МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНЫ
Харьковский институт усовершенствования врачей
ОДОБРЕНО
Ученым Советом ХИУВ протокол № 6 от 21.06.96 г.
ДИАГНОСТИКА И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ИНВАЗИИ РОТОВЫХ ПРОСТЕЙШИХ   У   БОЛЬНЫХ ПАРОДОНТИТОМ
/ Методические рекомендации /

ББК 56.6 Д44
В методических рекомендациях представлены сведения о ап-робированых методах лабораторной диагностики инвазии ротовых простейших у больных пародонтитом, подробно изложена сравни -тельная оценка этих методов. Даны рекомендации о методах спе­цифической протистоцидной терапии при заболеваниях пародонта.
Методические рекомендации предназначены для врачей-сто­матологов, врачей-интернов, слушателей факультетов усовершенст­вования врачей, паразитологов, лаборантов. Могут быть полез­ны инфекционистам, оториноларингологам, микробиологам.
Методические рекомендации составили: профессор В.Ф.Куцевляк;  профессор В.А.Никитин; профессор Ю.Л.Волянский; профессор С.В.Бирюкова; к.м.н.   Н.Ф.Дзюбан; ассистент Ю.В.Лахтин.
Кафедры терапевтической стоматологии, клинической микробиоло­гии и иммунологии Харьковского института усовершенствования врачей.
Рецензент: профессор Г.Ф.Катурова
15ВМ 966-566-013-6
В полости рта, в частности пародонталышх карманах, у больных пародонтитом встречается два вида протистов: Entamoeba gangivalis - десневая амеба и Trichomonas tenax - ротовая трихомонада. Они обитают и в кариозных полостях зубов, крип­тах миндалин. Многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, не позволяют окончательно решить вопрос о роли их в патологическом процессе.
Присутствие ротовых протистов у лиц с интактным пародонтом дают основание авторам отнести их не к паразитам, а к комменсалам. Однако клинические и лабораторные наблюдения показывают, что при разных патологических состояниях изме­няется морфологическая структура десневых амеб, а при инва­зии ротовыми трихомонадами течение заболевания более длительное, затяжное. Особенно тяжело протекает пародонтит, при этом наблюдается обильное гнойное отделяемое из пародонтальных карманов. Кроме того, в данных случаях пародонтит плохо поддается лечению обычными лекарственными средствами, а наз­начение специфической протистоцидной терапии быстро приводит к купированию воспалительного процесса.
В пародонтологической практике к назначению протистоцидных средств прибегают довольно часто, нередко вслепую, без лабораторного подтверждения инвазии простейшими. Поэтому своевременная лабораторная диагностика протоинвазии ротовой полости и обоснованное проведение протистоцидной терапии у больных пародонтитом приобретают актуальное значение.
К методам протозоологической диагностики инвазии рото­вых протистов относятся следующие: протозооскопия нативного препарата, протозооскопия окрашенного мазка и культуральное исследование.
1. ПРОТОЗООСКОПИЯ НАТИВНОГО ПРЕПАРАТА
Принцип метода: взятый экссудат из пародонтального кармана смывают в капле физиологического раствора на предметном стекле и просматривают под микроскопом.
Реактивы и оборудование:
- стерильная корневая игла с турундой;
- предметное и покровное стекла;
- физиологический раствор или раствор Рингера-Локка;
- микроскоп.
Забор материала производят из пародонтальных карманов. Стерильную корневую иглу с турундой вводят в пародонтальный карман и поворачивают вокруг своей оси, затем переносят в каплю физиологического раствора, помещенную на предметном стекле, смывают в ней содержимое с иглы, покрывают покровным стеклом и микроскопируют при об. 40, ок. 7.
Физиологический раствор должен быть теплым, поскольку двигательная активность трихомонад в холодном растворе сни­жается или прекращается вообще, что может привести к отри­цательному результату. Для этого применяют специальные наг­ревательные столики. Мы в этих целях используем в качестве источника света небольшую бытовую лампу, для чего вынимаем зеркало-отражатель в микроскопе и вставляем лампу под кон­денсор. Инфракрасное излучение лампы нагревает предметное стекло с физиологическим раствором.
Entamoeba gangivalis в нативном препарате выявляются в 100% случаях. Они округлой формы, очень медленно передвигаются за счет выпячивания псевдоподий. Псевдоподии появляются с одного полюса либо сразу с нескольких в разном направлении. Они прозрачные, выступают в виде языков с закругленным кон­цом. Появление псевдоподии является главным отличительным признаком амеб от лейкоцитов, которые при воспалительном процессе в пародонте порой занимают все поле зрения. При невнимательном, беглом просмотре поля зрения за амебы можно принять разрушенные лейкоциты, которые теряют четкую круглую форму и ядро выходит за пределы оболочки. Если псевдоподии прозрачные, то центр амеб мутный, можно увидеть фагоцитированные ядра лейкоцитов. Размеры их вариабельны-: с лейкоцит и даже меньше, крупнее лейкоцита, иногда достига­ют гигантских размеров.
Trichomonas tenax в нативном препарате нами выявляются в 35,4% из всех положительных находок. Они имеют несколько вытяну­тую форму, похожи на плод груши. Отличительной чертой их от других клеточных элементов содержимого пародонтальных кар­манов является выраженная двигательная активность. Движение трихомонад энергичное, "порхающее", сопровождается выбрасы­ванием жгутиков на одном из полюсов. Во время движения те­ло простейших сокращается и они то вытягиваются по оси, то округляются. Двигательная активность их настолько энергична, что они могут быстро покидать поле зрения. В тех случаях, когда нативный препарат приготавливают в большом количестве физиологического раствора, капля получается толстой и три-хомонады быстро "уходят" в глубину капли, что может привес­ти к отрицательным результатам. Количество особей в препа­рате незначительное, от 1 до 2-3, поэтому нативный препарат следует просматривать тщательно.
При выраженном воспалительном процессе в пародонте с плазма всегда базофильно окрашена, цвет колеблется  от нежно-голубого до насыщенно-синего. Она разделена на ин­тенсивно окрашенную с вакуолями и включениями эндоплазму и более просветленную гомогенную эктоплазму в виде узкой полоски по периферии, где никаких включений и вакуолей не обнаруживается. За счет эектоплазмы образуются выросты или псевдоподии. В эндоплазме есть вакуоли, фагоцитированные лейкоциты и бактерии, очень редко эритроциты. Размеры амеб разные. Около 40% экземпляров крупные, превышают лейкоциты.
В мазке, окрашенном метиленовым синим, четко просматривается оболочка амеб, ядро темно-синего цвета, цитоплаз­ма светло-синяя, вакуоли бесцветные.
Характер экссудата влияет на количество амеб. При гной­ном экссудате их число возрастает более чем в 2 раза по сравнению с серозным,
Результаты, полученные нами, показали, что 63,9% осо­бей фагоцитируют лейкоциты. В среднем на одну амебу при се­розном экссудате приходится по 1,8 фагоцитированному лейко­циту, при гнойном экссудате интенсивность поглощения лейко­цитов возрастает до 2,42. Ядра фагоцитированных лейкоцитов окрашиваются в интенсивный фиолетовый цвет. Эритрофагия и бактериофагия встречаются значительно реже.
У 72,58% особей мы обнаруживали псевдоподии. С увели­чением размеров амеб увеличивается частота обнаружения псевдоподий. Аналогичная ситуация наблюдалась и с вакуоля­ми в цитоплазме. Характер экссудата существенно влияет на качественные изменения в структуре простейших: при гнойном экссудате псевдоподии более выражены, иногда их много, ва­куоли крупнее.
Выявляемость амеб в мазке и отпечатке одинакова и составляет 98,13%. В отпечатке протисты скапливаются сразу по несколько экземпляров в поле зрения. Так как отпечаток занимает небольшую площадь на предметном стекле, то этот способ приготовления препарата имеет преимущества перед мазком, особенно в тех случаях, когда количество простейших невелико. Однако фон препарата, состоящий из большого скоп­ления лейкоцитов, эпителиальных клеток и обильной микрофло­ры, не позволяет детально изучать их морфологию. Этот не­достаток отсутствует в мазке, но при этом приходится прос­матривать большую площадь мазка.
Trichomonas tenax в окрашенном препарате имеют свою специфичес­кую структуру. В 62,82% они округлой формы, несколько реже грушевидной, веретенообразной или в виде усеченной пирамиды. На одном из полюсов имеется ядро, расположенное эксцентрич­но. Ядро имеет вид косточки сливы, удлиненное у 56,4% эк­земпляров, округлое у 37-42% простейших. Очень редко оно точечное, каплевидное.
По Романовскому-Гимза ядро окрашивается оксифильно, бледно. Цитоплазма окрашена базофильно, слабо, имеет сет­чатую структуру, иногда гомогенная. У единичных особей в цитоплазме встречаются фагоцитированные бактерии. Поглоще­ния лейкоцитов трихомонадами мы не наблюдали.
Несмотря на высказывания некоторых авторов об окраши­вании жгутиков и аксостиля краской Романовского, мы не встретили ни одного экземпляра трихомонад, у которых эти органы прокрашивались.
При окраске метиленовым синим ядро трихомонад интенсив­но окрашено в синий цвет, протоплазма нежная, сетчатая, свет­ло-синяя, вакуоли бесцветные.
Как и десневые амебы трихомонады имеют вариабельные размеры. Около 40% экземпляров приближаются к размерам лейкоцитов в препарате, остальные либо значительно мень­ше лейкоцитов, либо несколько превышают их.
Из всех выявленных случаев трихомонадной инвазии в отпечатке протистов обнаруживали в 50,77%, в мазке - 89,23%, Так как количество простейших этого вида в препарате состав­ляет от 1-3 до 15-20, то при их небольшом числе обильный фон в отпечатке не позволяет четко дифференцировать протис­тов. В мазке же все клеточные элементы разрознены, обособ­лены друг от друга, поле зрения хорошо просматривается, поэ­тому даже единичные экземпляры легко идентифицируются. Но для этого необходимо просматривать весь препарат, их поиск представляет определенные трудности.
3. КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
П ринцип  метода: содержимое пародонтальных карманов засевают в питательную среду и после инкубации микроскопируют раздавленную каплю.
Реактивы  и  оборудование:
- стерильная корневая игла с турундой;
- предметное и покровное стекла;
- пробирки;
- капилляр или пипетка;
- питательная среда;
- термостат;
- микроскоп.
Забор содержимого пародонтальных карманов производят аналогично предыдущим методам, однако наиболее приемлемым является забор стерильным стоматологическим экскаватором № 2 из глубины кармана. Содержимое смывают в жидкую питательную
среду, которую затем инкубируют в термостате при Т - 37° С.
Культура развивается в течение 3-6 суток. По окончании срока инкубации со дна пробирки капилляром или пипеткой берут
осадок, каплю помещают на предметное стекло, покрывают покровным и микроскопируют с об. 40, ок. 7.                                                            
Применяется много питательных сред, но основными ингридиентами их являются физиологический раствор, сыворотка   и углеводы.
Рекомендуют использовать простую сывороточную среду. Она проста в приготовлении и дает хороший рост трихомонад. Для ее приготовления берут 9 частей стерильного физиологи­ческого раствора, добавляют 1 часть лошадиной или бычьей сыворотки и 1 петлю стерильного рисового крахмала.   Среду разливают в стерильные пробирки по 5-10 мл.
Наш опыт по культуралъной диагностике ротовых простей­ших показал, что простая сывороточная среда не всегда дает положительные результаты. Очевидно, это связано с региональ­ными физико-химическими характеристиками воды, из   которой готовят физиологический раствор. Физиологический раствор, приготовленный аптекой, у нас всегда имел  рН 5,1 и питатель­ная среда на таком растворе без добавления буферных солей роста трихомонад не давала.
Поэтому мы рекомендуем применять среду Павловой. Способ приготовления: хлористый натрий - 4,25 г, двузамещенный фос­форнокислый натрий   /Na₂HPO₄  X  2 H₂O₂ , можно и  Na₂HPO₄  X  12 H₂O₂ - 0,3 г, однозамещенный фосфорнокислый   калий / K₂HPO₄  - 0,23 г, дистиллированная вода - 500,0 мл. Раст­вор стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм в течение 20 минут. Перед засеванием материала раствор разливают в пробирки по 9,5 мл, добавляют О,5 мл лошадиной сыворотки и петлю стериль­ного рисового крахмала.
В качестве сыворотки применяют нормальную лошадиную сыворотку для приготовления питательных сред или сыворотку лошадиную сухую. Предварительно флакон с нормальной лошадиной сывороткой раскупоривают и оставляет в термостате на 3-е су­ток для испарения консерванта, а сухую растворяют в дистил­лированной воде.
Культуральным методом на среде Павловой десневые амебы выявлены в незначительном числе /3,74% из всех положитель­ных результатов, полученных другими протозоологическими ме­тодами/, поэтому для выделения их лучше использовать среду следующего состава: физиологический раствор - 1000,0 мл, мясо-пептонный бульон - 20,0 мл,  печеночный экстракт -20,0 мл, глюкоза - 2,5 г, Na₂HPO₄- 0,45 г, K₂HPO₄ - 0,45 г, рН = 7,4- 7,8, К простерилизованной среде добавляют 10,0 -15,0 мл инактивированной лошадиной сыворотки, разливают в пробирки; по 6— 10,0 мл ив каждую вносят 1-2 петли стерильного рисового крахмала.
Амебы развиваются в щелочной среде, а трихомонады предпочитают кислую.
Рост трихомонад на жидкой питательной среде Павловой выявлен в 76,92% среди всех положительных случаев. Определение в культуре этих простейших не представляет особого тру­да, посколько в поле зрения скапливается от 5 до 30-50 осо­бей. Незначительная часть ротовых трихомонад имеет тот   же вид, что и в нативном препарате. Подавляющее же число особей округляется, приобретает шарообразную форму. В цитоплазме видны заглоченные зерна крахмала. Выбрасывание жгутиков ак­тивное,  у некоторых крупных трихомонад можно увидеть движение ундулирующей мембраны в виде волны, пробегающей подлиннику тела.
4. ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ ПРОТОЗООСКОПИЯ
Учитывая, что в некоторых случаях протозооскопия окра­шенных препаратов не позволяет четко отдифференциовать мел­кие особи десневых амеб без фагоцитированых лейкоцитов, ваку­олей, псевдоподий от ротовых трихомонад, предложено использо­вать люминесцентную протозооскопию.
Принцип  метода: приготовлений мазок или отпечаток обрабатывают флюоресцирующим веществом, после чего объект, невидимый в ультрафиолетовом свете, приобретает иной цвет.
Оборудование  и  реактивы:
- корневая игла с турундой;
- предметное стекло;                                                          
-фиксатор /10% раствор формалина/;
- флюоорохром /акридин оранжевый 1:10 000/;
- люминесцентный микроскоп.
Содержимое пародонтальных карманов переносят на предмет­ное стекло в виде отпечатка или мазка, высушивают, фиксируют в10% растворе формалина в течение 10 минут, вновь высушива­ют и окрашивают раствором акридина оранжевого в течение 1 мину­ты. Микроскопию производят с иммерсионным объективом 90.
Впервые морфологическая характеристика ротовых простей­ших при помощи люминесцентной микроскопии дана П.С.Флис /1976/.
Десневые амебы, окрашенные флюорохромом, хорошо опреде­ляются. Для них характерно темно-зеленое свечение цитоплаз мы и более светло окрашенное ядро.       
Ротовые трихомонады тоже имеют специфическое свечение. Цитоплазма окрашивается в кирпично-красный цвет, ядро люминесцирует достаточно ярко белесовато-оранжевым цветом. Чет­ко виден аксостиль, жгутики чаще не определяются.
Лейкоциты, создающие фон препарата, имеют зеленоватый оттенок.    
Не всегда ротовые простейшие обнаруживаются сразу все­ми методами. Каждый из вышеназванных методов имеет свои пре­имущества и недостатки.
Протозооскопия нативного препарата в должной мере явля­ется объективным методом, однако его применение должно быть непосредственно после взятия материала и любое промедление во времени приводит к снижению двигательной активности трихомонад, что в дальнейшем приведет к затруднению в дифференциации с другими клеточными элементами.
Окрашенный препарат пригоден для выявления десневых амеб, но обильный фон в препарате не позволяет обнаружить единичные экземпляры трихомонад. В препарате, приготовленном в виде мазка, легче находить как десневые амебы, так и трихомонады, но при этом возникает необходимость просмотра большой пло­щади мазка.
Культуральным методом на среде Павловой целесообразно выявлять только Trichomonas tenax. Недостатком метода является мень­шая частота выявляемости простейших по сравнению с мазком. Это связано в большей части с техническими погрешностями: ма­ло материала для исследования, помещение материала в не подо­гретую среду, несоблюдение режима инкубации, рН среды и т.д.
Указанные недостатки компенсируются тем, что диагностику протоинвазии осуществляют параллельно всеми методами.
Техника диагностических протозоологических исследований проста, оборудование и реактивы доступны для лабораторий и стоматологических учреждений любого уровня. Несмотря на это выявление ротовых простейших требует натренированности, тер­пения и внимания лаборантов.
СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ ПРОТОИНВАЗИИ ПОЛОСТИ РТА
Терапия пародонтита строится на принципах максимально индивидуализированного комплексного подхода с учетом общего и местного статуса больных. Весь комплекс лечебных меропри­ятий должен быть направлен на ликвидацию этиологических и пато­генетических звеньев развившегося процесса. У больных пародонтитом с инвазией ротовыми трихомонадами среди этих меро­приятий важное значение приобретает воздействие на простей­ших в пародонтальных карманах. С этой целью применяют специ­фические протистоцидные препараты для местного и общего ле­чения.
Для местной терапии используют 1% р-р трихопола, 1% р-р трихомонацида, р-р фурацилина 1:5000, 1% р-р мефенамината натрия, 1,5% р-р метиленового синего, 0,5-1% р-р перманганата калия, 40% р-р гексаметилентетрамина. Вышеуказанные пре­параты вводят в пародонтальные карманы в виде инсталляций и орошений.
При выборе метода введения и экспозиции лекарственного вещества следует учитывать сроки гибели трихомонад.
По данным з.а.флис, И.А.Бенюмовой /1976/ растворы трихопола, трмхомонацида, фурацилина в раздавленной капле куль­туры протистов оказывают губительный эффект на 30-40 минуте, иногда на 60-й. Следовательно, их рационально оставлять в пародонтальных карманах под повязкой.
Свежеприготовленный 1% р-р мефенамината натрия на 5-18 минуте обездвиживает трихомонады, а хранившийся длительное время оказывает эффект на 20-30-й минуте.
0,5-1% раствор перманганата калия обездвиживает прос­тейших на 10-30-й минуте. Эти вещества целесообразно вводить в виде инстилляций на турундах, при этом необходима частая замена на свежие турунды, так как концентрация лекарств сни­жается вследствие разбавления слюной, кровью, экссудатом.
Очень удобно иметь в кабинете навески с порошком мефенамината натрия по 0,5 г. Из них легко приготовить свежий 1% раствор /0,5 г порошка растворить в 50,0 мл дистиллированной воды/.
Гексаметилентетрамин /уротропин/ по нашим наблюдениям в большинстве случаев вызывает не только обездвиживание, но и распад трихомонад на протяжении 1-2-х минут. Им можно оро­шать пародонтальные карманы при помощи распылителя стоматоло­гической установки.
Результаты наших исследований показали, что после воздействия на трихомонад 0,02% раствором декаметоксина основная масса особей прекращает движение на 4-7 минуте, 0,05% раствор хлоргексидина снижает двигательную активность простейших или прекращает ее на 7-10-й минуте.
Несмотря на положительный протистоцидный эффект указан­ных препаратов в раздавленной капле применение их в клинике не всегда приносит желаемый результат. Очевидно, это связано с труднодоступностью зубодесневых карманов.
Перед внесением лекарственных веществ следует тщательно удалить зубные отложения, провести обильное орошение карманов другими антисептическими средствами. Это будет способствовать механическому вымыванию простейших, микрофлоры, экссудата и таким образом протистоцидные препараты могут непосредственно воздействовать на паразитов.
Чувствительность Trichomonas tenax к лекарственным средствам имеет индивидуальные штаммовые колебания. Для выяснения протистоцидного эффекта назначаемого лекарства мы рекомендуем проводить определение чувствительности ротовых трихомонад в раздавленной капле.
С этой целью каплю штамма Trichomonas tenax₉ выращенной на пи­тательной среде, помещают на предметное стекло, покрывают покровным стеклом, добавляют исследуемое лекарственное вещество и исследуют под микроскопом. Сроком гибели простейших считают то время, когда наступил их распад.
Местная терапия не во всех случаях приводит к санации пародонтальных карманов от простейших. Обязательным условием для получения положительного результата является назначение протистоцидных препаратов внутрь.
Наиболее широкое применение получил трихопол /метрони-дазол) Его назначают по 0,25 г 2 раза в день в течение 10 дней или по одной из следующих схем:
1/ 1-й день - 0,5 г 2 раза в сутки; 2-й день - 0,25 г 3 раза в сутки; 3-4-5-6-й день - 0,25 г 2 раза в сутки.
2/ 1-й день и 2-Й день - 0,25 г 4 раза в сутки; 3-й и 4-й день - 0,25 г 3 раза в сутки; 5-6-7-й день - 0,25 г 2 раза в сутки ,
З/ по 0,25 г 4 раза в сутки в течение 5 дней.
Курсовая доза трихопола должна составлять 5,0 г.
Противопоказанием к назначению трихопола являются забо­левания кроветворных органов, ЦНС, беременность. Во время приема препарата нельзя употреблять алкоголь, так как при взаимодействии с ним образуется дисульфирам, который способст вует возбуждению и развитию психоза.
В последнее время во всем мире регистрируется увеличе­ние числа штаммов, резистентных к трихополу.
Нитазол /трихоцид, трихолавал/. Назначают по 0,1 г 3 раза в сутки после еды в течение 15 дней. Через 7-10 дней курс повторяют.
Тинидазол /фасижин/. Назначают 4 таблетки по 0,5 г за один прием во время или после еды. Противопоказания к назна­чению такие же, как и у трихопола.
Макмирор /нифурател/. Помимо протистоцидного эффекта оказывает влияние на смешанную бактериальную флору /стрепто­кокки, стафилококки, кишечная палочка, протей/, грибки {Candida albikans). Активность воздействия на трихомонад в 10 раз выше, чем у метронидазола. Назначают по 3-6 таблеток /по 200 мг/ в день в течение 1-2 недель.
Следует подчеркнуть, что лечение пародонтита протистоцидными препаратами проводят обязательно в комплексе с дру­гими мероприятиями /консервативными, хирургическими, ортопедическими/. Не устранив пародонтозогенную ситуацию в полости рта, нельзя надеяться на удовлетворительный резуль­тат.