация белков определяется их структурными особенностями и – в зависимости от этих особенностей – характером взаимодействия со специализированными мембранами и органеллами.
Рибосомы про- и эукариот обладают в общем очень сходными структурой и функциями. Тем не менее из-за различий в структуре и организации про- и эукариотических мРНК и из-за того, что процессы транскрипции и трансляции у эукариот являются сопряженными во времени и в пространстве, тонкие различия между рибосомами про- и эукариот имеются. Типичными прокариотическими рибосомами являются рибосомы Е. coli, и поскольку их структура и функции изучены лучше остальных, мы используем эту модель в последующем обсуждении. Для сравнения мы остановимся на некоторых структурных особенностях рибосом эукариот.
Строение рибосомных частиц. Рибосомы прокариот состоят из малых и больших субчастиц. 30S-субчастицы состоят из единственной молекулы рРНК размером 1542 нуклеотида и 21 белка с разной мол. массой. 50S-субчастицы содержат две рРНК – большую, состоящую из 2904 нуклеотидов, и более мелкие, из 120 нуклеотидов; они связаны с 34 разными белками. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности всех рРНК и белков известны. Электронно-микроскопические исследования 70S-рибосом и построения их трехмерных моделей показали, что малая и большая субчастицы соприкасаются в нескольких точках, но самой характерной особенностью является наличие бороздки между ними, необходимой, по-видимому, для размещения в ней мРНК на время трансляции.
И малая, и большая рибосомные субчастицы могут диссоциировать на составляющие молекулы РНК и белка. Более того, даже после отделения друг от друга молекулы всех РНК и белков способны восстанавливать исходную функционально активную рибосомную субчастицу, если их смешать в соответствующих условиях. Это означает, что вся информация о сборке мультимерного комплекса заключена в структуре его компонентов. Эксперименты по реконструированию рибосом позволяют лучше понять характер взаимодействия между этими компонентами и определить возможный порядок, в котором собираются белки и РНК in vivo. Кроме того, в подобных экспериментах можно проверить совместимость эквивалентных РНК или белковых субчастиц из различных источников. Далее, с помощью этого метода можно оценить способность мутантных РНК или белков к взаимодействию с восстановлением структуры рибосом и проявлению различных видов активности, присущих реконструированным рибосомам.
Рибосомы эукариот, находящиеся в цитозоле, также состоят из малых и больших субчастиц. Малые субчастицы содержат одну молекулу РНК размером 1900 нуклеотидов и 30–35 белков; большие – три цепи РНК длиной 120, 160 и 4800 нуклеотидов и 45–50 белков. Рибосомы митохондрий и хлоропластов отличаются от цитозольных рибосом. Как правило, они меньше и содержат меньшее количество белков и различных рРНК. Данные по физическому и химическому реконструированию более сложных эука-риотических хромосом значительно уступают аналогичным данным, полученным для Е. coli.
Необходимо выделить два важных в функциональном отношении участка, образующихся при ассоциации субчастиц в процессе формирования 70S-рибосомы. Это участки, в которых происходит связывание двух тРНК – одной, присоединенной к растущей белковой цепи, и другой, несущей следующую добавляемую к цепи аминокислоту.
Особые тРНК и некоторые вспомогательные белки, участвующие в трансляции. Как у про-, так и у эукариот имеются два вида тРНК, которые связывают метионин. У прокариот они обозначаются как тРНК и тРНК, а у эукариот – соответственно тРНК и тРНК. Каждая из обоих видов тРНК как у про-, так и у эукариот аминоацетилируется метионином с помощью соответствующих аминоацил-тРНК-синтетаз. тРНК прокариот и тРНК эукариот обладают необычными свойствами, позволяющими им функционировать в качестве адапторов при инициации синтеза полипептидной цепи в соответствующих инициаторных AUG-кодонах. тРНК про- и эукариот узнают AUG-кодоны в белок-кодирующих последовательностях.
У прокариот аминогруппа метионил-тРНК, но не метионил-тРНК формилируется особым ферментом до Fmet-TPHK с использованием в качестве донора формильной группы М¹⁰-формилтетрагидрофолата. Очевидно, трансформилаза отличает met-TPHK от met-TPHK. Fmet-TPHK используется исключительно для инициации белковых цепей, a met-TPHK_M^Met – только для декодирования внутренних метиониновых кодонов. Несмотря на то, что тРНК эукариот также используется только для инициации, ее метионильная группа не подвергается формилированию. Очевидно, некие особые свойства, присущие тРНК и необходимые для выполнения ею специальной инициаторной функции, связаны исключительно с ее нуклеотидной последовательностью и / или трехмерной структурой.
Известны белки, которые только временно, на период трансляции, связываются с рибосомами. Они играют важную роль при инициации, элонгации и терминации синтеза белковой цепи. Прежде чем подробно обсуждать эти процессы, мы познакомим читателя с такими белками и кратко опишем их свойства и роль в трансляции.
Эти белки, называемые факторами инициации и обозначаемые IF-1, IF-2 и IF-3, необходимы для инициации трансляции мРНК с образованием белков. IF-1 и IF-3 связываются с 3. Важным этапом терминации или отделения белковой цепи от мРНК является гидролиз GTP.
6. Трансляция мРНК у прокариот
Зная всех участников процесса, мы можем теперь приступить к рассмотрению химических реакций, протекающих при синтезе полипептидов, т.е. реакций, участвующих в собственно трансляции. Несмотря на то, что этот процесс протекает непрерывно от старта к финишу, обычно выделяют три его этапа: инициацию, элонгацию и терминацию. Рассматривая каждый из этапов направляемого мРНК синтеза полипептидной цепи, мы должны учитывать два основных свойства этого процесса. Во-первых, полипептидные цепи синтезируются однонаправлен-но: с амино-конца к карбокси-концу. При этом карбоксильная группа уже образовавшегося участка полипептидной цепи соединяется с аминогруппой следующей присоединяемой аминокислоты с помощью пептидной связи. Это может произойти, лишь если карбоксильный конец растущей полипептидной цепи находится в активированном состоянии. Как мы уже отмечали, необходимая для этого энергия поступает в результате присоединения карбоксильной группы растущей полипептидной цепи и каждой присоединяемой аминокислоты к тРНК. Во-вторых, считывание мРНК начинается с кодона AUG, который обозначает 5'-конец кодирующей последовательности и детерминирует N-концевую аминокислоту синтезируемого полипептида. При инициации первая и вторая молекулы аминоацил-тРНК спариваются с первыми двумя кодонами мРНК. Далее трансляция продолжается в направлении 5'–>3' кодон за кодоном до тех пор, пока не достигнет стоп-сигнала, расположенного сразу же за кодоном, детерминирующим С-концевую аминокислоту.
а. Условия инициации
70S-рибосома способна осуществлять трансляцию последовательности мРНК, но не может инициировать этот процесс. При связывании инициаторных белков IF-1 и IF-2 с 30S-субчастицей происходит диссоциация 70S-рибосомы. 30S-субчастица в комплексе с IF-1 и IF-3 связывает IF-2, GTP и Fmet-тРНК. Такой полный комплекс связывается с 5'-концом кодирующей последовательности мРНК вблизи кодона AUG. Очевидно, IF-2 способен отличить Fmet-тРНК от тРНК, и эта специфичность отчасти обеспечивается N-формильной группой, отсутствующей у ТРНК Формирование полноценного функционального комплекса инициации завершается ассоциацией 50S^6-частицы с преинициаторным комплексом. С образованием функциональной 70S-субчастицы отделяются все три белка инициации.
Как узнается первый кодон? Связывание 30S-6-частицы с мРНК находится под строгим контролем нуклеотидной последовательности, расположенной примерно за 10 нуклеотидов до 5'-конца инициаторного кодона. Взаимодействию способствует комплементарное спаривание этой богатой пуринами последовательности из пяти-восьми нуклеотидов, называемой последовательностью Шайна-Дальгарно, с полипиримидиновым участком, находящимся вблизи 3'-конца 16S-pPHK. Эффективность инициации существенно зависит от степени комплементарности между последовательностями Шайна-Дальгарно и 16S-pPHK и от расстояния пурин-богатого участка до кодона AUG. Эта особенность наряду с другими, о которых будет сказано позднее, и объясняет различия в эффективности трансляции различных мРНК.
Процесс инициации зависит также от вторичной структуры того участка молекулы мРНК, в котором находится инициаторный кодон AUG. Если этот кодон окажется внутри двухцепочечного участка, то инициация будет неэффективна или вовсе блокируется. Именно таким образом может регулироваться доступность инициаторного AUG-кодона для 30S-рибосомы. AUG становится недоступным, если он оказывается спаренным при образовании конденсированной формы зрелой мРНК, и, напротив, доступным для инициации во время транскрипции мРНК или во время трансляции других кодирующих последовательностей на той же молекуле мРНК.
б. Элонгация полипептидной цепи
При ассоциации двух рибосомных субчастиц перед инициацией трансляции образуются два функциональных участка, необходимых для сборки белка: Р- и А-участки. Fmet-TPHKj» занимает Р-участок, а для образования первой пептидной связи необходимо, чтобы аминоацил-тРНК, соответствующая следующему кодону, заняла А-участок. Для этого аминоацил-тРНК должна сначала связать EF-Tu и GTP. Образовавшийся тройной комплекс и доставляет аминоацил-тРНК к А-участку. GTP в это время гидролизуется, и комплекс отделяется от рибосомы. Когда оба участка, А и Р, заняты, пептидилтрансферазная активность 50S-субчастицы катализирует перенос группы Fmet с ее тРНК на аминогруппу аминоацил-тРНК, находящейся в А-участке. В результате в А-участке оказывается дипептидил-тРНК, а в Р – свободная тРНК.
Для прочтения следующего кодона и удлинения полипептидной цепи еще на одну аминокислоту вся серия реакций должна повториться. Однако, прежде чем это произойдет, тРНК должна освободить Р-участок, образовавшаяся дипептидил-тРНК должна переместиться на него, а новый кодон должен быть готов к тому, чтобы занять освободившийся А-участок. Все эти процессы осуществляются с помощью EF-G при GTP-зависимой транслокации рибосомы. Источником энергии для перемещения рибосомы к следующему триплету кодирующей последовательности и удаления свободной тРНК из Р-сайта служит реакция гидролиза GTP до GDP. Теперь новый кодон, занявший А-сайт, готов к спариванию с родственной аминоацил-тРНК.