Основные подходы к первичной обработке биологического сырья. Методы гомогенизации

Схемы выделения целевого продукта в биотехнологическом производстве существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса (общая схема выделения на рис 1). Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить (дезинтегрировать) и далее целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток. Выделение продукта облегчается, если он высвобождается (экскретируется) продуцентом в культуральную жидкость.

Предварительная обработка

сепарация

дезинтеграция

экстракция

экстракция, хроматограция, центрифугирование

хроматограция, центрифугирование,

электрофорез

Рисунок 1. Общая схема выделения БАС на заключительной стадии биотехнологического производства.

Одним из первых этапов на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы – сепарация. Иногда сепарации предшествует специальная обработка культуры – изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белков. Существуют различные методы сепарации (флотация, центрафугирование, фильтрование), которые будут подробно рассмотрены в соответствующих разделах.

В данном разделе остановимся на методах гомогенизации (дезинтеграции) клеток или других образцов животного и растительного происхождения.

1. Методы гомогенизации

Физические методы.

1. Растирание с твердыми материалами.

Метод состоит в растирании клеток с песком или абразивным порошком в ступке при помощи пестика. Хорошие результаты дает продавливание клеток, смешанных с абразивными частицами, через пресс Хьюза. Модификацией этого метода является продавливание клеток при темепературе –25.

2. Разрушение клеток в жидких средах.

В этом случае разрушение происходит либо при вращении лопастей или поршня (блендеры), либо при поступательном движении вверх и вниз поршня или шаров (гомогенизаторы).

3. Разрушение клеток с помощью высокого давления.

Применяется в основном для разрушения микробных клеток. Для этой цели пользуются специальными прессами, например френч-прессом. Разрушение клеток происходит, когда клеточную суспензию под давлением продавливают через узкое отверстие.

4. Разрушение с помощью ультразвука.

5. Замораживание – оттаивание.

6. Декомпрессия.

Клеточную суспензию сжимают, а затем резко сбрасывают давление.

Химические методы.

1. Добавление органических растворителей.

Толуол, хлороформ, бензол

2. Осмотический шок.

Химико –ферментативные методы.

Добавление антибиотиков, переваривание клеточных стенок ферментами или сложными ферментативными препаратами, выделенными из улиток.

Далее перейдем к стадии получения целевого продукта. Здесь следует упомянуть три процесса, которые зачастую являются необходимыми при получении целевого БАС: консервация, стабилизация продукта, модификация продукта.

2. Консервация.

Обезвоживание:

Воздушная сушка при повышенной и нормальной температуре.

Сушка в кипящем слое.

Лиофилизация.

Замена воды на неводные растворители (Глицерин, хранение штаммов микроорганизмов на твердых подложках).

Замораживание, Добавка антибиотиков, Изменение рН, Изменение ионной силы

3. Стабилизация продукта.

Мероприятия, направленные на сохранение свойств продукта в период его хранения и использования потребителем.

Обезвоживание и сушка.

Добавление органических растворителей.

Добавление неорганических ионов Со, Mg, Na (для пектиназы)

Формалин (0,2% р-р для глюкоамилазы)

Антибиотиков (низин для глюкоамилазы)

Использование биотехнологического процесса для стабилизации. Меланж, получаемый из яичных желтков, - ценный пищевой продукт. Порча меланжа может быть предотвращена, если из него удалить углеводы. С этой целью на меланже рекомендуется выращивать пропионовые бактерии, «ведающие» углеводы. Срок хранения увеличивается кроме того, пропионовые бактерии повышают питательную ценность меланжа, обогащая его органическими кислотами и витамином В12.

4. Модификация продукта.

Модификация необходима, когда получаем лишь «заготовку» целевого продукта.

Пенициллин G, образуемый Penicillin potatum, модифицируют с целью получения ампициллина и других полусинтетических пенициллинов.

Придание продукту соответствующей оптической ассиметрии, когда биообъект (скажем дрожжи) избирательно потребляет один из изомеров (например, L-аминокислоты), и в среде остается его оптический антипод.

Получение ряда ферментов, гормонов, когда, например, у бычьего инсулина «отстригают» аминокислотные остатки, после чего он становиться идентичным человеческому гормону.

Литература: 1. Б. Уильямс, К. Уилсон /Методы практической биохимии / Мир, 1975.

2. Н.С. Егоров, А.В. Олескин, В.Д. Самуилов /Биотехнология. Проблемы и перспективы/ книга 1, Высшая школа, 1987.

3. Ю.И. Детнерский /ПАХТ/, Т.2, стр272-274

Сепарация, осаждение, экстракция

1. Флотация.

Если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости. Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоящую из пузырьков газа с прилипшими к ним клетками. Повышение эфективности отбора биомассы в виде концентрированной суспензии достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя. Флотацию широко используют как первый этап отделения дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости.

2. Мембранные процессы.

Мембрану можно рассматривать как селективно-проницаемый барьер между двумя гомогенными фазами. Перенос через мембрану имеет место при наложении движущей силы, действующей на компоненты. В большинстве мембранных процессов движущей силой является разность давлений или концентраций (активностей) по обе стороны мембраны. Такие параметры, как давление, концентрация (активность) или даже температура, можно объединить в одном параметре – химическом потенциале . При постоянной температуре химический потенциал i-го компонента в смеси задается как

__^lna_i + V_iP

где _^ химический потенциал 1 моля чистого вещества при давлении Р и температуре Т. Для чистых веществ активность равна единице, но для жидких смесей активность определяется выражением:

a_i = Х_i _i

где Хi – мольная доля и _i i –коэффициент активности.

Мембранные процессы можно классифицировать в соответствии с движущими силами процесса.

Таблица 1. Движущая сила в различных мембранных процессах.

Перепад давления	Градиент концентрации (активности)	Градиент температуры	Градиент электрического потенциала
Микрофильтрация Ультрафильтрация Обратный осмос Пьезодиализ	Первапорация Газоразделение Диализ Жидкие мембраны	Термоосмос Мембранная дистилляция	Электродиализ Электроосмос

Мембранные материалы:

Гидрофобные полимерные мембраны: политетрафторэтилен (тефлон), поливинилденфторид, полипропилен.

Гидрофильные полимерные мембраны: эфиры целлюлозы, поликарбонаты, полисульфон, полиимид, алифатический полиамид.

Керамические мембраны: оксид алюминия, оксид циркония

Таблица 2. Основные параметры мембранных процессов и применение.

Назва-ние про-цесса	Мембра-ны	Толщи-на (мкм)	Размер пор	Мембра-нные метариа-лы	Движущая сила процесса	Принцип разделения	Применение
Микро-фильт- рация	Асиммет-ричные или симмет-ричные, пористые	10 – 150	0,05 – 10 мкм	Полимерные и керамические	Давление (<2 бар)	Ситовой механизм	В аналитических целях, стерилизация (пища, лекарственные препараты), ультрачистая вода для полупроводников, осветление напитков, концентрирование клеток и мембранные биореакторы (биотехнология), плазмофорез (медицина)
Ультрафильтрация	Пористые асимметричные	150	1 – 100 нм	Гидрофильные полимерные и керамические	Давление (1 - 10 бар)	Ситовой механизм	Молочная промышленность (обработка молока, сыворотки, сыроделие), пищевая промышленность (извлечение крахмала, белков), металлургия (разделение эмульсий масла в воде, извлечение красителей), текстильная промышленность (извлечение индиго), фармацевтическая промышленность (извлечение ферментов, антибиотиков и жаропонижающих препаратов).
Обратный осмос	Асимметричные или композиционные	Подложка 150 мкм, верхний слой 1 мкм.	<2 нм	Триацетат целлюлозы, ароматические полиамиды, полиуретановые эфиры	Давление (15 - 20 бар) солоноватая вода;

(40 - 80 бар) морская вода	Растворение - диффузия	Обессоливание солоноватых вод и морской воды, производство ультрачистой воды (электронная промышленность), концентрирование пищевых соков и сахара (пищевая промышленность), концентрирование молока (молочная промышленность)
Пьезодиализ	Мозаичные мембраны с чередованием катионных и анионообменных областей	Несколько сот мкм	непористые	Катионо-анионообмен-ные смолы	Давление (до 100 бар)	Ионный транспорт	Концентрирование солей.
Газоразделение	Композиционные или асимметричные с верхним слоем из эластомера или стеклообразного полимера	Подложка 150 мкм, верхний слой 0,1 - 5 мкм.	Непористые или с порами <1 мкм	Эластомеры: полидиметилсилоксан, полиметилпентен. Стеклообраз-ные полиме-ры: полиимиды, поли-сульфон	Давление над мембраной до 100 бар, или вакуум после мембраны	Механизм растворение диффузи (непористые мембраны); Кнудсеновский поток (пористые мембраны)	Извлечение водорода или гелия, СН4/СО2, Н2S

3. Центрифугирование

Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле.

Скорость седиментации зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционально угловой скорости ротора (w, рад*с-1) и расстоянию между частицей и осью вращения (r, см):

G=w² r.

При перечислении условий разделения частиц указывают скорость вращения и радиус вращения ротора, а также время центрифугирования. Центробежное ускорение обычно выражают в единицах g, рассчитанных из среднего радиуса вращения (rсред) столбика жидкости в центрифужной пробирки (т.е. расстояния от оси вращения до середины столбика жидкости).

Скорость седиментации сфериченских частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и вязкости среды суспендирования. Время, необходимое для осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жидкости до дна центрифужной пробирки, обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением:

t=9/2*h*(2 w² r²_ч(r_ч-r))*Ln(r_д/ r_м),

где t – время седиментации, h - вязкость среды, rч – радиус частицы, rч-плотность частицы, r - плотность среды, rд – расстояние от оси вращения до мениска жидкости, rм - расстояние от оси вращения до дна пробирки.

Дифферинциальное центрифугирование. Этот метод основан на различиях в скорости седиментации частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью. Разделяемый материал центрифугируют, осадок отделяют от надосадочной жидкости, а надосадочную жидкость центрифугируют при большем центробежном ускорении.

Зонально – скоростное центрифугирование. Исследуемый образец наслаивается на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности. Затем центрифугируют до тех пор, пока частицы не распределятся вдоль градиента в виде дискретных зон или полос.

Изопикническое центрифугирование. Образец наслаивается на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с плотностью соответствующих зон, т. е пока не произойдет разделение частиц по зонам.

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Растворенное вещество и растворитель сначала распределяются по всему объему равномерно. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности. Под действием центробежного ускорения молекулы вещества перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей им плотностью.

Для создания градиентов плотности применяются растворы сахарозы, тяжелая вода, соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия.

Центрифуги.

Центрифуги общего назначения дают максимальную скорость 6000 об/мин и ОЦУ до 6000g. Во всех центрифугах этого типа роторы жестко крепятся на валу привода, и центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены с точностью до 0,25гр.

Скоростные центрифуги дают предельную скорость 25000 об/мин, ОЦУ до 89000g. Камера ротора снабжена системой охлаждения, предотвращающей нагревание.

Ультрацентрифуги дают предельную скорость до 75000 об/мин, ОЦУ до 510000g. Они снабжены как холодильником, так и вакуумной установкой. Роторы таких центрифуг изготавливают из высокопрочных титановых сплавов. Для уменьшения вибраций ультрацентрифуги имеют гибкий вал. Центрифужные пробирки и их содержимое должно быть уравновешено с точностью до 0,1гр.

4. Осаждение.

Глава методы осаждения вынесена для самостоятельной теоретической проработки, а также подробно рассматривается в рамках малого практикума.

5. Экстракция.

Мацерация – твердое вещество экстрагируют многократно отдельными порциями растворителя при комнатной температуре.

Дигерирование – твердое вещество экстрагируют отдельными порциями растворителя при нагревании. Измельченное твердое вещество размешивают с растворителем и затем фильтруют или декантируют.д.ля более полного извлечения операцию повторяют несколько раз, используя небольшие порции свежего растворителя.

Перколяция – непрерывная экстракция. Наибольшую эффективность процесса обеспечивает противоточный принцип. Он заключается в том, что материал, содержащий больше всего экстрагируемого вещества, омывается наиболее концентрированным раствором, а экстрагированный материал в верхних слоях омывается чистым растворителем.

Перфорация – непрерывная экстракция, если вещество хорошо растворимо в воде.

Распределение растворенного вещества между жидкими фазами определяется законом распределения Нернста. Трудность разделения определяется величиной  - фактором разделения. Оба вещества могут быть разделены удовлетворительно если >100.

Выбор растворителей.

Взаимная растворимость фаз.

Растворимость данного вещества и селективность растворителя.

Устойчивость вещества в растворе.

Чистота и устойчивость растворителя.

Достаточное различие плотности обеих фаз (на 0,1 – 0,2).

Склонность к образованию эмульсий.

Для разрушения эмульсий спирт, ацетон, бензол, насыщенный р-р поваренной соли.

Безопасность.

Легкость удаления растворителя из экстракта.

5.1. Сверхкритическая экстракция (SFE).

SFE используется для сложных смесей и рассматривается как альтернатива Сокслету.

Для экстракции применяется углекислый газ. Параметры, которые можно варьировать: плотность (давление) СО2, температура, расход, предобработка образцов, сбор фракций и время экстракции.

Правила для изменения параметров.

При увеличении давления и плотности увеличивается экстрагирующая способность СО2.

Чем меньше молекулярный вес вещества, тем меньшее давление (плотность) требуется для растворения вещества и его экстракции.

Чем полярнее вещество, тем выше должно быть давление.

Из экспериментальной практики известно, что лучше выбирать низкую температуру, высокую плотность и низкое давление. Это обеспечит быструю и эффективную экстракцию.