Реферат

на тему:

ЯМР как аналитический метод

Донецк 2008

Введение

В этой работе на разнообразных примерах показано, каким образом ЯМР может быть использован в качестве аналитического метода. С этой целью более подробно обсудим некоторые понятия.

Применение метода ЯМР в качестве аналитического можно продемонстрировать на примере простейшей молекулы – молекулы этанола, поскольку, как видно из рис. 1, протонам трех функциональных групп в этаноле: метильной, метиленовой и гидроксильной соответствуют три различные резонансные линии, наблюдаемые в спектре. Особенность метода ЯМР прежде всего состоит в том, что по положению резонансных линий в спектрах можно судить о взаимном расположении отдельных атомов или групп атомов в молекулах, причем это удается обнаружить даже для эквивалентных атомов. ЯМР по своей информативности выгодно отличается от многих других аналитических методов, конкурирующих с ним.

В то же время ЯМР является довольно малочувствительным методом, несмотря на то, что в современных спектрометрах значение максимально достижимого магнитного поля составляет 14 Тл, что соответствует рабочей частоте для ¹H 600 МГц. Минимальное количество вещества, которое может быть зарегистрировано с помощью метода ЯМР ¹H, варьируется в широких пределах в зависимости от условий эксперимента. Для малых молекул типичное значение, определяющее предел чувствительности, составляет 10 нмоль, т.е. то количество вещества, которое может быть проанализировано простыми биохимическими методами, например, с помощью тонкослойной хроматографии. При использовании других, достаточно широко используемых методов, таких, как газовая хроматография или радиоиммунометрия, становятся доступными принципиально иные с точки зрения чувствительности области такие, как фемто- и атоммолярная. Таким образом, если речь идет только о регистрации спектров веществ известной структуры, то эти методы по чувствительности превосходят ЯМР. Преимущество ЯМР становится очевидным лишь тогда, когда возникает необходимость в получении дополнительной информации, которую может предоставить только этот метод. Это касается тех случаев, когда структура исследуемого вещества еще не известна. Тогда из анализа спектра ЯМР можно построить ряд возможных структур и выбрать среди них правильную. Следует отметить также еще одну особенность метода ЯМР: в спектрах ЯМР ¹H могут присутствовать сигналы молекул-примесей, идентификация которых возможна только в случае применения специальных методов.

1. Идентификация известных и неизвестных веществ

Использование метода ЯМР в качестве аналитического в простейшем случае состоит в сравнении положений линий спектров образца неизвестной структуры и стандартного образца известной структуры: совпадение спектров стандартного вещества и исследуемого позволяет провести идентификацию последнего. На основании такого рода сопоставлений можно дать даже количественную оценку концентрации веществ, содержащихся в образце. Эта оценка в простейшем виде может быть сформулирована следующим образом: вещество А содержится в образце в концентрации, достаточной для его регистрации. Правда, такой способ оценки справедлив лишь тогда, когда оба сравниваемых спектра получены при идентичных условиях. Реальный спектр, соответствующий определенному веществу, существенно зависит от условий его регистрации. Вид спектра определяется не только внешними факторами, т.е. теми параметрами, которые экспериментатор может контролировать самостоятельно, но и используемым растворителем. Несмотря на это, все же удается провести идентификацию неизвестного вещества, поскольку всегда можно ограничиться определенным абстрактным уровнем и сравнить характерные особенности спектров.

Рассмотрим еще раз фрагмент спектра ЯМР этанола, снятого на современном ЯМР-спектрометре с высоким значением постоянного магнитного поля. Параметры, полностью характеризующие спектр, следующие: положение спектральных линий, структура мультиплетов и относительные интенсивности резонансных линий. Положение линий определяется значением химического сдвига, а расщепление линий – скалярным спин-спиновым взаимодействием. Площадь под резонансным сигналом, которая может быть получена численным интегрированием, пропорциональна числу спинов, соответствующих данной группе в молекуле.

Как было показано ранее, химический сдвиг можно понимать как усиление или ослабление внешнего магнитного поля в точке пространства, в которой расположено исследуемое ядро. Основной вклад в величину этого локального изменения поля дают электронные оболочки рассматриваемых молекул, поэтому можно утверждать, что химический сдвиг отражает структуру молекул. Если оценивать влияние заместителей на величину химического сдвига, то с ростом числа связей между рассматриваемым атомом и заместителем это влияние уменьшается. Однако характер электронного распределения, а значит, и вид спектра ЯМР, зависит и от пространственной структуры молекул, и от взаимодействия с другими молекулами в растворе, т.е. от тех факторов, которые уже не представляются столь очевидными.

Для ЯМР область значений химических сдвигов невелика, а эффекты, связанные с пространственной структурой и вызванные взаимодействием с другими молекулами, бывают настолько велики, что часто из наблюдения спектров ЯМР весьма затруднительно сделать однозначный вывод о химической структуре вещества.

Таблица 1. Химический сдвиг в спектрах Ни С

Для большинства молекул в растворе конформация их при комнатной температуре не является жесткой, они могут существовать в виде нескольких различных конформаций. Устанавливаемое конформационное равновесие зависит от состава растворителя, температуры и давления. Кроме того, исследуемые молекулы могут взаимодействовать между собой или с другими молекулами и образовывать при этом более или менее стабильные комплексы. Вероятность обнаружения этих взаимодействий зависит от концентрации всех компонентов, присутствующих в растворе.

В отличие от спектров ЯМР ¹H диапазон значений химических сдвигов в спектрах С существенно больше», так что положение резонансных линий в спектрах ¹³C определяется в основном химической структурой. Значения химических сдвигов характеристичны при условии, что влияние заместителей учитывается в виде аддитивной поправки к величине химического сдвига.

2. Внутренний и внешний стандарт

Химический сдвиг, как правило, приводится относительно резонансной частоты вещества-стандарта, которое добавляется в исследуемый раствор или помещается в капилляр. В этом случае, как показано ранее, химический сдвиг зависит от резонансной частоты используемого стандарта. Величина химического сдвига имеет смысл только в случае, если указан стандарт, относительно которого приводится его значение. В табл. приведены основные вещества, используемые в качестве стандартов. Если же химический сдвиг приведен относительно другого вещества, используемого в качестве стандарта, то его значение всегда можно пересчитать относительно общепринятого стандарта.

Как внешний, так и внутренний стандарты обладают рядом преимуществ и недостатков. Внутренний стандарт может вступать во взаимодействие с другими молекулами, присутствующими в растворе, что приводит к сдвигу сигнала стандарта, т.е. к сдвигу нулевой точки. Взаимодействие стандарта с исследуемым веществом также может привести к изменению вида его спектра. Поэтому основным требованием, предъявляемым к внутреннему стандарту, является уменьшение этого эффекта. Очевидно, что внутренний стандарт должен быть химически стабильным соединением и хорошо растворимым в используемом растворителе. Всем этим условиям вполне удовлетворяют такие вещества, как тетраметилсилан, 2,2 – диметил 2 силапентан 5 сульфоновая кислота и триметилсилилпропионовая кислота, положение сигнала метальной группы для которых используется в качестве нулевой точки в шкале химических сдвигов и м.д. Эти вещества используются в качестве стандартов в спектрах как ¹H, так и ¹³C Для других ядер, спектры которых представляют интерес с точки зрения биологических приложений ЯМР таких, как ¹⁵N и ³¹P, пока не установлен единый стандарт.

Внешний стандарт отделен от исследуемого вещества. Как правило, его запаивают в капилляр и помещают в измерительную ампулу. Очевидным преимуществом использования внешнего стандарта является то, что молекулы стандартного вещества и исследуемого не взаимодействуют. Однако здесь возникает другая проблема, связанная с тем, что магнитные восприимчивости растворителя внутри капилляра и в образе различаются. Величина магнитного поля в точке расположения ядра определяется не только экранирующим влиянием электронных оболочек, но и внешним магнитным полем B₀, величина которого зависит от магнитной восприимчивости окружения. Если используется внутренний стандарт, то изменение магнитного поля за счет восприимчивости окружения одинаково и для молекул стандарта, и для молекул исследуемого вещества. При использовании внешнего стандарта это условие не выполняется. В зависимости от магнитных восприимчивостей исследуемого вещества и стандарта их ядра находятся в различных магнитных полях, причем это различие в величине полей зависит не только от магнитных восприимчивостейисследуемого вещества и вещества-стандарта, но и геометрических факторов. В ЯМР высокого разрешения образец и стандарт

помещают, как правило, в цилиндрические ампулы-капилляры, длинные оси которых параллельны внешнему магнитному полю. Различие в значениях внешнего магнитного поля для образца и стандарта можно рассчитать по следующей формуле:

Поправка на восприимчивость оказывается особенно существенной, если проводится сравнение спектров, полученных на спектрометре со сверхпроводящим магнитом и с обычным электромагнитом. В последнем случае образцы обычно располагают перпендикулярно внешнему магнитному полю; согласно теоретическим расчетам коэффициент –4/3 в уравнении следует заменить на 2/3. Таким образом, даже для одинаковых образцов без учета поправки на магнитную восприимчивость значения химических сдвигов будут отличаться.

Для образца сферической формы магнитное поле внутри и вне его одинаково, так что проблему, связанную с внешним стандартом, можно частично обойти, если поместить стандарт в сферический капилляр.

3. Мультиплетная структура

Вторым важным свойством спектров ЯМР, позволяющим получить более полную их характеристику, является мультиплетная структура линий. Параметр J, количественно характеризующий расщепление резонансных линий, называется константой связи. Величина / называется константой гомоядерного взаимодействия, если рассматривается взаимодействие между ядрами одного сорта, и константой гетероядерного взаимодействия, если взаимодействующие ядра принадлежат ядрам различных элементов. Расщепление резонансных линий, показанное на рис. 1, отражает гомоядерное взаимодействие между протонами, которые входят в состав различных химических групп в этаноле. Этанол состоит не только из атомов водорода, но и атомов углерода и кислорода, однако константа гетероядерного взаимодействия не может быть обнаружена по спектрам ЯМР, поскольку изотопы ¹²C и ¹⁶O обладают нулевым спином. При более детальном рассмотрении спектра можно наблюдать очень слабые дополнительные линии по обе стороны от основной – так называемые сателлиты С. Эти линии возникают за счет взаимодействия протонов с изотопом углерода С, естественное содержание которого составляет порядка 1% и спин 7=1/2.

Мультиплетная структура спектров ЯМР может быть рассчитана теоретически. Разработан ряд достаточно совершенных программ построения спектров, которые позволяют по известным значениям констант спин-спинового взаимодействия и химических сдвигов провести расчет теоретического спектра. В случае слабой связи характер расщепления можно описать достаточно просто, и наоборот, исходя из характера расщепления резонансных линий, можно рассчитать, сколько спинов участвует во взаимодействии и какова структура данного химического соединения. При смешивании этанола с дейтерированной водой протоны гидроксильной группы этанола замещаются на ядра дейтерия. В спектре исчезает сигнал, соответствующий протонам гидроксильной группы и одновременно исчезает взаимодействие протонов гидроксильной группы и протонов CH₂-группы. Протоны, входящие в состав CH₂- и СН₃-групп в пределах группы магнитно эквивалентны. Это соответствует спиновой системе A₂X₃, спектр которой приведен на рис. 2: расщепление резонансных линий CH₂-группы – квартет, а СН₃-группы – триплет.

Интенсивность компонент мультиплета также можно рассчитать по простым правилам, аналогичным правилам расчета мультиплетной структуры. В принципе с помощью итеративной процедуры можно получить соотношение интенсивностей линий внутри мультиплета для каждой резонансной линии. Взаимодействие данного спина с п эквивалентными ядрами со спином 1/2 вызывает расщепление резонансной линии на компоненту, интенсивность каждой из компонент описывается

биномиальными коэффициентами . Интенсивность I_m т-н компоненты в этом случае можно рассчитать по формуле

В этом случае для СН₃-группы этанола получим мультиплет с отношением интенсивностей 1:2:1.

Ситуация существенно усложняется, если не выполняется приближение слабой связи. На рис. 3 показано изменение вида спектра для случая простой спиновой системы АХ, состоящей из двух взаимодействующих ядер А и

X со спинами I= 1/2, при условии, что константа косвенного спин-спинового взаимодействия J_ax остается неизменной, а разность значений химических сдвигов уменьшается. В пределе достаточно сильного

уменьшения разности химических сдвигов реализуется приближение сильной связи. В соответствии с общепринятой номенклатурой использование букв, следующих одна за другой в алфавитном порядке, для обозначения спиновой системы означает наличие сильной связи, например, AB вместо АХ, соответствующего слабой связи. Если химический сдвиг, как обычно, измерять в м.д., то величина химического сдвига не зависит от напряженности магнитного поля. Именно на этом основано использование такой шкалы. Однако если химический сдвиг измерять в Гц, то эта величина возрастает с увеличением напряженности внешнего магнитного поля. Разность химических сдвигов, выраженная в единицах частоты, возрастает с увеличением напряженности магнитного поля, а константа спин-спинового взаимодействия не зависит от этой напряженности. Следовательно, при увеличении поля мы от приближения сильной связи переходим к приближению слабой связи. Следует отметить, однако, что именно зависимость химического сдвига от поля осложняет сравнение спектров, снятых при различных значениях напряженности магнитного поля.

4. Константы скалярного взаимодействия и структура молекул

Косвенное взаимодействие двух ядерных спинов осуществляется через электроны связи. В первом приближении можно отметить, что величина этого взаимодействия убывает с ростом числа связей между ядрами. Из анализа мультиплетности резонансных линий можно попытаться построить альтернативную структуру для неизвестного вещества и даже выбрать наиболее вероятную пространственную структуру.

Строго говоря, константа спин-спинового взаимодействия / определяется не только числом связей между взаимодействующими ядрами, но также зависит от особенностей пространственного распределения электронов. Поскольку пространственное распределение электронов в свою очередь зависит от диэдрального углат.е. угла на который повернуты друг относительно друга две соседние группы ядерных спинов, связанные между собой косвенным спин-спиновым взаимодействием, то и константа / зависит от угла Вследствие этого даже если число связей между взаимодействующими спинами невелико, константа косвенного спин-спинового взаимодействия в ряде случаев уменьшается до нуля. В дальнейшем убедимся, что наличие зависимости константы / от угладает возможность решать достаточно сложные задачи структурной химии. Это, в частности, позволило определить структуру такой сложной молекулы, как протеин.

5. Определение партнера по взаимодействию

Информация о химической структуре молекулы может быть получена после того, как определено, какие из ядер данной молекулы связаны между собой скалярным спин-спиновым взаимодействием. Величина этого взаимодействия позволяет сделать вывод о том, какие из ядер являются соседними в данной химической структуре.

В рассмотренном ранее простом спектре этанола видно, что CH₂- и СНз-группы соседствуют одна с другой. В более сложном спектре ЯМР, состоящем из большого числа линий, достаточно сложно сделать вывод о том, какие из взаимодействий вызывают наблюдаемое расщепление спектральных линий. В этом случае стремятся упростить спектр, применяя метод двойного резонанса или развязку. Если в процессе детектирования на систему взаимодействующих спинов подается еще одно РЧ поле, воздействующее селективно на резонансной частоте одного из ядерных спинов, например А, то мультиплетная структура резонансной линии, соответствующей спину ядра X, при условии, что расщепление этой линии обусловлено спин-спиновой связью между спинами А и X, исчезает. Для этанола развязка на частоте, соответствующей метиленовым протонам, приводит к исчезновению расщепления в метильной группе. На рис. 2.5 приведена схема проведения этого эксперимента. Одновременно с возбуждающим импульсом дополнительно подается импульс второго РЧ поля B₂, воздействующего на частотев течение сбора данных. Для эффективной развязки величина поля JS₂ должна удовлетворять условиюОчевидно, что напряженность поля развязки должна превышать напряженность поля, создаваемого возбужденным спином. В гетероядерном случае при проведении этого эксперимента не возникает каких-либо дополнительных проблем, поскольку разность значений частот возбуждающего поля и поля развязки

достаточно велика. В гомоядерном случае при непрерывном облучении полем JS₂ возникают сложности с регистрацией слабого сигнала ЯМР, поскольку трудно избежать воздействия поля развязки на приемник, настроенный на частоту детектируемого сигнала. Поэтому спиновую систему облучают второй частотой не непрерывно, а в импульсном режиме, причем это облучение синхронизировано со сбором данных. Во время действия импульса канал приемника остается закрытым, сбор данных осуществляется во время интервала между импульсами, поэтому, во время сбора данных значительных искажений не возникает. Несмотря на то, что облучение проводится полем Ti₂ с напряженностью, усредненной по всему циклу, приведенное выше условие выполняется.

В настоящее время описанные выше эксперименты с развязкой во многом утратили свой смысл. Как увидим в дальнейшем, эту же информацию для всех партнеров по спин-спиновому взаимодействию можно получить из одного эксперимента – двумерного ЯМР-эксперимента, требующего, однако, значительных затрат времени. Относительно больших молекул, для анализа структуры которых необходимо определить большое число констант спин-спинового взаимодействия, такая затрата времени вполне оправдана и, безусловно, компенсируется получаемыми результатами. Отметим, что существует большое число вариантов экспериментов с развязкой, которые могут дать более полную информацию, однако используются при решении специальных задач. Среди них можно отметить «спин-тиклинг». Этот метод не упрощает спектр, а наоборот, приводит к возникновению новых линий – так называемых артефактов, которые появляются в том случае, если при развязке мощность РЧ поля выбирается слишком малой.

В гетероядерном случае такие эксперименты часто направлены не на упрощение спектров, а на получение информации о косвенном спин-спиновом взаимодействии, поскольку развязка приводит к полному исчезновению мультиплетной структуры линий. С этой целью поле развязки воздействует не селективно, на определенной частоте, а в полосе частот. Такой вариант развязки называется широкополосной развязкой. Данный метод можно реализовать просто с помощью быстрой модуляции высокой частотой, подобно тому, как это проводится в стандартном методе шумовой развязки. Более эффективны современные импульсные методы, которые позволяют проводить развязку в достаточно широкой области частот и непосредственно учитывают свойства ядерных спинов.

Однако при использовании широкополосной развязки возникает проблема, состоящая в том, что образец подвергается облучению дополнительным полем в течение достаточно длительного времени. Это особенно сильно сказывается на водных растворах и растворах электролитов, которые достаточно сильно поглощают РЧ излучение, что приводит к разогреву образца. Изменение температуры сказывается на виде спектра in-vitro, а для чувствительных к изменению температуры биологических молекул может приводить к необратимой денатурации. При проведении исследований in-vivo это может привести к потенциально более вредному воздействию, а именно, разрушающему перегреву тканей.

6. Применение метода ЯМР для определения концентраций

Задача определения концентраций с помощью метода ЯМР в идеальном случае представляется достаточно простой. Так как площадь под резонансной линией пропорциональна числу ядерных спинов, то она пропорциональна также числу соответствующих ядер. При условии, что объем образца остается неизменным, число ядер пропорционально концентрации молекул, содержащих эти ядра. Это позволяет по величине площади определить значение относительных концентраций, а при соответствующей калибровке – значение абсолютных концентраций.

Рассмотрим вновь рис. Значения интегралов под отдельными резонансными линиями очевидно различаются. Соотношение площадей под сигналами, соответствующими гидроксильной, метиленовой и метильной группам, равно числу протонов в этих группах 1:2:3. Подобные рассуждения справедливы и при определении в смеси веществ относительных концентраций присутствующих в них компонентов. При этом здесь отсутствует необходимость в отнесении всех резонансных линий, необходимо лишь установить принадлежность хотя бы одной резонансной линии к соответствующей молекуле при условии, что в спектре отсутствует перекрывание спектральных линий.

Несмотря на относительную простоту такого подхода, существует, однако, ряд факторов, ограничивающих точность метода. Большинство источников ошибок можно достаточно просто исключить. Поскольку методы определения концентраций играют большую роль, в частности, в спектроскопии in-vivo, более подробно обсудим возможности устранения ошибок в таких экспериментах.

Эффекты насыщения могут существенно влиять на интенсивность резонансных линий. Так как значения времен продольной релаксации для различных групп в молекуле могут варьироваться в широких пределах, то возможно настолько сильное насыщение, что в результате будет наблюдаться полное исчезновение некоторых резонансных линий. Это происходит в том случае, если скорость повторения и соответственно длительность импульса, определяющая угол отклонения вектора намагниченности, выбираются слишком большими. Если же в образце присутствуют ядра с различными значениями времен релаксации и нужно провести измерение относительной интенсивности линий с достаточно высокой точностью, то необходимо построить эксперимент таким образом, чтобы соблюдался баланс между максимальной чувствительностью и правильным значением интегральной интенсивности резонансных линий. Максимальная чувствительность определяется углом Эрнста, а точное определение площади под резонансным сигналом достигается тогда, когда длительность интервала между импульсами выбирается из следующих соображений: спин ядра с наибольшим значением времени релаксации T^^max должен полностью прийти к состоянию термодинамического равновесия, прежде чем на систему воздействует следующий импульс. Для достижения этого условия необходимо, чтобы интервал времени между импульсными воздействиями на спиновую систему T_r в несколько раз превышал максимальное из значений времен спин-решеточной релаксации Ti^max: например, T_r = Srj^max.

Так как возбуждающий импульс характеризуется конечной шириной, то соответствующий спектр не для всех частот будет равноинтенсивным. Если длительность импульса слишком велика, то не все резонансные линии возбуждаются равномерно, что приведет, очевидно, к изменению их интенсивности, которая определяется разностью значений резонансной и опорной частот.

Для улучшения отношения сигнал/шум РЧ сигнал подвергается фильтрации с помощью аналогового фильтра. Такой фильтр позволяет пропускать только интересующую нас область частот. Так как частотная характеристика для аналогового фильтра не является строго прямоугольной, то сигналы по краям спектра несколько ослаблены.

При использовании аналого-цифрового преобразователя сигнал, принимающий в аналоговом представлении непрерывный ряд значений, преобразуется в ряд целочисленных значений. В этом случае определение площади под резонансной линией будет неточным, если на частотной оси отсутствует достаточно число точек для характеристики резонансной линии. Точное измерение концентрации также невозможно в случае, если цифровая фильтрация загрубляет данные о площади под резонансной линией, слишком большой шум или перекрывание с другими сигналами затрудняет процесс интегрирования. Если входной сигнал, поступающий на АЦП, является очень слабым, то осуществляющая возможность проведения преобразования позволяет получить лишь достаточно грубую информацию, так как в нашем распоряжении имеется небольшое число значений для описания данного сигнала. В предельном случае имеется только одно значение – нуль. При этом интеграл определяется с большой неточностью. Неточность можно устранить, если усилить сигнал настолько, чтобы можно было располагать достаточным числом значений. Определенные трудности возникают тогда, когда одновременно необходимо проинтегрировать очень слабый и очень сильный сигналы. В этом случае максимальное усиление входного сигнала определяется динамической областью АЦП. В Фурье-спектроскопии полный сигнал должен быть зарегистрирован без искажений, так как каждая точка, содержащаяся в спаде свободной индукции, может оказывать влияние на весь спектр. Таким образом, даже самый большой сигнал должен попадать в область значений АЦП. Для современных спектрометров с высоким значением статического магнитного поля и соответственно высоким значением рабочей частоты, как правило, используются 12- и 16 разрядные АЦП, т.е. наибольший сигнал может превышать не более чем в 4096 = 2* раз и соответственно не более чем в 65536=2 ⁶ раз наименьший сигнал для того, чтобы можно было зарегистрировать эти сигналы одновременно. Несмотря на то что приведенные величины весьма велики, такая ситуация встречается на практике нередко. Если, например, нужно зарегистрировать спектр вещества миллимолярной концентрации в воде, то сигнал воды примерно в 1 10000 раз интенсивнее сигнала вещества.

Если учесть все перечисленные возможности возникновения ошибок, то при соответствующих условиях можно определять концентрацию с точностью до нескольких процентов. Если используем внутренний стандарт и добавляем строго определенное его количество, то можем достаточно точно определить значение абсолютной концентрации. Если же условия проведения эксперимента не позволяют использовать внутренний стандарт для определения интенсивности, то это означает, например, в спектроскопии in-vivo, что при нахождении абсолютных концентраций всегда допускается некоторая неточность. В этом случае интенсивность резонансных линий определяется многими внешними факторами, в частности, точным расположением образца в приемной катушке и точностью настройки приемно-передающего тракта. Точность этих измерений всегда должна подвергаться критической оценке и сопоставлениям.

7. Подавление интенсивного сигнала растворителя

Так как концентрация растворителя всегда превышает концентрацию растворенного вещества, то проблема детектирования слабых сигналов на фоне интенсивного сигнала растворителя возникает достаточно часто. Простейший метод, позволяющий обойти эту проблему, состоит в том, что выбирается растворитель, не содержащий ядер, положение резонансных линий которых совпадает с сигналами исследуемого вещества. Так, измерение спектров на ядрах ³¹P не вызывает затруднений, поскольку большинство из используемых растворителей не содержит атомов фосфора. Однако большинство растворителей содержит протоны, так что для них наблюдаются сигналы в спектрах ЯМР ¹H. Данную трудность можно обойти, используя дейтерированные растворители, однако это также далеко не всегда применимо. Наиболее часто используемый растворитель – дейтерированная вода. В настоящее время налажен промышленный выпуск полностью дейтерированных растворителей, они нашли широкое применение. Если же по условиям проведения эксперимента необходимо использовать протонсодержащие растворители или сигнал остаточных протонов достаточно интенсивный, то этот сигнал необходимо подавлять с использованием специальных импульсных методов. Разнообразные методы, разработанные с этой целью, можно разделить на две категории: либо в подготовительном периоде эксперимента проводится селективное воздействие на спиновую систему на частоте, соответствующей сигналу растворителя, таким образом, чтобы в дальнейшем при неселективном воздействии интенсивность сигнала от растворителя была существенно ослаблена, либо возбуждается весь спектр, за исключением той области, в которой расположены сигналы растворителя. Наиболее эффективен подход, в котором используется комбинация этих методов.

Самым распространенным является метод селективного предварительного насыщения сигнала растворителя, в котором используется слабый импульс большой длительности. Следующий за ним неселективный импульс возбуждает весь спектр, однако за счет предварительного насыщения интенсивность пика растворителя существенно ослабляется в 100–1000 раз. Вторую группу составляют методы, основанные на инвертировании сигнала с помощью 180°-ного импульса и возбуждении спустя время Xполного спектра, причем длительность этого интервала выбирается такой, чтобы к моменту сбора данных намагниченность от сигнала растворителя была равна нулю.

Недостатком описанных выше методов является то, что в процессе проведения эксперимента влиянию подвергаются также и другие области спектра, в частности, возбуждаются сигналы, расположенные вблизи сигналов растворителя. В дальнейшем рассмотрим механизмы, обусловливающие, например, такие эффекты, как ядерный Оверхаузера и перенос поляризации.

Методы полуселективного возбуждения обладают тем преимуществом, что в них нежелательные эффекты отсутствуют. Полуселективные возбуждающие импульсы создаются либо в виде импульсов большой длительности и низкой интенсивности, либо в виде последовательности импульсов большой интенсивности. Первая группа методов позволяет получить спектр любого вещества, но реализация этих методов на стандартном спектрометре сопряжена со значительными трудностями, так как требует проведения специальной настройки и специального блока, который, кстати, входит в комплект ЯМР-томографа. На практике более часто используется простая в настройке импульсная последовательность 1331. Принцип работы этой последовательности состоит в следующем: отдельный импульс позволяет полностью «вырезать» определенную часть спектра, а во всей остальной области сигналы компенсируются не полностью, что позволяет провести их регистрацию. Недостатком этого метода является сложность корректировки фаз линий в спектре.