НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ імені О.В.ПАЛЛАДІНА
Хмель Тетяна Олексіївна
УДК 577.115.3: 616-006.6
ВПЛИВ N-СТЕАРОЇЛЕТАНОЛАМІНУ НА ЛІПІДНИЙ СКЛАД ЗЛОЯКІСНИХ ТА УМОВНО НОРМАЛЬНИХ КЛІТИН
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
 дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України.
Науковий керівник ─ доктор біологічних наук, професор,
член-кор. НАН та АМН України
Гула Надія Максимівна,
завідувач відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії
ім.О.В.Палладіна НАН України.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Дмитренко Микола Петрович,
завідувач відділу регуляції обміну речовин Інституту
біохімії О.В.Палладіна НАН України;
доктор медичних наук
Абраменко Ірина Вікторівна,
Головний науковий співробітник лабораторії
молекулярної біології відділу клінічної радіології
Науковий центр радіаційної медицини АМН України.
Захист відбудеться „ 2 ” червня 2008 року о 14 годині на засіданні спеціалізованної вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул.Леонтовича,9.
З дисертацією можна буде ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України за адресою: Київ, вул.Леонтовича,9.
Автореферат розіслано: „ 24” квітня 2008 року.
Вчений секретар
спеціалізованої ради
кандидат біологічних наук             Кірсенко О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. До числа регуляторних систем, що приймають участь в контролюванні канцерогенезу, належить „ендоканабіноїдна система”, до складу якої входить група біологічно активних ліпідів – N-ацилетаноламінів (NAE) [Heather B. et al., 2005]. Численні дослідження щодо з’ясування біологічної активності NAE демонструють широкий спектр їх біологічних ефектів та вказують на значну регуляторну роль цих сполук. Вже в ранніх роботах було показано, що антизапальна дія яєчного жовтку пов’язана з наявністю в ньому N-пальмітоїлетаноламіну (NPE) [Kuehl F.A.et al., 1957]. Пізніше стало відомо, що N-арахідоноїлетаноламін (АЕА, анандамід) гальмує рухливість сперматозоїдів [Schuel H. et al., 1994], підвищує рівень апоптозу [Contassot E.et al., 2004; Patsos H.A. et al., 2005]. Показано, що NPE пригнічує процеси вільнорадикального окислення ліпідів гіпоксичних тканин [Gulaya N.M.et al., 1998], а також виявляє синергічну дію в індукції апоптозу анандамідом [De Petrocellis L.et al., 2002]. Відомо, що N-олеоїлетаноламін запобігає впливу оксидативного стресу на сперматозоїди [Ambrosini A. et al., 2006], а N-стеароїлетаноламін (NSE) відіграє протекторну роль за умов постішемічної реперфузії міокарда [Фролькіс В.В. та ін., 2000] та сприяє збільшенню секреторної активності надниркової залози [Жуков О.Д. та ін., 2000]. Ймовірно, що біохімічні функції різних NAE відрізняються або ж залежать від певних умов реалізації ефекта NAE. У відділі біохімії ліпідів
Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАНУ під керівництвом професора Н.М. Гулої в клітинах нейробластоми C1300 N18 вперше ідентифікували наявність NAE, а також було показано, що NAE з насиченими ланцюжками, і зокрема N-стеароїлетаноламін, здатні пригнічувати пухлинний ріст карциноми Льюїс і гальмувати розвиток метастазів в легенях хворих мишей [Gulaya N.M. et al., 1993, Гулая Н.М. и др., 1993]. Сьогодні вже чітко встановилося уявлення про те, що NAE здатні впливати на процеси розвитку пухлини: виявляють антипроліферативний ефект [De Petrocellis L. et al., 1998], інгібують адгезію і міграцію ракових клітин [Grimaldi C. et al., 2006]. Механізми, за якими реалізуються ефекти NAE і досі з’ясовуються. Більшість наукових праць присвячена ненасиченим представникам цього класу, дія яких реалізується зв’язуванням з рецепторами. Не дивлячись на великий фактичний матеріал, на сьогодні залишається невідомим, яку ж роль відіграють NАЕ з насиченими вуглецевими ланцюжками у функціонуванні організму за умов розвитку в ньому пухлини. Відомо, що малігнізація нормальної клітини супроводжується глибокими порушеннями в структурі клітинних мембран. Адгезивні взаємодії та локомоторні властивості неопластичних клітин, умови транспорту речовин, активність ферментів та процеси ангіогенезу у значній мірі залежать від ліпідних компонентів мембран. Тому постало актуальне питання щодо впливу NSE на ліпідний склад злоякісних та умовно нормальних тканин в організмі пухлиноносія, вивчення якого поширить наші уявлення про механізми дії NSE.
Зв’язок роботи із науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України  в рамках наукової тематики 2.2.10 №15 за проблемою „Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики та лікування” (I кв. 2002 р. – IV кв. 2006 р. науковий керівник – академік С.В.Комісаренко), держ. рег. № 0102U006218 „Вміст вільних амінокислот, в тому числі інтермедіатів орнітинового циклу як показник інтенсивності злоякісного росту при карциномі Льюїс”, за проблемою „Структурно-функціональний аналіз білків за норми та деяких патологій” (I кв. 2007 р. – IV кв. 2011 р. науковий керівник – академік С.В.Комісаренко), держ. рег. № 0107V007187 „Вплив N-ацилетаноламінів на ріст, проліферацію, апоптоз та включення мітки в ДНК трансформованих клітин”, а також в рамках наукового напряму „Біологічно активні речовини для здоров’я людини” програми „Новітні медико-біологічні проблеми та оточуюче середовище людини”, держ. рег. № 0107V007191 „Застосування біологічно активного ліпіду, N-стеароїлетаноламіну як засобу для підвищення ефективності та зниження побічної дії протипухлинних препаратів”, (I кв. 2007 р. – IV кв. 2009 р. науковий керівник – чл.-кор. НАН України Н.М. Гула), затверджених Президією НАН України.
Мета та задачі дослідження. Вивчити вплив NSE на розвиток неопластичних клітин in vivo та in vitro і дослідити ліпідний склад злоякісних та умовно нормальних клітин за канцерогенезу для з’ясування можливих шляхів реалізації біологічних ефектів NSE. Для досягнення мети були поставлені такі задачі:
1) Вивчити ефект NSE на розвиток трансформованих клітин in vivo та in vitro; 2) Вивчити вплив NSE на ліпідний склад і рівень пероксигенації в метастазах та умовно нормальній легеневій тканині, що межує з метастазами, у мишей з карциномою Льюїс; 3) Дослідити стан NO-сигнальної системи за умов розвитку пухлини та за дії NSE у мишей пухлиноносіїв; 4) Дослідити ефект NSE in vitro на пухлинну тканину надниркових залоз людини; 5) З’ясувати можливість застосування NSE в комбінації з цитостатичними препаратами в хіміотерапії онкозахворювань.
Об’єкти дослідження – біохімічні показники і процеси в тканинах пухлин та пухлиноносіїв.
Предмет дослідження – вплив NSE на розвиток злоякісних клітин in vivo та in vitro.
Методи дослідження: методи експериментальної онкології, культивування клітин, спектрофотометричний, методи ліпідного аналізу (тонкошарова та газорідинна хроматографія), електрофорез.
Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що пероральне введення NSE на різних стадіях розвитку пухлини гальмує ріст та метастазування карциноми Льюїс у мишей.
Вперше встановлено, що NSE виявляє різноспрямовану дію на злоякісні та умовно нормальні тканини в організмі пухлиноносія. Введення NSE призводить до зменшення активності каталази в метастазах у мишей з карциномою Льюїс, що порушує антиоксидантний захист пухлини і робить її більш вразливою до дії захисних реакцій організму. В той же час в умовно нормальній тканині легенів NSE підвищує активність каталази і гальмує накопичення продуктів перекисного окислення ліпідів, що сприяє нормалізації окисних процесів в легенях.
Також встановлено здатність NSE коригувати ліпідний склад умовно нормальної тканини легенів в бік нормалізації вмісту фосфоліпідів і вільного холестеролу. Одночасно NSE змінює ліпідну організацію злоякісних клітин: спостерігається підвищення рівня вільного холестеролу та зростає відсоткове співвідношення поліненасичених жирних кислот ω-6 / ω-3 рядів в сумарних фосфоліпідах. Встановлено здатність NSE зменшувати вміст сумарних поліамінів, відомих активаторів проліферації
Показано, що в сумісній антипухлинній терапії з Цисплатином NSE знижує рівень сечовини, що вказує на послаблення токсичної дії Цисплатину.
Отже, вперше встановлено, що NSE змінює обмін речовин в пухлині та умовно нормальних тканинах, в результаті чого в організмі розвивається “послаблена” пухлина, більш вразлива до дії цитотоксичних факторів. В той же час NSE виступає як протектор тканини, де розвивається неоплазма, і покращує загальний стан пухлиноносія.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть бути використані для подальшого з’ясування механізмів дії NSE і для розробки нових лікувальних препаратів в комплексі лікувальних заходів онкологічних захворювань.
Особистий внесок здобувача. У відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії НАН України під керівництвом чл.-кор. НАН та АМН України, професора Гулої Н.М. автором розроблено і відтворено експериментальні умови, за якими NSE виявляє гальмуючу дію на ріст та метастазування карциноми Льюїс у мишей. Проведено визначення вмісту вільного холестеролу та сфінгозину в метастазах та умовно нормальній легеневій тканині, аналіз фосфоліпідного спектру та складу жирних кислот сумарних фосфоліпідів досліджуваних тканин. Досліджено рівень перекисного окислення ліпідів за показниками каталазної активності та рівня продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реагуючі продукти). Дослідження стану NO-сигнальної системи за умов розвитку пухлини та за дії NSE проведені разом із м.н.с. відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України Косяковою Г.В. та описані в спільній публікації. Дослідження впливу NSE на інтенсивність фрагментації ДНК в тканинах надниркових залоз людини проводили за участі м.н.с. Левчук Н.І. (Інститут ендокринології та обміну речовин ім.В.П. Комісаренка АМН України). Дослідження росту клітин лінії L1210 за дії NSE вивчали у відділі регуляції проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України під керівництвом чл.-кор. НАНУ, проф. Стойки Р.С.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи було представлено:
на 5-тій Парнасівській конференції „Molecular mechanisms of cellular signaling”, 26-29 квітня 2005 р., м. Київ; на IX-му Українському біохімічному з’їзді, 24-27 жовтня 2006 р, м. Харків; на вчених радах Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 3 статті в Українському біохімічному журналі, 2 тез доповідей на наукових конференціях та заявлено 1 патент на винахід.
Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 126 сторінках друкованого тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що включає опис методів дослідження і викладення результатів експериментів та їх обговорення, висновків, списку використаної літератури, що містить 201 посилання на роботи вітчизняних та зарубіжних авторів. Результати досліджень представлені в 10 таблицях і 25 рисунках.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури наведена інформація про наукові дослідження ендоканабіноїдної системи: описані фізико-хімічні властивості п’яти груп ендоканабіноїдів та відомі рецепторні та позарецепторні механізми реалізації їх біологічних ефектів. Показаний зв’язок ендоканабіноїдів з імунною системою, сигнальною системою NO та наведено дані про роль NAE в канцерогенезі. Описано особливості злоякісних клітин, їх характерні відмінності від нормальних клітин та взаємовідносини пухлини і організму.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження in vivo. Карцинома легень Льюїс (3LL) метастазує гематогенно в легені практично в 100 % випадків. Пухлину перещеплювали внутрішньом’язево в праву задню лапку миші (1,2 млн. клітин карциноми в 0,1 мл середовища 199). Досліди виконували на мишах-самцях лінії С57Bl/6 вагою 20-23г. Тварини утримувались на звичайному раціоні харчування. NSE (однорідна стабільна водна суспензія, що отримана за допомогою ультразвукового диспергування) вводили per os по 1мг на тварину (50 мг/кг маси тіла) та по 5 мг на тварину (250 мг/кг маси тіла) двічі на день, що в перерахунку на добу складає 100 мг/кг маси тіла та 500 мг/кг маси тіла відповідно. Початок введення препарату мишам в групі „Пухлина + NSE з 4 дня” — з 4 дня після перещеплення пухлини, а в групі „Пухлина + NSE з 21 дня” — з 21 дня після перещеплення до закінчення експерименту. Контрольним групам тварин –„Інтактні тварини”, „Пухлина” (миші, яким було перещеплено карциному Льюїс), вводили рівну кількість дистильованої води. Тварин декапітували на 33 добу після перещеплення. Кількість мишей в групах на кінець експерименту — 4-6.  
Цисплатин (0,1 % водний розчин) готували безпосередньо перед використанням і вводили групі мишей «Цисплатин» внутрішньоочеревинно по 0,2 мл на мишку 1 раз в три дні, починаючи з 10 дня після перещеплення карциноми Льюїс. За умов досліду тваринам-пухлиноносіям вводили per os NSE по 1мг та по 5 мг на тварину двічі на день з 4 дня після перещеплення пухлини, а з 10 дня починали вводити Цисплатин. Такі тварини були поділені в групи „Цисплатин + NSE 1 мг” і „Цисплатин + NSE 5 мг”. Порівняльний аналіз проводили з групою мишей-пухлиноносіїв „Контроль”.
За динамікою росту пухлин слідкували за допомогою заміру діаметрів стегна тварини в двох взаємно перпендикулярних площинах з періодичністю 1 раз в 7 днів. Гальмування росту пухлини розраховували в порівнянні з розмірами контрольної групи тварин. Для оцінки інтенсивності процесу метастазування використовували такі критерії: середня кількість метастазів на тварину в групі, середній об’єм метастатичного ураження легенів на тварину в групі.
Процеси перекисного окислення ліпідів оцінювали за накопиченням продуктів перекисного окислення, реагуючих з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реагуючих продуктів) [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972]. Рівень антиоксидантної активності злоякісних та умовно нормальних клітин визначали за активністю каталази [Королюк М.А. и др.,1988].
Активність аргінази визначали колориметричним методом за реакцією з використанням диметилгліоксиму, в результаті якої утворюється сечовина. Активність аргіназної реакції виражали в нмоль сечовини за 1 хв на мг білка.
Поліаміни визначали за кількістю путресцина за допомогою 2,4 – динітрофторбензола. (ДНФБ )(Serva, ФРГ) [Сяткин С.П., 1980 ].
Ліпідний екстакт готували, використовуючи метод [Bligh E.G., Dyer W.I., 1959]. Отриманий ліпідний екстракт висушували на роторному випаровувачі для видалення розчинника. Сухий ліпідний залишок зберігали в бензолі при температурі – 18 ^оС. Розділення індивідуальних фосфоліпідів проводили за методом двовимірної тонкошарової хроматографії (ТШХ) на підготовленому силікагелі [Беленький Б.Г. и др., 1984], нанесенному на скляних платівках 6 х 6 (см). Ідентифікацію індивідуальних фосфоліпідів проводили з урахуванням відомих значень R_f розподілу ліпідних плям стандартних розчинів фосфоліпідів та за допомогою якісних реакцій на функціональні групи. Для визначення ліпідних плям платівку обприскували 10% розчином сірчаної кислоти в метанолі. Вміст загальних та індивідуальних фосфоліпідів у ліпідних екстрактах визначали за допомогою молібдатного реагента [Vaskovsky V.E. и др., 1975].
Рівень вільного та естерифікованого холестеролу визначали на газорідинному хроматографі на скляних колонках (0,5 м ) з носієм 1,5 % OV-1 на Chimalite W (80-100 меш) при t +250 ^оC і розраховували відносно стандартного розчину β-ситостеролу.
Метилові ефіри жирних кислот отримували, використовуючи методичні прийоми, наведені W.W Christie [Christie W.W., 1979], після чого проводили кількісний аналіз жирних кислот за допомогою газо-рідинної хроматографії на хроматографі Carlo Erba (Італія) з полум’яно-йонізаційним детектором на скляній колонці, яка була заповнена 10 % фазою SP-2300 (Silar 5 CP) на “Chromosorb W/HP” при програмованій температурі 140-175-225-250 ^о С (2 ^оС /хв).
Сфінгозин визначали за методом, основаним на його властивості утворювати забарвлений комплекс з метилоранжем, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації сфінгозину [Lauter CJ, Trams CG., 1962].
Дослідження in vitro. Щоб з’ясувати можливість впливу NSE на пухлинні клітини іншого типу як онкологічну модель використовували клітини лінії L1210 лейкемічних лімфоцитів миші (♀ № 234, сублінія 212, лінія DBA). Клітини культивували у скляних 20 см² культуральних флаконах Карреля у середовищі DMEM (Sigma, США) з додаванням 10 % сироватки крові плодів великої рогатої худоби (Sigma, США). Для проведення дослідів клітини висівали на пластикові 24-лункові планшети в кількості 5х10⁵ клітин на лунку. В інкубаційне середовище додавали водно-спиртовий розчин NSE (10^-4, 10^-6, 10^-8 М). Час дослідної експозиції – 24 - 96 годин. Оцінку життєздатності клітин проводили за тестом забарвлення трипановим синім. Для виявлення клітин з конденсованим або фрагментованим ядром використовували такі флуоресцентні барвники: DAPI, Хехст 33342 та акридиновий оранжевий.

Для дослідження впливу NSE на інтенсивність апоптозу використовували післяопераційну адренокортикальну тканину надниркових залоз людини (альдостерому та умовно нормальну тканину, що межує з пухлиною), яку одержували з хірургічного відділення Інституту ендокринології та обміну речовин ім.В.П. Комісаренка АМН України. Тканина паралельно досліджувалась патологоанатомами. Післяопераційну тканину надниркових залоз людини переносили на лід, відділяли пухлинну тканину від умовно нормальної, додавали водно-спиртовий розчин NSE (10^-4, 10^-6, 10^-8 М) та інкубували зрізи протягом трьох годин при 37 ^оС в 1 мл інкубаційного середовища. Після 3 годин інкубації проби швидко охолоджували, гомогенізували і виділяли ДНК. Для визначення інтенсивності фрагментації ДНК використовували електрофорез в агарозному гелі. Гелі після електрофорезу фотографували цифровою відеокамерою в трансілюмінаторі. Фрагменти ДНК сканували за допомогою програми „Photo Capt Mw. Кількісну оцінку інтенсивності апоптозу проведено по полосам, що відповідають 400 та 200 пар нуклеотидів. Інтенсивність фрагментації ДНК визначали по долі площі її фрагментів на сканограмі по відношенню до загальної кількості ДНК на доріжці. Дані порівнювали з контрольними зразками пухлинної тканини, до яких додавали водно-спиртовий розчин без NSE.
Статистичний аналіз проводили з використанням t-крітерію Стьюдента; вірогідними вважали дані при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Вплив N-стеароїлетаноламіну на ріст і метастазування карциноми Льюїс у мишей. В результаті досліджень було показано, що NSE гальмує ріст пухлини і на початковій стадії розвитку пухлини, і на етапі вже сформованої неоплазми (введення NSE з 4 дня після перещеплення і з 21 дня після перещеплення, рис.1), при цьому NSE знижує кількість метастазів та зменшує об’єм метастатичного ураження легенів на різних етапах розвитку пухлини (табл.1).Також спостерігається гальмування росту пухлини за умов введення різних доз NSE (рис.2).
Ефект N-стеароїлетаноламіну на ріст клітинної лінії L1210.
Антипухлинний ефект N-стеароїлетаноламіну вивчали також на лейкемічних клітинах лінії L1210 мишей. На рис. 9 показано, що за умов введення NSE спостерігається гальмування проліферації клітин, причому максимальний ефект виявляється через 48 год після введення препарату до клітинного середовища.
 Таким чином, отримані результати свідчать, що N-стеароїлетаноламін може гальмувати ріст пухлини та процес метастазування незалежно від стадії розвитку неоплазми. Антипухлинний ефект NSE спостерігається також на інших типах трансформованих клітин, що в подальшому може бути корисним при застосуванні NSE в антипухлинній терапії.
Вивчення біохімічних показників в легенях мишей пухлиноносіїв, а саме в метастазах та в легеневій тканині, що межує з ними, надасть інформацію щодо розуміння шляхів, за якими реалізується гальмівний ефект N-стеароїлетаноламіну на розвиток карциноми Льюїс.
Вплив NSE на ліпідний склад та рівень пероксигенації в метастазах та умовно нормальній легеневій тканині.
Практично всі захворювання супроводжуються гіперпродукцією активних форм кисню та розвитком окислювального стресу, внаслідок чого відбувається порушення балансу між прооксидантними та антиоксидантними процесами, що призводить до пошкодження макромолекул клітин, зокрема фосфоліпідів. Ліпіди, як структурні та регуляторні компоненти мембран, беруть участь у підтриманні життєдіяльності клітин, регулюючи процеси транспортування, механізми сигнальної трансдукції і міжклітинні взаємодії. Модифікація ліпідного мікрооточення, що обумовлена активацією процесів пероксидації ліпідів, призводить до змін функціонування клітини і, врешті решт, може сприяти апоптозу чи некрозу клітини. Злоякісна клітина під час свого росту набуває нових ознак, які обумовлюють її захист проти цитотоксичних реакцій організму, а саме експресія каталази та активація синтезу простагландинів E₂ забезпечують злоякісні клітини ефективними механізмами захисту проти ефекторів системи імунітету [Popov B.et al, 2003]. В той же час, в органах тварин пухлиноносіїв відбувається зниження антиоксидантної активності ліпідів і підсилення інтенсивності окисних процесів, що призводять до деструкції тканин у хворих тварин. Вільнорадикальні процеси, які в першу чергу впливають на поліненасичені жирні кислоти, порушують стабілізацію біологічних мембран нормальних клітин і призводять до порушень метаболізму.
Вивчення процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) показало, що в умовно нормальній легеневій тканині, яка межує з метастазами, підвищується рівень ТБК-реагуючих продуктів (табл.2), що супроводжується зниженням рівня каталазної активності порівняно з цими показниками для тканини легенів інтактних тварин (рис.3).
Введення NSE підвищує активність ферменту та запобігає накопиченню ТБК-реагуючих продуктів. Метастазна тканина характеризується високим рівнем каталазної активності, яка дозозалежно зменшується у разі перорального введення NSE (рис. 4).
Вивчення ліпідного складу досліджуваних тканин показало, що ліпідний склад карциноми Льюїс порівняно з ліпідним складом легенів інтактних тварин характеризується більш низьким рівнем фосфатидилетаноламіну (РЕ) та фосфатидилсерину (PS) (рис.5). Вміст лізофосфатидилхоліну (LPC) в досліджуваних зразках є значно вищим, ніж у легеневій тканині здорових мишей. Відомо, що лізофосфоліпіди беруть участь в стимуляції проліферативних та міграційних процесів ракових клітин [Raynal P, et al, 2005]. У разі перорального введення тваринам NSE підвищується рівень PS, але зменшується концентрація сфінгомієліну (SM), що може бути пов’язано з активацією сфінгомієлінового циклу та утворенням сфінгозину, відомого активатора апоптозу. Відомо, що PS впливає на активність сфінгомієлінази та індукує апоптоз, що є одним із механізмів гальмування проліферації злоякісних клітин [Дятловицкая Э.В., Кандыба А.Г., 2004.].
В легеневій тканині, що межує з метастазами, за умов пухлинного росту спостерігаються зміни у складі фосфоліпідів, а саме зниження вмісту фосфатидилхоліну (PC), PE, PS, підвищення рівня фосфатидилінозитолу (PI), LPC (рис. 6).
Важливо підкреслити, що LPC в концентраціях вищих за фізіологічні здатен викликати перебудову ліпідного бішару, яка призводить до порушення проникливості мембран. Введення тваринам NSE приводить до змін, спрямованих у бік нормалізації показників PC, PS, LPC.
За умов експерименту в досліджуваних тканинах спостерігаються кореляційні зміни кількості фосфатидилхоліну та лізофосфатидилхоліну. Зважаючи на те, що N-ацилетаноламіни з довжиною ланцюгу 12, 16, 18 атомів вуглецю підвищують активність цитозольної фосфоліпази А2, можна припустити, що введення NSE впливає на активність фосфоліпази А2, регулюючи тим самим процеси обміну РС та LPC. Рівень LPC також залежить від активності лецетин-холестерин-ацилтрансферази (ЛХАТ). Субстратом для ЛХАТ може бути і холестерол ліпопротеідів низької та дуже низької щільності.
Нами було показано, що введення NSE сприяє підвищенню рівня вільного холестеролу, який був вірогідно нижчим за умов пухлинного росту як в умовно нормальній легеневій тканині (рис.7, А), так і в метастазах (рис. 7, Б). Це може змінювати текучість мембран, і, тим самим, впливати на адгезивні властивості та інвазивний потенціал метастазуючих клітин, а також порушувати мережу сигналів, що регулюють життєдіяльність неоплазми.
Зміни ненасиченості жирних кислот, що входять до складу фосфоліпідів, як і зміни вмісту холестеролу, можуть впливати на текучість мембрани і порушувати різні метаболічні процеси та функції клітин.
Вивчення жирнокислотного складу сумарних фосфоліпідів за умов досліду показало, що NSE змінює співвідношення насичених / ненасичених жирних кислот і в метастазах і в умовно нормальній тканині легенів, що межує з ними (табл. 3, табл.4).
В умовно нормальній легеневій тканині за умов присутності метастазів спостерігаються зміни жирнокислотного складу в бік підвищення ненасиченості сумарних фосфоліпідів. NSE сприяє нормалізації цього показника у мишей в групі „Пухлина + NSE 1 мг”.
Цікаво, що в злоякісних клітинах карциноми рівень насиченості жирних кислот сумарних фосфоліпідів майже однаковий з цим показником в інтактних легенях. Введення NSE підвищує рівень ненасичених жирних кислот, що в подальшому може спонукати до порушень функціонування злоякісних клітин.
Проаналізувавши дані щодо рівню жирних кислот та кількості холестеролу в досліджуваних тканинах, можна припустити, що за умов введення NSE відбуваються компенсаторні явища, можливо для зберігання (або для відтворення) фізико-хімічних властивостей мембран, характерних здоровим клітинам.
 Вплив N-стеароїлетаноламіну на вміст метаболітів перетворення
L-аргініну в печінці мишей з карциномою Льюїс.
Ендоканабіноїдна система в організмі тісно співпрацює з багатьма іншими механізмами, що беруть участь у регуляції низки фізіологічних процесів, зокрема з системою оксиду азоту (NO). Показано, що NO впливає на транспортування NAE крізь плазматичну мембрану клітин, регулюючи активність специфічних мембранних транспортерів [Maccarrone M, et al., 2000]. Доведено також, що анандамід та деякі інші ендогенні канабіноїди беруть участь у модуляції відповіді організму на запальні процеси, шляхом інгібування активності індуцибельної ізоформи NO-синтази [Stefano GB, et al., 1998]. Відомо, що метаболізм аргініну, а саме певний баланс між ферментами його перетворення відіграють ключову роль в прогресії пухлини. Підвищення рівня експресії індуцибельної NO-синтази призводить до генерації у великих кількостях оксиду азоту, який в такій ситуації виявляє цитотоксичну дію і індукує пошкодження ДНК. Активація аргінази призводить до продукції орнітина та поліамінів, відомих промоторів клітинної проліферації. Тому доцільно було дослідити вплив N-стеароїлетаноламіну на вміст метаболітів перетворення аргініну за умов розвитку пухлини in vivo. Результати досліджень показали, що в печінці мишей, яким було перещеплено карциному Люїс, спостерігається активація неокисного перетворення L-аргініну, що призводить до утворення поліамінів, відомих регуляторів проліфераційних процесів (рис. 8). Введення NSE з 4 дня після перещеплення пухлини сприяло зниженню вдвічі вмісту поліамінів і зростанню вмісту нітрит (NO₂^-) та нітрат (NO₃^- ) аніонів в печінці у мишей пухлиноносіїв (табл. 5), а з 21 дня викликало нормалізацію вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту та поліамінів (див. рис.8 і табл.5).
Отримані результати дають можливість припустити, що ефекти N-стеароїлетаноламіну можуть бути обумовлені його регуляторним впливом на активність ізоформ NO-синтази.
Дослідження інтенсивності фрагментації ДНК в тканинах надниркових залоз людини при інкубації з N-стеароїлетаноламіном.
В результаті досліджень ліпідного складу тканин мишей виникло припущення, що зменшення вмісту сфінгомієліну в метастазах за перорального введення NSE може сприяти індукції проапоптотичних сигналів. Аналіз впливу N-стеароїлетаноламіну на розвиток пухлини ми продовжили на пухлинній тканині надниркових залоз людини. Вивчали інтенсивність фрагментації ДНК, вміст сфінгозину та склад фосфоліпідів при інкубації пухлинної тканини з NSE.
В результаті роботи було показано, що N-стеароїлетаноламін не посилює рівень апоптозу в пухлинних тканинах надниркових залоз людини in vitro (дані не представлені).
Дослідження дії NSE в комбінованій терапії з Цисплатином.
Для лікування багатьох злоякісних пухлин використовується Цисплатин. Порушення функціонування нирок є основним фактором токсичності цього препарату. Тому необхідно підкреслити важливість застосування в лікуванні онкозахворювань супровідної терапії, що передбачає використання засобів, які гальмують пухлинний ріст та сприяють поліпшенню стану організму, послаблюючи дію токсичних речовин. Посилаючись на мембранопротекторні та антиоксидантні властивості N-ацилетаноламінів, доцільним було дослідити вплив N-стеароїлетаноламіну на розвиток пухлини у мишей з карциномою Льюїс на фоні цитотоксичної терапії Цисплатином. В таблиці 6 показано, що введення Цисплатину гальмує ріст основного вузла і зменшує кількість метастазів в легенях та об’єм метастатичного ураження легеневої тканини у мишей, порівняно з тваринами пухлиноносіями в групі „Контроль”. Введення NSE не впливає на ефект Цисплатину.
Як видно з рисунку 11 за умов введення NSE на фоні терапії Цисплатином рівень сечовини дозозалежно знижується, що демонструє антитоксичний ефект N-стеароїлетаноламіну.
Таким чином, при використанні в комплексній протипухлинній терапії NSE не погіршує цитостатичний ефект Цисплатину. Також NSE здатний зменшувати рівень токсичної дії Цисплатину, що виражається в зниженні рівня сечовини.

ВИСНОВКИ
Проведений комплекс досліджень показав, що N-стеароїлетаноламін (NSE) гальмує ріст карциноми Льюїс, зменшує кількість метастазів і об’єм метастатичного ураження легенів за умов його введення на різних стадіях розвитку пухлини та виявляє різноспрямовані ефекти на злоякісні та умовно нормальні тканини в організмі пухлиноносія.
1. Введення NSE призводить до зменшення активності каталази в метастазах у мишей з карциномою Льюїс, що порушує антиоксидантний захист пухлини і робить її більш вразливою до дії захисних реакцій організму. В той же час в умовно нормальній тканині легенів NSE підвищує рівень каталази і гальмує накопичення продуктів перекисного окислення ліпідів, що сприяє нормалізації окисних процесів в легенях.
2. Встановлено здатність NSE коригувати ліпідний склад умовно нормальної тканини легенів в бік нормалізації вмісту фосфоліпідів і вільного холестеролу. Одночасно NSE змінює ліпідну організацію злоякісних клітин: спостерігається підвищення рівня вільного холестеролу та зростає відсоткове співвідношення поліненасичених жирних кислот ω-6 / ω-3 рядів в сумарних фосфоліпідах.
3. Встановлено здатність NSE зменшувати рівень сумарних поліамінів в печінці пухлиноносіїв та нормалізувати вміст стабільних метаболітів оксиду азоту.
4. Показано, що в сумісній антипухлинній терапії з Цисплатином NSE не погіршує цитостатичний ефект Цисплатину і знижує рівень сечовини в крові мишей пухлиноносіїв, що вказує на послаблення токсичної дії Цисплатину.
5. Інкубація лейкемічних клітин миші з NSE призводить до гальмування клітинного росту та знижує рівень виживання цих клітин.
Отже, вперше встановлено, що NSE впливає на обмін речовин в пухлині та умовно нормальних тканинах таким чином, що в результаті в організмі розвивається “послаблена” пухлина, а показники умовно нормальних тканин змінюються в бік нормалізації.

АНОТАЦІЯ
Хмель Т.О. Вплив N-стеароїлетаноламіну на ліпідний склад злоякісних та умовно нормальних клітин. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2008.
В дисертаційній роботі досліджено вплив N-стеароїлетаноламіну (NSE)на ріст злоякісних клітин in vivo та in vitro, а також їх метастазування і з’ясовані можливі шляхи реалізації гальмуючої дії NSE на розвиток пухлини.
Вперше показано, що NSE здатен гальмувати ріст та метастазування карциноми Льюїс у мишей за умов його введення на різних етапах розвитку пухлини. З’ясовано, що NSE сприяє зменшенню активності каталази в метастазах у мишей з карциномою Льюїс. В той же час в умовно нормальній тканині легенів NSE підвищує активність каталази і гальмує накопичення продуктів перекисного окислення ліпідів. Встановлено здатність NSE модулювати ліпідний склад умовно нормальної тканини легенів, що призводить до змін в бік нормалізації фосфоліпідного спектру і вільного холестеролу. Одночасно NSE змінює ліпідну організацію злоякісних клітин: спостерігається підвищення рівня вільного холестеролу та змінюється склад жирних кислот в сумарних фосфоліпідах. Встановлено здатність NSE гальмувати накопичення поліамінів та нормалізувати вміст стабільних метаболітів NO в печінці мишей-пухлиноносіїв.
 Аналіз експериментальних даних показав, що NSE порушує регуляцію обміну в злоякісних клітинах, а в умовно нормальних тканинах виявляє протекторні властивості і покращує загальний стан тварин пухлиноносіїв. Показано, що в сумісній антипухлинній терапії з Цисплатином NSE не погіршує цитостатичний ефект Цисплатину і знижує рівень сечовини в крові мишей пухлиноносіїв, що вказує на послаблення токсичної дії Цисплатину.
Ключові слова: N-стеароїлетаноламін, злоякісний ріст, фосфоліпіди, жирні кислоти, холестерол, пероксидне окислення ліпідів, оксид азоту.

АННОТАЦИЯ
Хмель Т.А. Влияние N-стеароилэтаноламина на липидный состав злокачественных и условно нормальных клеток. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2008.
В диссертационной работе исследовано влияние N-стеароилэтаноламина (NSE) на рост злокачественных клеток in vivo и in vitro, а также их метастазирование и выяснены возможные механизмы реализации антипролиферативного еффекта NSE. Впервые было показано, что NSE способен тормозить рост и метастазирование карциномы Льюис у мышей при его введении на разных сроках развития опухоли и проявляет разнонаправленные эффекты на злокачественные и условно нормальные ткани в организме опухоленосителя. При этом NSE снижает уровень каталазной активности, что нарушает антиоксидантную защиту карциномы Льюис и в то же время в условно нормальной легочной ткани активирует каталазу и снижает уровень продуктов перекисного окисления липидов, что способствует нормализации перекисных процессов в легких опухоленосителя. В условно нормальной легочной ткани при условии развития в ней метастазов увеличивается уровень ненасыщенных жирных кислот в составе суммарных фосфолипидов.
Установлено, что NSE способен модулировать липидный состав условно нормальной ткани легких, нормализуя фосфолипидный спектр и его жирнокислотный состав, а также уровень свободного холестерола.
Одновременно NSE изменяет липидную организацию злокачественных клеток:наблюдается увеличение уровня свободного холестерола и изменяется спектр жирных кислот в составе суммарных фосфолипидов. Показано, что в печени мышей опухоленосителей под действием NSE снижается уровень суммарных полиаминов, известных активаторов пролиферации и изменяется в сторону нормализации содержание стабильных метаболитов оксида азота.
Анализ экспериментальных данных показал, что NSE влияет на обмен веществ в злокачественных клетках, а в условно нормальных тканях проявляет протекторные свойства и улучшает общее состояние животных опухоленосителей. Антиопухолевый эффект NSE наблюдается также на мышиных лейкемичных клетках линии L1210.
Показано, что при сопровождающей антиопухолевой терапии с Цисплатином NSE не влияет на цитостатический эффект Цисплатина, но при этом снижает уровень мочевины в плазме крови опухоленосителя и тем самым уменьшает токсический эффект Цисплатина на организм.
Ключевые слова: N-стеароилэтаноламин, злокачественный рост, фосфолипиды, жирные кислоты, холестерол, перекисное окисление липидов, оксид азота.

SUMMARY
Khmel T.O. The influence of N-stearoylethanolamine on the lipid composition of malignant and conditionally normal cells.– Manuscript.
Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 – Biochemistry. Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.
This manuscript is devoted to the study of the influence of N-stearoylethanolamine (NSE) on the growth and metastasis of malignant cells in vivo and in vitro. It is directed to elucidation of possible mechanisms of realization of the antiproliferativity effect of NSE. For the first time it was shown that NSE arrests the growth and metastasis of Lewis carcinoma in mice at the different stages of tumor development. It was demonstrated that NSE disturbs the antioxidant protection of cells of the Lewis carcinoma and at the same time it inhibits processes of peroxidation in the adjacent conditionally normal lung tissue.
It was found that under tumor development NSE modulated the lipid composition of the adjacent lung tissue. NSE normalized the phospholipid content as well as the level of free cholesterol. Simultaneously NSE changed the lipid organization of malignant cells: the level of free cholesterol increased and the content of fatty acids esterified in phospholipids changed. It was shown that NSE administration normalized the content of NO metabolites in liver of tumor-bearing mice. The analysis of experimental data has shown that NSE was possessed by the protective properties: it disturbs the metabolism of malignant cells and improves the state of tumor-bearing animals.
N-stearoylethanolamine was shown in decreasing the toxic effect of antitumor cisplatin treatment.
Keywords: N-stearoylethanolamine, malignant growth, phospholipids, fatty acids, cholesterol, lipid peroxidation, nitric oxide.