Теория хроматографии, хроматографический анализ, виды хроматографии

Для объяснения явлений, происходящих при хроматографии, для расчета длины колонок, положения и формы пиков, для выбора оптимальных условий процессов существует два подхода - теория теоретических тарелок (ТТТ) и кинетическая теория. Согласно ТТТ, хроматографическую колонку можно представить в виде ряда узких соприкасающихся слоев, называемых теоретическими тарелками. Полагается, что в каждой такой тарелке устанавливается равновесие между ПФ и НФ. Чем больше таких равновесий, тем эффективнее разделение. Обычно для оценки эффективности колонки используют ВЭТТ Н и число теоретических тарелок N: чем больше N, или чем меньше н, тем эффективнее колонка.
Несмотря на то, что ТТТ содержит ряд расчетных уравнений, она не может объяснить, как скорость потока и характеристики наполнителя влияют на ширину зоны и, следовательно, на H и N. Это привело к появлению кинетической теории.
Кинетическая теория основана на скорости миграции вещества в колонке, которая определяется соотношением времени, проводимого молекулой в ПФ и НФ. эффективность колонки в кинетической теории связывают с кинетическим параметром - временем удерживания tr. Из соотношения  следует, что чем больше tr, тем эффективнее колонка.
С позиций кинетической теории становится объяснимым факт совпадения формы хроматографического максимума с гауссовой кривой. В статистике симметричной колоколообразной гауссовой кривой описывают частоту (вероятность) появления отклонений случайного характера измеряемой величины от ее среднего значения при большом числе повторных измерений. Но и величина скорости молекул, движущихся по хроматографической колонке, тоже носит статистический характер. Вследствие хаотичного движения молекул они на своем пути претерпевают множество случайных столкновений. Поэтому одни молекулы могут продвигаться быстрее, чем другие. Границы хроматографической зоны при этом расширяются. Положительные и отрицательные отклонения случайного характера от среднего значения скорости движения молекул приводят к распределению молекул в хроматографической зоне, описываемому гауссовой кривой.
На продвижение частиц влияет ряд факторов, искажающих форму пика (делающих их несимметричными) и снижающих эффективность колонки, а именно: 1) структура НФ (размеры гранул, их однородность, плотность и равномерность заполнения колонки); 2) скорость установления равновесия сорбция-десорбция (массообмен); 3) диффузия молекул из зоны с большей концентрацией в зону с меньшей концентрацией.
Влияние этих факторов на эффективность колонки учитывается уравнением Ван-Деемтера:
,
где  - скорость потока, A и В - константы, связанные со скоростью потока и коэффициентом диффузии в ПФ; C - константа, связанная с массообменом.
Из графического представления этого уравнения (рис.2.7.1) можно сделать вывод, что существует оптимальная скорость потока, при которой Н минимальная. Чтобы найти эту точку, продифференцируем данное уравнение и приравняем производную к нулю: , откуда  = 2 , а подставив  в исходное уравнение, получим +2 . Таким образом, кинетическая теория дает основу для оптимизации хроматографического процесса.

Виды хроматографии

Рассмотрим особенности наиболее широко применяемых видов хроматографии.
Газовая хроматография - это метод, ПФ в которой является инертный газ (азот, гелий, водород). Анализируемую пробу в виде смеси газов или жидкой смеси в паровое состояние вводят в поток ПФ. Неподвижной фазой служит либо твердое вещество (газотвердофазная или газоадсорбционная хроматография - ГАХ), либо жидкость, нанесенная на твердый инертный носитель или на внутреннюю поверхность капилляра (газожидкостная - ГЖХ или газораспределительная хроматография). В аналитической химии чаще используют газораспределительную хроматографию.
Твердый инертный носитель должен обладать высокоразвитой капиллярной структурой, этому соответствует, например, кизельгур (диатомит) - разновидность гидратированного силикагеля (твердой кремниевой кислоты). Часто ее обрабатывают реагентами, которые переводят группы Si - OH в группы Si - O - Si (СН3) 3, что повышает инертность носителя по отношению к разделяемым веществам (способ силанизации). Таковыми являются, например, носители “хромосорб W” и “газохром Q”.
На кизельгур наносят жидкую неподвижную фазу. Можно выделить три типа неподвижных фаз: неполярные (например, сквалан), умеренно полярные (например, динонилфталан), полярные (например, диметилформамид). Полярность неподвижной фазы должна быть близка к полярности анализируемой пробы, например неполярные пентан, бутан и пропан хорошо разделяются на сквалане. Иногда в качестве подвижной фазы используют органические соединения, ковалентно связанные с носителем (химически связанные фазы). Такие фазы менее чувствительны к повышению температуры. Носителем с неподвижной фазой равномерно заполняют трубку (материал: стекло, нержавеющая сталь, полимер), получают хроматографичеcкую насадочную колонку. Размеры колонок, используемых для аналитических целей, составляют: внутренний диаметр 2-6 мм и длина до 20м (поэтому сгибают в спираль). Для препаративных задач могут использоваться насадочные колонны больших размеров.
Капиллярные колонки чаще изготавливают из кварцевого стекла, имеют внутренний диаметр 0,2 - 0,5 мм и длину 10 - 100 м. Внутренняя поверхность капилляра смачивается теми же жидкими фазами, что и в предыдущем варианте. Капиллярные колонки по разделительной способности более эффективны, чем насадочные колонки, поэтому такой вариант часто называют высокоэффективной газовой хроматографией.
В колонку, продуваемую газообразной подвижной фазой, вводят анализируемую пробу: газообразную смесь удобнее с помощью крана-дозатора, жидкая - с помощью хроматографического шприца (объем пробы мал: 0,1-50 мкл). Жидкие и твердые пробы перед введением в колонку должны быть переведены в парообразное состояние. Выходящие из колонки компоненты можно детектировать различными способами и получать хроматограммы в виде пиков.
Для получения выходной хроматографической кривой используют детектор и регистратор.
Детектор (определитель, анализатор) реагирует на какое-либо свойство газа-носителя и анализируемых веществ. Наиболее распространенными являются детектор по теплопроводности (ДТП или катарометр) и пламенно-ионизационный детектор (ПИД).
Катарометр преобразует зависимость теплопроводности среды от концентрации вещества в хроматографической смеси в электрический аналитический сигнал. Электрическая схема катарометра представляет собой электрический мостик, в одно плечо которого вставлена металлическая проволочка, находящаяся в токе газа-носителя, а в другое плечо вставлена точно такая же проволочка, омываемая газом-носителем с определяемыми веществами хроматографической смеси. До хроматографирования оба плеча катарометра омываются инертным газом и обе проволочки имеют одинаковое электрическое сопротивление, постоянство которого выписы-вается регистратором (самопишущем потенциометром) в виде нулевой линии хроматограммы. При поступлении в катарометр зоны вещества изменяется теплопроводность среды в плече катарометра, соответственно изменяется теплопроводность среды и электрическое сопротивление проволочки. Причём сопротивление меняется точно так же, как распределено вещество в хроматографической зоне, т.е. по закону Гаусса, графическим изображением которого является симметричная колоколообразная кривая (пик). Зависимость
R = f(c) преобразуется электрической схемой катарометра в электрический аналитический сигнал, который выводится на регистратор, выписывающий зависимость в виде пика хроматограммы.
В качестве регистратора используют самопишущий потенциометр или более современное устройство хранения и математической обработки информации - персональный компьютер.
ПИД состоит из водородной горелки, расположенной между двумя электродами. При сгорании компонентов в пламени горелки происходит их ионизация, а в электрической схеме ПИД возникает ток ионизации, пропорциональный концентрации компонентов в смеси. Зависимость тока ионизации от концентрации выводится на регистратор. В современных хроматографах аналоговый сигнал с детектора поступает на аналогово-цифровой преобразователь, информация с которого обрабатывается персональным компьютером. С помощью ПК удается автоматизировать весь хроматографический анализ.
Для проведения газовой хроматографии используют газовые хроматографы различных моделей.
Жидкостная хроматография может проводиться в колоночном и плоскостном вариантах. По механизму разделения жидко-твердую хроматографию называют также жидкостной адсорбционной, а жидкость-жидкостную - просто распределительной.
В колоночной жидкостной адсорбционной хроматографии в качестве НФ применяют поверхностно-пористые адсорбенты (ППА). ППА - это твердые сферические зерна (например, стеклянные шарики), на поверхность которых наносят силикагель, оксид алюминия или некоторые полимеры, обеспечивающие слой с высокой пористостью толщиной около 1 мкм. ПФ - это растворитель, который должен хорошо растворять все компоненты анализируемой смеси, быть химически инертным по отношению к ним, адсорбенту и кислороду воздуха, быть маловязким. Как и в газовой хроматографии, анализ проводят по времени удерживания и площади пика. При этом детектироваться может разность показателей преломления между чистым растворителем и раствором после прохождения через колонку (рефрактометрический детектор) или разность в светопоглощении в видимой (фотометрический детектор), УФ - или ИК - лучах.
В колоночном варианте распределительной хроматографии ПФ служит органический растворитель, не смешивающийся с НФ. НФ обычно служит вода, адсорбированная на твердом носителе. В качестве носителей чаще используют силикагель (твердая кремниевая кислота), целлюлозу, крахмал и другие вещества, хорошо удерживающие молекулы воды на своей поверхности.
Эффективность колонки связана с вязкостью, коэффициентом диффузии и другими физическими свойствами жидкостей. Хроматографирование на колонке особо вязких жидкостей - длительный процесс, поскольку их продвижение через пористый носитель под действием силы тяжести очень мало. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением, создаваемsv насосом высокого давления. Применение давления сделало метод более динамичным и эффективным, что и отразилось в его названии - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).
Плоскостным вариантом жидкостной адсорбционной хроматографии является тонкослойная хроматография (ТСХ), а жидкость-жидкостной - бумажная (БХ). ТСХ и БХ очень близки по технике выполнения. НФ (силикагель, крахмал, целлюлоза, Al2O3 и др.) в ТСХ наносится тонким слоем на стеклянную, металлическую (алюминиевую фольгу) или пластиковую пластинку, а в БХ в качестве НФ обычно служит вода, адсорбированная на твердом носителе - специальной хроматографической бумаге.
Для проведения анализа каплю анализируемой смеси наносят на стартовую линию в 2...3 см от края пластинки или полоски бумаги и высушивают. Затем край носителя погружают в растворитель (вода, органический растворитель), который действует как ПФ. При этом растворитель не должен касаться нанесенного пятна. Носитель можно подвесить так, чтобы поток растворителя двигался сверху вниз (нисходящая хроматограмма) и наоборот (восходящая) или от центра к краям (радиальная).
 
Рис. 1. Способ обработки бумажной хроматографии.
Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. Когда фронт растворителя достигнет требуемого уровня, хроматограмму вынимают из растворителя, дают ему испариться, затем проводят проявление пятен распределившихся веществ путем опрыскивания хроматограммы реагентом с помощью пульверизатора и последующего облучения УФ-лампой. В химических методах проявления в реагент добавляют реактивы, дающие с анализируемыми веществами окрашенные соединения. В физических методах используют, например, способность некоторых веществ флуоресцировать под действием УФ - лучей, для чего в проявитель добавляют флуоресцирующий индикатор. На проявленной хроматограмме обычно измеряют расстояния, пройденные растворителем L и компонентом l за определенное время и находят величину R= l/L (рис. 1). При качественном анализе применяют метод “свидетелей”, для чего на линию старта рядом с анализируемой смесью наносят индивидуальные вещества. Сравнивая значения R индивидуальных веществ и компонентов смеси, проводят их отождествление.
Для количественного анализа измеряют обычно площади зон компонентов на хроматограмме (например, с помощью миллиметровой кальки или др.) и по заранее полученному градуировочному графику зависимости S = f(n) находят количество веществ. Но применяют и другие варианты, например, выпаривают или удаляют вещества с носителя и затем определяют их количества в объеме полученного раствора.
В основе ионообменной хроматографии лежит обратимый стехиометрический обмен ионов анализируемого раствора на подвижные ионы сорбентов, называемых ионитами или ионнообменниками. Причиной разделения является различная способность ионов анализируемого раствора к обмену.
В качестве ионитов используют природные или синтетические, твердые, нерастворимые в воде неорганические и органические высокомолекулярные кислоты, основания и их соли, содержащие в своем составе активные (ионогенные) группы. Иониты делятся на катиониты и аниониты.
Катиониты - сорбенты, способные к обмену катионами. катиониты содержат в своем составе ионогенные группы различной степени кислотности, например сульфогруппу - SO3H, карбоксильную группу - COOH, ион водорода которых способен к катионному обмену.
Химическую формулу катионитов схематично изображают RSO3-H+, RSO3-Na+ или просто [R] H, [R] Na, где R - сложный органический радикал. Наиболее часто применяются сильнокислотные катиониты марок КУ-1, КУ-2, СДВ-2 и др.
Схема катионного обмена:
[R] H + Ме+  [R] Ме + H+
Аниониты - сорбенты, способные к обмену анионами.
Аниониты содержат в своем составе основные ионогенные группы, например, аминогруппы различной степени замещения: - NH2, =NH, N, = NH2OH,  NH OH, способные к обмену гидроксид-ионов на различные анионы. Формулы анионитов схематично изображают: RNH3+OH - , RNH3+Cl - или просто [R] OH, [R] Cl. Cхема анионного обмена:
[R] OH+A -  [R] A+ OH -
Применяют аниониты марок АВ-17, АН-1, ЭДЭ-10 и др.
Существуют также амфотерные иониты - сорбенты, способные как к катионному, так и к анионному обмену.
Поглощение ионов зависит от природы и структуры ионита, природы анализируемых веществ, условий проведения эксперимента (температуры, pH и др.). Каждый ионит способен поглощать определенное количество ионов, т.е. обладает определенной емкостью. Различают статическую обменную емкость (СОЕ) - количество ммоль эквивалентов иона, поглощенного за определенное время 1 г сухого ионита, и динамическую обменную емкость (ДОЕ) - количество эквивалентов ионов, поглощенных слоем ионита высотой 20 см и поперечным сечением 1 см2 при скорости пропускания 0,5 дм³/ч.
Эффект поглощения данного иона характеризуется коэффициентом распределения
Красп = ,
где Сионит и Ср-р - равновесные концентрации ионов в соответствующих фазах; m - масса ионита; г; V - объем водной фазы, см3.
Ионный обмен является физико-химическим процессом, поэтому на коэффициент разделения влияют как химические, так и чисто физические факторы.
К химическим относятся следующие факторы: рН раствора, природа разделяемых ионов, их концентрация в растворе, склонность к гидратации, химический состав ионита и т.д. Например, с увеличением рН катионит увеличивает обменную емкость, а анионит - уменьшает.
К физическим факторам относятся: скорость протекания раствора через колонку, размер зерен ионита, высота колонки, температура раствора и т.д.
Для достижения оптимального разделения существенно подобрать необходимое количество ионита. Если известна константа распределения Красп и емкость данного ионита Q, то величина отношения массы ионита (m, г) к объему анализируемого раствора (V, см3), которая обеспечит уменьшение концентрации иона Меn+ в растворе от начальной величины Сн до требуемого значения Ск,
.
Перед анализом ионообменную колонку регенерируют, т.е. переводят заполняющий ее ионит в определенную ионообменную форму. Зарядка катионита Н+ ионами, а анионита ОН ионами проводится путем пропускания через колонку определенного количества кислоты или основания. Затем ионит отмывают водой от избытка кислоты или основания и пропускают через него с определенной скоростью анализируемый раствор. Колонку промывают водой или другим элюентом, собирая элюат целиком или по фракциям. Ионы, поглощенные ионитом, могут быть элюированы соответствующим растворителем. Катионы, как правило, элюируют кислотой:
[R] Me + H+  [R] H + Me+;
а анионы - щелочью:
[R] A + OH [R] OH +A.
Ионообменную хроматографию применяют в следующих случаях:
1) для разделения компонентов анализируемой смеси, отделения катионов и анионов, разделения катионов, разделения анионов и т.д. Например, при добавлении к смеси ионов Cu2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+, Bi3+ соляной кислоты образуются хлоридные комплексы [CuCl4] 2-, [ZnCl4] 2-, [CdCl4] 2-, [PbCl3] -, [BiCl4] - , стойкость которых растет от Cu к Bi. При пропускании через анионитную колонку комплексы поглощаются. Далее последовательно вымывают металлы разбавленной HCl, H2O и HNO3: 2-молярным раствором HCl вымывают Cu, 0.6 М HCl - Zn, 0.3М HCl - Cd, H2O - Pb, HNO3 - Bi;
2) для получения аналитических концентратов. при пропускании больших объемов разбавленных растворов через слой ионита и последующем извлечении поглощенного вещества малым объемом растворителя возможно повышение концентрации вещества в 200-500 раз;
3) для обнаружения ионов. Разработаны методы выделения и обнаружения всех наиболее важных ионов.
Гельхроматография - это совершенно своеобразный вид хроматографии, основанный на использовании различия в размерах молекул разделяемых веществ. Метод называют также гельфильтрационным или ситовым. НФ является растворитель, находящийся в порах геля. Гелем называют студнеобразные коллоидные растворы, в которых разбухшие частицы твердой фазы равномерно распределены в жидкой фазе.
Гель готовят на основе природных (крахмал, агар-агар) или синтетических (декстран, полиакриламид и др.) соединений.
В процессе гельхроматографирования могут быть отделены мелкие частицы, способные проникать в поры геля, от крупных. Меняя состав растворителя, можно менять степень набухания твердой фазы и, следовательно, размеры пор геля, что позволяет проводить тонкие разделения смесей.