1. Генно-модифицированные организмы. Классификация трансгенных растений по признакам

Важнейшей составной частью современной биотехнологии является генетическая, или генная инженерия.

Cуществует несколько определений, раскрывающих суть генной инженерии. По мнению академика А.А. Баева, это «конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных гибридных ДНК)», или «создание искусственных генетических программ».

В Интернете дается другое определение: «Генная инженерия — это управление генетической основой организмов посредством внедрения или удаления специфических генов, с использованием техники современной молекулярной биологии».

Методы генетической инженерии позволяют конструировать фрагменты рекомбинантных молекул ДНК того или иного организма, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы им свойства, полезные для человека.

Современная биотехнология базируется на принципах традиционной селекции, заключающихся в приобретении организмами необходимых качественно новых признаков. Однако в отличие от обычной селекции, которая в течение длительного времени испытывает множество комбинаций генов, биотехнология позволяет ввести в генетический аппарат объекта один ген или группу генов, отвечающих за проявление желаемого признака, что намного ускоряет достижение требуемого результата (рис. 1).

Генно-инженерно-модифицированный(генно-модифицированный) организм — организм или несколько организмов, любое неклеточное, одноклеточное или многоклеточное образование, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные применением методов генной инженерии и содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты

или комбинации генов.

Рис. 1. Отличительные особенности генной инженерии растений

Для создания генно-модифицированных организмов разработаны методики, позволяющие вырезать из молекул ДНК необходимые фрагменты, модифицировать их соответствующим образом, реконструировать в одно целое и клонировать — размножать в большом количестве копий.

Организмы, подвергшиеся генетической трансформации, называют трансгенными.

Трансгенные организмы — животные, растения, микроорганизмы,вирусы, генетическая программа которых изменена с применением методов генной инженерии.

Основные задачи генной инженерии в создании трансгенных растений в современных условиях развития сельского хозяйства и общества довольно многообразны (табл. 1).

Таблица 1

Основные задачи генной инженерии растений

На практике ситуация выглядит следующим образом: среди промышленно выращиваемых трансгенных растений доля устойчивых к гербицидам составляет 71%, устойчивых к вредителям — 22%, устойчивых одновременно к гербицидам и вредителям — 7%, устойчивых к вирусным, 6актериальным и грибным болезням — менее 19 (рис. 2).

Рис. 2. Структура промышленно выращиваемых трансгенных растений,

различающихся по устойчивости

Из рисунка видно, что среди главных признаков, контролируемых перенесенными генами, на первом месте стоит устойчивость к гербицидам.

Среди генов, определяющих устойчивость к гербицидам, уже клонированы гены устойчивости к таким гербицидам, как глифосат (Раундап), фосфинотрицин (Биалафос), глифосинатаммония (Баста), сульфонилмочевинным и имидозолиноновым препаратам. С использованием этих генов уже получены трансгенные соя, кукуруза, хлопчатник и т.д. В России также проходят испытания трансгенные культуры, устойчивые к гербицидам. В Центре «Биоинженерия» создается сорт картофеля, устойчивый к Басте, проходящий в настояшее время полевые испытания.

Другой распространенной группой являются трансгенные растения, устойчивые к насекомым-вредителям. Так, относительно давно известна бактерия Bacillus thuringiensis, продуцирующая белок дельта-эндотоксин, который очень токсичен для многих видов насекомых и безопасен для млекопитающих. Установлено, что встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не повреждаемые насекомыми.

Специалисты по генной инженерии в результате длительной работы подобрали необходимые штаммы Bacillus thuringiensis и создали генно-инженерные конструкции для конкретных групп насекомых.

Так, для получения трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, компании «Моnsanto» понадобилось 16 лет экспериментальной работы и 100 млн. долл. инвестиций.

В настоящее время компаниями «Моnsanto», «АgrEvо», «Мусоgеn» созданы другие трансгенные формы, устойчивые к насекомым, так называемые Bt-растения - соя, хлопчатник, кукуруза.

Специалисты и ученые полагают, что применение Bt –растений будет иметь не только хорошее коммерческое будущее, но и экологический эффект. Известно, что только 5% внесенного инсектицида срабатывает по назначению, остальные 95% попадают в окружающую среду, уничтожая многие виды насекомых, в том числе и полезных. Сокращение же объемов применения инсектицидов приведет к восстановлению популяций многих полезных насекомых, что, несомненно, положительно скажется на многих видах растительного и животного мира.

К третьей группе по распространенности относятся трансгенные растения, одновременно устойчивые к гербицидам и насекомым.

Площади возделывания этих культур увеличились с 0,1% в 1997 г. до 1% в 1998 г. Примерами этой группы являются кукуруза и хлопчатник, устойчивые к Раундапу и одновременно устойчивые к кукурузному мотыльку и хлопковой совке соответственно.

Менее распространенной является пока группа трансгенных культур, устойчивых к бактериальным, вирусным и грибным болезням.

Одним из первых достижений в защите растений методами генной инженерии явилось создание трансгенных растений, устойчивых к вирусам, путем внесения генов белков вирусной оболочки.

Активный синтез такого белка, обладающего большим сродством с РНК вируса, не дает ей возможности активно размножаться в клетке хозяина, что и обусловливает устойчивость такого трансгенного растения к вирусам. В 1986 г. подобная устойчивость была получена для табака.

Введение гена оболочки вируса табачной мозаики позволило создать устойчивый к нему трансгенный табак. Создаются также трансгенные формы огурцов, арбуза, цукини, устойчивых к различным вирусам и проходящих в настоящее время полевые испытания. К достижениям отечественной науки следует отнести создание картофеля, устойчивого к вирусу Y, который в настоящий момент находится на стадии испытаний.

Активно ведутся исследования по клонированию генов для данных растений от грибных болезней. Так, создан трансгенный табак, несущий ген хитиназы фасоли. Такая культура практически не поражается грибными болезнями даже в почве, зараженной грибным патогеном Rhizoctonia solani. Трансгенные растения табака с геном стилбенсинтазы из винограда обладают повышенной устойчивостью к Воtгynis сinегеа. Получен также трансгенный картофель, несущий ген стилбенсинтазы, устойчивый к фитофторозу и фузариозу.

Компанией «Моnsanto» разработан способ получения трансгенных растений, устойчивых как к бактериальной, так и грибной инфекции. В картофель вводится грибной ген, кодирующий синтез фермента, окисляющего глюкозу с образованием пероксида водорода. Полученные растения устойчивы и к мягкой гнили, вызываемой бактериями рода rwinia, и к фитофторе.

Относительно недавно открыты короткие пептиды, богатые остатками цистеина, обладающие антимикробными свойствами. Они названы дефензинами.

В настоящее время создаются трансгенные растения томатов, картофеля, рапса, моркови, яблони и груши с геном rs дефензинов редьки. Аналогичная работа проводится по созданию трансгенной капусты и малины

Довольно перспективными являются исследования по созданию трансгенных растений, устойчивых к абиотическим факторам. Так расширяются работы по получению трансгенных культур, устойчивых к холоду. Например, при включении в растительный геном регулирующего экспрессию других генов, включающихся при адаптации растения к холоду, получены трансгенные растения, которые выдерживали в течение 2 сут отрицательные температуры, губительные для обычных растений.

Большое внимание уделяется созданию трансгенных растений для пищевой и фармацевтической промышленности. Одним из лидеров этого направления является компания «Са1gеnе». В 1995 г. эта компания получила разрешение в США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным жирнонокислотным составом.

Проводятся также исследования по созданию трансгенных растений с заданным аминокислотным составом. Так, в настоящее время клонированы гены запасных белков сои, гороха, фасоли, кукурузы, картофеля.

Перспективным направлением является создание трансгенных растений, несущих гены, кодирующие синтез вакцин против различных болезней. Так, при потреблении сырых плодов и овощей, несущих такие гены, происходит вакцинация организма. Это значительно расширяет области применения таких трансгенных растений. Например, при введении гена нетоксичной субъединицы энтеротоксина холеры в растения картофеля и скармливании сырых клубней подопытным мышам в их организме образовывались антитела холеры. Очевидно, что такие съедобные вакцины могут стать эффективным простым и недорогим методом защиты людей и обеспечения безопасности питания в целом.

Очень интересным направлением использования трансгенных растений является их применение для фиторемедиации — очистки почв, вод и т.п. от чужеродных загрязнителей внешней среды, в частности тяжелых металлов и радионуклидов. Модифицированную конструкцию бактериального гена, кодирующего белок, который переносит и детоксицирует ртуть, использовали для трансформации табака, рапса, тополя. .

Таким образом, направления исследований генной инженерии очень разнообразны и обширны, а некоторые из них фантастичны и в то же время весьма перспективны по достижимости результатов.

2. Технология производства кормовых витаминных препаратов (В₁₂; В₆)

Витамин В₁₂ представлен группой биологически активных веществ, содержащих в своем составе трехвалентный кобальт, аминные и цианистые группировки, которые могут быть замещены другими радикалами — ОН, С1, Вг. Этот витамин стимулирует образование крови в костном мозге, улучшает усвоение белков, участвует в синтезе аминокислот и азотистых оснований. Витамин В₁₂ не содержится в продуктах растительного происхождения и его единственным источником для сельскохозяйственных животных являются микроорганизмы.

Для промышленного получения кормовых препаратов витамина В₁₂ выращивается специально подобранный биоценоз микроорганизмов, осуществляющих термофильное метановое брожение, в который входят целлюлозоразлагающие, аммонифицирующие, углеводображивающие, сульфитвосстанав-ливающие и метанообразующие бактерии. На первом этапе ферментации этих микроорганизмов (в течение 10—12 дней) наблюдается бурное развитие тсрмофильных аммонифицирующих и углеводсбраживающих бактерий, которое происходит в слабокислой среде (рН 5,0—7,0).

Другие группы бактерии данного биоценоза достигают интенсивного развития при переходе брожения в щелочную фазу (рН 7,0—8,5). Преобладающими в этот период являются метанообразующие бактерии, которые синтезируют в 4—5 раз больше витамина В₁₂, чем другие микроорганизмы биоценоза. Главные субстраты для развития метанообразующих бактерий — жирные кислоты и низшие спирты, поэтому их добавление в питательную среду значительно увеличивает выход витамина.

Для приготовления питательной среды обычно используют барду ацетоно-бутилового производства, которая декантацией очищается от твердых примесей, в нее добавляется хлорид кобальта (4 г/м3 и 0,5 % метанола).

В процессе промышленного культивирования бактерий вначале выращивается посевной материал (15—20 дней) в аппаратах вместимостью 250 м3. Затем посевной материал подают в железобетонные ферментеры вместимостью 4200 м3, в которых происходит метановое брожение. Свежую барду подают в нижнюю часть ферментера в количестве 25—30% от его объема за сутки.

Отбор метановой бражки, содержащей витамин В₁₂, производится в верхней части ферментера. В течение рабочего цикла в ферментере строго контролируют рН среды, концентрацию летучих жирных кислот, содержание аммонийного азота, поддерживают оптимальную температуру (55—57° С). В результате брожения образуется газовая смесь, состоящая главным образом из метана (65%) и диоксида углерода (30%), которая может быть использована как источник тепла.

Готовая культуральная жидкость, образующаяся как продукт ферментации, обычно содержит 2—2,5% сухих веществ, и 1,1 —1,7 мг/л витамина В₁₂. Для предотвращения разрушения витамина в процессе сушки культуральную жидкость подкисляют соляной или фосфорной кислотой до рН 6,3—6,5 и в нее добавляют 0,2—0,25% сульфита натрия.

Подготовленная таким образом культуральная жидкость дегазируется, упаривается на вакуум-выпарной установке, полученный концентрат высушивают в распылительной сушилке до влажности 5—10%. В целях улучшения физических свойств сухой продукт смешивают с отрубями или кукурузной мукой, расфасовывают по 25—30 кг в полиэтиленовые пакеты и упаковывают в крафт-мешки. Содержание витамина В₁₂ в готовом кормовом препарате составляет 2,5 мг%, срок хранения сухого препарата — 1 год. Препарат имеет коммерческое название— КМБ-12 (концентратмикробный витамин). Кроме витамина В₁₂ КМБ-12 содержит другие витамины группы В, незаменимые аминокислоты.

Витамин B₆ – Пиридоксин (Pyridoxinum)

Содержание в продуктах

Надежными источниками витамина В₆ являются зерно, отходы мукомольного производства, жмыховая мука и сухие дрожжи. Относительно небогаты витамином В₆ продукты животного происхождения и маниоковая мука. Входящий в состав природных продуктов витамин В₆ хорошо усваивается животными.

Физиологическое значение

Витамин В₆ играет центральную роль в метаболизме белков в форме пиридоксаль-5-фосфата (коэнзима). Кроме того, витамин принимает участие в метаболизме жиров и углеводов, расщеплении триптофана и метаболизме различных минеральных веществ.

Таблица 2

Характеристика продукта Lutavit® B₆

Действующее вещество	Витамин В6 (пиридоксин-гидрохлорид)
Химическая формула	С6H12NO3Cl
Молекулярная масса	205.64 г/моль
Номер продукта	FAS 8066606/1-40
Технические характеристики
Содержание	мин. 99% пиродиксин-гидрохлорида (по методике Европейской Фармакопеи II, расчёт по сухому веществу)
Потеря массы при высушивании	макс. 0, 5 % (4 часа, при 105º С )
Описание внешнего вида	Кристаллический порошок белого или беловатого цвета, без запаха
Размеры частиц	97% < 0, 2 мм
pH	2.4-3.0 (5% водный раствор)
Объёмная плотность	Приблизительно 0.5 г/см3
Растворимость	Растворим в воде без остатка (20г/100мл), слабо растворим в спирте, растворим в эфире, хлороформе и ацетоне

Заболевания, связанные с дефицитом витамина В₆

Недостаточное поступление с кормом витамина В₆ вызывает задержку роста и карликовость животных, а также воспалительные заболевания кожных покровов, изменения в периферической и центральной нервной системе, снижение усвоения белка, поражение печени и сердца, снижение вылупляемости (в инкубаторе).

Антагонисты

Ингибитор содержится в льняном семени.

Потребность

Потребность в витамине В₆ возрастает при увеличении содержания в корме белка и энергии. Молодой организм особенно нуждается в больших количествах витамина В₆, вследствие повышенного усвоения белка в период роста. Потребность составляет 3-6 мг на килограмм массы комбикорма. Потребность в витамине В₆ также возрастает в период беременности и во время получения животными сульфонамидов или некоторых антибиотиков.

Применяют при воспалительных процессах с образованием гистамина, при гепатитах, дерматозах и экземах, для улучшения регенерации эпителия глаза, слизистой оболочки желудка и кишечника, для стимуляции кроветворения

Стабильность витамина

Продукт Lutavit® B6 показывает хорошую сохранность витамина в составе витаминных смесей и кормов. В кислых, водных растворах наблюдаются лишь незначительные потери витамина. Однако в нейтральных и щелочных растворах происходит быстрый распад витамина под действием света. Величина рН растворов, которые предполагается подвергать автоклавированию, не должна превышать 5.

Примечание

При нормальных условиях Lutavit® В₆ не является токсичным. Однако следует избегать тесного контакта продукта с кожей и дыхательными путями. При использовании продукта Lutavit® B₆ необходимо принимать во внимание срок годности, указанный в сопроводительных документах.

Выпускают в порошке, таблетках по 0,002; 0,005 и 0,01 г и в растворе в ампулах в 1 и 5%-ной концентрации по 1 мл.

Таблица 3

Литература

1. Донченко Л. В., Надыкта В. Д. Безопасность пищевой продукции. - М.: Пищепромиздат, 2001. – 528 с.

2. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярёв С.В. Сельско-хозяйственная биотехнология. — М.: Высшая школа, 1998. — 416 с.