Реферат на тему Вплив факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів людини
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2014-12-28Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
Книш Оксана Василівна
УДК: 547.42:612.111.7
ВПЛИВ ФАКТОРІВ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ НА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ТРОМБОЦИТІВ ЛЮДИНИ
14.01.35 – кріомедицина
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Науковий керівник:
доктор медичних наук Компанієць Антоніна Михайлівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріопротекторів, м. Харків
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Шепітько Володимир Іванович, Вищий державний навчальний заклад України “Українська медична стоматологічна академія”, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології, м. Полтава
доктор біологічних наук, професор Субота Ніна Павлівна, Харківський національний педагогічний університет імені Г. C. Сковороди, завідувач кафедри валеології, м. Харків
Захист відбудеться “22” січня 2008 р. о “1330” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).
Автореферат розісланий “19” грудня 2007 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
член-кореспондент НАН України,
доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження, спрямовані на створення ефективної технології низькотемпературного консервування кров’яних пластинок, ведуться упродовж декількох десятиліть. Проте, значних успіхів у даному напрямку досягти не вдалося. Як було зазначено провідними вченими на Міжнародному симпозіумі з кріоконсервування тромбоцитів крові людини (Pittsburgh, Pennsylvania, USA, 1998), емпіричний підхід, на якому базувалися такі дослідження, не дозволив розробити метод кріоконсервування тромбоцитів, що задовольнив би клініцистів за рівнем їх лікувальної ефективності та безпечністю кріоконсерванта для реципієнта. Є нагальна потреба у дослідженні факторів, що можуть впливати на життєздатність кров’яних пластинок на всіх етапах технологічного процесу низькотемпературного консервування – від виділення концентратів тромбоцитів до їх застосування, із залученням адекватних та інформативних методів оцінки структурної цілісності та функціональних властивостей клітин [Reid T.J. et al., 1999; Gao D. et al., 1999; Crowe J.H. et al., 1999; Woods E.J. et al., 1999; Dijkstra-Tiekstra M.J. et al., 2003; Balint B. et al., 2006].
Диметилсульфоксид (ДМСО) у кінцевій концентрації 5 – 6 % забезпечує найбільш високий рівень морфофункціональної збереженості кров’яних пластинок порівняно з іншими кріопротекторами, тому спосіб заморожування з ним визнаний “золотим стандартом” [Reid T.J. and Gao D., 1999]. Однак, трансфузії кріоконсервованих з ДМСО концентратів тромбоцитів несуть небезпеку виникнення у реципієнта серйозних побічних ефектів [Curcoy A.I. et al., 2002]. Обов’язковим є етап видалення ДМСО із суспензії відігрітих клітин, що супроводжується додатковими кількісними втратами кров’яних пластинок та зниженням їх функціонального потенціалу. Існуючі модифікації методу заморожування тромбоцитів з ДМСО [Lozano M. L. et al., 2000; Valery R.C. et al., 2005] дають можливість уникнути процедури видалення кріопротектора, але не дозволяють повністю позбутися його токсичного ефекту. Диметилацетамід (ДМАЦ) менш токсичний, ніж ДМСО, але поступається йому за кріозахисними властивостями [Компаниец А.М., 1980; 1992; Азовская С.А. и др., 1989]. Щодо 1,2-пропандіолу (1,2-ПД) існують протилежні думки: одні автори вважають дану сполуку перспективною при кріоконсервуванні тромбоцитів [Компаниец А.М. и др., 1992], інші наголошують на її слабкій кріозахисній дії [Arnaud F.G and Pegg D.E., 1990]. Таким чином, проблема вибору кріопротектора та визначення оптимального за складом кріозахисного середовища для кріоконсервування тромбоцитів потребує подальшого вирішення.
Як доведено дослідженнями останніх років [Balint B. et al., 2006; Bilynets T. et al., 2006; Kyryliuk еt al., 2006], швидкість охолодження біологічного об’єкта повинна підбиратися з урахуванням конкретних фізико-хімічних явищ і процесів, що спостерігаються в різних температурних інтервалах. Саме тому існуючі програми заморожування кров’яних пластинок, що підбиралися емпірично, потребують перегляду і розробки рекомендацій щодо їх оптимізації.
Дослідження впливу факторів кріоконсервування є актуальними і мають стати основою теоретично і експериментально обґрунтованої стратегії низькотемпературного консервування концентратів тромбоцитів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом НДР ІПКіК НАН України у відділі кріопротекторів в рамках теми 2.2.6.95 “Вивчення ефективності етоксилатів поліолів (метил- і амідозаміщених) в якості кріопротекторів для кріоконсервування компонентів крові, клітин і тканин фетоплацентарного комплексу людини і тварин”, номер держреєстрації 0101U003481; теми 2.2.6.30 “Вивчення закономірностей кріозахисної дії та токсичних властивостей багатокомпонентних середовищ на основі нових кріопротекторів рядів поліолів і амідів при кріоконсервуванні клітин і загальному охолодженні організму гомойотермних тварин”, номер держреєстрації 0106U002166.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – дослідити вплив ряду факторів кріоконсервування на збереженість структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів на етапах низькотемпературного консервування.
Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:
1. Дослідити у порівняльному аспекті ефективність кріоконсервування концентратів тромбоцитів, виділених з донорської крові двома методами: із збагаченої тромбоцитами плазми та лейко-тромбоцитарного шару, за умови подовження терміну їх зберігання перед заморожуванням до 18 – 24 годин при 22 ± 2 єС.
2. Вивчити антирадикальні властивості кріопротекторів різних класів хімічних сполук за здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі та дослідити їх вплив на інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” на етапі експозиції.
3. Дослідити вплив кріопротекторів: диметилсульфоксиду, диметилацетаміду та 1,2-пропандіолу на структурну цілісність і функціональні властивості тромбоцитів на етапі експозиції.
4. Визначити вплив швидкості охолодження кріобіологічної системи у температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур на структурну цілісність та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів.
5. Оцінити ефективність кріоконсервування концентратів тромбоцитів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу (диметилсульфоксид, диметилацетамід, 1,2-пропандіол, комбінації диметилацетаміду і 1,2-пропандіолу).
Об’єкт дослідження – зміни параметрів структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів крові людини під впливом факторів кріоконсервування.
Предмет дослідження – тромбоцити крові людини.
Методи дослідження – кріобіологічні, біохімічні, цитологічні, гематологічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у порівняльному аспекті вивчено вплив комплексу факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів, що були виділені з донорської крові двома методами – із збагаченої тромбоцитами плазми і лейко-тромбоцитарного шару та зберігалися перед заморожуванням протягом 18 – 24 годин при 22 ± 2 єC.
Встановлено фактори, які мають визначальний вплив на ефективність кріоконсервування тромбоцитів – склад кріозахисного середовища та швидкість охолодження кріобіологічної системи в інтервалі кристалізації і зоні евтектичних температур. Вперше експериментально доведена доцільність використання при заморожуванні тромбоцитів комбінації кріопротекторів – ДМАЦ та 1,2-ПД. Теоретично обґрунтована і експериментально апробована програма заморожування концентратів тромбоцитів з оптимальними швидкостями проходження температурного інтервалу кристалізації. Вагомим підтвердженням важливості застосування розробленої програми охолодження є вперше встановлений факт збереження структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів при їх заморожуванні без кріопротектора, за умови поєднання процедури температурної ініціації кристалізації з наступною контрольованою швидкістю охолодження в температурному інтервалі від 0/-1,5 до -35…-40 єC.
Вперше проведене порівняльне дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів різних класів хімічних сполук та їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Показано, що характер впливу кріопротекторів на інтенсивність процесів ПОЛ у системі визначається, перш за все, їх хімічною природою, а не здатністю до перехоплення гідроксильних радикалів. Експериментально встановлено, що 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 0,7 М не впливають на рівень пероксидації ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” на етапі експозиції.
Практичне значення одержаних результатів. Експериментально встановлена висока ефективність способу кріоконсервування концентратів тромбоцитів у кріозахисному середовищі на основі комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,7 М при застосуванні розробленої програми заморожування з контрольованою швидкістю охолодження у температурному інтервалі кристалізації, дозволяє рекомендувати його при подальшому створенні технології довгострокового зберігання тромбоцитів для клінічного застосування. Практичне значення для роботи низькотемпературних банків крові мають отримані у роботі експериментальні дані про можливість збільшення до 18 – 24 годин проміжку часу між виділенням і заморожуванням концентратів тромбоцитів (загальноприйнятий термін 4 – 6 годин) за умови їх зберігання при температурі 22 ± 2 єC і постійному перемішуванні. Розроблено новий спосіб максимального видалення кріопротекторів із суспензії тромбоцитів за умов мінімального механічного та осмотичного навантаження на кров’яні пластинки [Пат. №15014 Україна, 2006]. Показано, що для більш повної оцінки морфофункціонального стану тромбоцитів на етапах кріоконсервування доцільним є застосування методу люмінесцентної мікроскопії, який базується на різній здатності кров’яних пластинок акумулювати акридиновий оранжевий (АО) в залежності від їх структурної цілісності та функціональних властивостей.
Особистий внесок дисертанта. Дисертантом самостійно підготовлено огляд літератури за темою дисертації, отримано експериментальні дані, проведено статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів досліджень. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:
– в роботах [2,6,7,8,9] у визначенні інтенсивності ПОЛ в системах “тромбоцити-плазма”, “тромбоцити-плазма-кріопротектор”; дослідженні здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі; проведенні статистичної обробки отриманих результатів;
– в роботах [1,3,4,5] у здійсненні виділення концентратів тромбоцитів, плануванні та проведенні експериментів з дослідження впливу методу виділення концентратів тромбоцитів, кріопротекторів, режимів заморожування на морфофункціональні властивості тромбоцитів; відпрацюванні способу видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів; проведенні статистичної обробки отриманих результатів; визначенні ступеня пошкодження тромбоцитів за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі; відпрацюванні методики приготування цитологічних препаратів та проведенні люмінесцентної мікроскопії.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на щорічній конференції молодих учених ІПКіК НАН України “Холод у біології і медицині” (Харків, 2005 рік); конференції молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2005” (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005 рік); 4-й національній науково-практичній конференції з міжнародною участю “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленськ, Росія, 2005 рік), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 рік).
Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 9 робіт, з яких: 4 наукових статті у спеціалізованих фахових виданнях, 4 тез доповідей на наукових конференціях, 1 деклараційний патент на корисну модель.
Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 162 сторінках друкованого тексту, з яких 124 сторінки основного змісту. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, переліку використаних літературних джерел (22 сторінки), що вміщує 222 джерела. Дисертацію ілюстровано 7 таблицями та 48 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень
Матеріалом для досліджень були концентрати тромбоцитів (КТ), отримані фракціонуванням донорської крові, заготовленої на консерванті “Глюгіцир” в полімерні контейнери “Гемакон”. Виділення КТ здійснювали двома методами: із збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) [Волкова Р.И. и др., 1992] та з лейко-тромбоцитарного шару (ЛТШ) [Аграненко В.А. и др., 1991]. Перед проведенням експериментальних досліджень КТ зберігали у контейнерах “Компопласт” до 18 – 24 годин при 22 ± 2 єC в умовах постійного перемішування зі швидкістю 2 об/хв. У межах 2 – 4 годин після виділення КТ визначали його кількісний склад [Перфильева Е.А. и др., 2003; Ронин В.С., 1983].
У роботі використовували кріопротектори: ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ, гліцерин (ГЛ), оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 (ОЕГn=5), очищені та ідентифіковані у відділі кріопротекторів ІПКіК НАН України. З метою мінімізації осмотичного стресу додавання розчинів кріопротекторів до КТ у співвідношенні 1:1 здійснювали при 22 ± 2 єC у відповідності до рекомендованих схем [Arnaud F.G. et al., 1990; Компаниец А.М., 1992; 1995; Woods E.J. et al., 1999]. Дослідження здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі їх генерації проводили за методом [Halliwell B. еt al., 1987]. Визначення вмісту гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у системах “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” здійснювали за методом [Asakawa J., 1980]. Кінцеві концентрації ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складали 0,5; 0,7 та 1 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М; час експозиції КТ з кріопротекторами – 5; 15; 30 хвилин. Інтенсивність індукованого іонами заліза ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” визначали за методом [Владимиров Ю.А., 1972] одразу після введення індуктора та через 15 і 30 хвилин. Кінцева концентрація ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складала 0,7 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М.
Морфофункціональні властивості тромбоцитів: здатність накопичувати АО [Деменко В.Д. и др., 1990], здатність до індукованої АДФ та колагеном агрегації [Born G.V.R., 1962], реакцію на гіпотонічний шок (РГШ) [Компаниец А.М., 1992] досліджували у межах 2 – 4 годин після виділення КТ та після 18 – 24 годин зберігання, а також після експозиції КТ з ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ у кінцевих концентраціях 0,7 та 1,4 М протягом 5; 30 хвилин і наступного видалення кріопротекторів розробленим способом [Пат. № 15014 Україна, 2006]. Агрегаційну здатність тромбоцитів додатково визначали у присутності вищезазначених кріопротекторів у кінцевій концентрації 0,1 М. Ступінь пошкодження кров’яних пластинок на етапах виділення та зберігання КТ визначали за активністю у супернатанті ферменту лактатдегідрогенази (ЛДГ) [Лемешко В.В. и др., 1989]. Ступінь пошкодження тромбоцитів на етапі експозиції КТ з кріопротекторами визначали за активністю у супернатанті ферментів: ЛДГ та Г6ФДГ [Родионова В.Л. и др., 2005]. Кінцеві концентрації ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ складали 0,7 М, а комбінацій ДМАЦ + 1,2-ПД: 0,7 та 0,35 М; час експозиції КТ з кріопротекторами та їх комбінаціями становив 15 хвилин.
Кріозахисні розчини (1,4 М ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ДМАЦ + 1,2-ПД та 0,7 М ДМАЦ + 1,2-ПД на плазмі, плазма без кріопротектора) вводили в КТ у співвідношенні 1:1 при 22 ± 2 єC протягом 1 хвилини, одразу після чого здійснювали заморожування зразків за допомогою програмного заморожувача “Cryoson” (Німеччина) у кріоампулах “Nunc”. Об’єм зразка становив 1,6 мл.
При порівняльному дослідженні ефективності кріоконсервування КТ, виділених з донорської крові двома методами, застосовували ДМСО у кінцевій концентрації 0,7 М та програму заморожування №1.
При дослідженні впливу процедури заморожування КТ в температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 °C) на показники структурної цілісності і функціональних властивостей кріоконсервованих тромбоцитів застосовували наступні програми: ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ
Книш Оксана Василівна
УДК: 547.42:612.111.7
ВПЛИВ ФАКТОРІВ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ НА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ТРОМБОЦИТІВ ЛЮДИНИ
14.01.35 – кріомедицина
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Науковий керівник:
доктор медичних наук Компанієць Антоніна Михайлівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріопротекторів, м. Харків
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Шепітько Володимир Іванович, Вищий державний навчальний заклад України “Українська медична стоматологічна академія”, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології, м. Полтава
доктор біологічних наук, професор Субота Ніна Павлівна, Харківський національний педагогічний університет імені Г. C. Сковороди, завідувач кафедри валеології, м. Харків
Захист відбудеться “22” січня 2008 р. о “1330” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).
Автореферат розісланий “19” грудня 2007 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
член-кореспондент НАН України,
доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження, спрямовані на створення ефективної технології низькотемпературного консервування кров’яних пластинок, ведуться упродовж декількох десятиліть. Проте, значних успіхів у даному напрямку досягти не вдалося. Як було зазначено провідними вченими на Міжнародному симпозіумі з кріоконсервування тромбоцитів крові людини (Pittsburgh, Pennsylvania, USA, 1998), емпіричний підхід, на якому базувалися такі дослідження, не дозволив розробити метод кріоконсервування тромбоцитів, що задовольнив би клініцистів за рівнем їх лікувальної ефективності та безпечністю кріоконсерванта для реципієнта. Є нагальна потреба у дослідженні факторів, що можуть впливати на життєздатність кров’яних пластинок на всіх етапах технологічного процесу низькотемпературного консервування – від виділення концентратів тромбоцитів до їх застосування, із залученням адекватних та інформативних методів оцінки структурної цілісності та функціональних властивостей клітин [Reid T.J. et al., 1999; Gao D. et al., 1999; Crowe J.H. et al., 1999; Woods E.J. et al., 1999; Dijkstra-Tiekstra M.J. et al., 2003; Balint B. et al., 2006].
Диметилсульфоксид (ДМСО) у кінцевій концентрації 5 – 6 % забезпечує найбільш високий рівень морфофункціональної збереженості кров’яних пластинок порівняно з іншими кріопротекторами, тому спосіб заморожування з ним визнаний “золотим стандартом” [Reid T.J. and Gao D., 1999]. Однак, трансфузії кріоконсервованих з ДМСО концентратів тромбоцитів несуть небезпеку виникнення у реципієнта серйозних побічних ефектів [Curcoy A.I. et al., 2002]. Обов’язковим є етап видалення ДМСО із суспензії відігрітих клітин, що супроводжується додатковими кількісними втратами кров’яних пластинок та зниженням їх функціонального потенціалу. Існуючі модифікації методу заморожування тромбоцитів з ДМСО [Lozano M. L. et al., 2000; Valery R.C. et al., 2005] дають можливість уникнути процедури видалення кріопротектора, але не дозволяють повністю позбутися його токсичного ефекту. Диметилацетамід (ДМАЦ) менш токсичний, ніж ДМСО, але поступається йому за кріозахисними властивостями [Компаниец А.М., 1980; 1992; Азовская С.А. и др., 1989]. Щодо 1,2-пропандіолу (1,2-ПД) існують протилежні думки: одні автори вважають дану сполуку перспективною при кріоконсервуванні тромбоцитів [Компаниец А.М. и др., 1992], інші наголошують на її слабкій кріозахисній дії [Arnaud F.G and Pegg D.E., 1990]. Таким чином, проблема вибору кріопротектора та визначення оптимального за складом кріозахисного середовища для кріоконсервування тромбоцитів потребує подальшого вирішення.
Як доведено дослідженнями останніх років [Balint B. et al., 2006; Bilynets T. et al., 2006; Kyryliuk еt al., 2006], швидкість охолодження біологічного об’єкта повинна підбиратися з урахуванням конкретних фізико-хімічних явищ і процесів, що спостерігаються в різних температурних інтервалах. Саме тому існуючі програми заморожування кров’яних пластинок, що підбиралися емпірично, потребують перегляду і розробки рекомендацій щодо їх оптимізації.
Дослідження впливу факторів кріоконсервування є актуальними і мають стати основою теоретично і експериментально обґрунтованої стратегії низькотемпературного консервування концентратів тромбоцитів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом НДР ІПКіК НАН України у відділі кріопротекторів в рамках теми 2.2.6.95 “Вивчення ефективності етоксилатів поліолів (метил- і амідозаміщених) в якості кріопротекторів для кріоконсервування компонентів крові, клітин і тканин фетоплацентарного комплексу людини і тварин”, номер держреєстрації 0101U003481; теми 2.2.6.30 “Вивчення закономірностей кріозахисної дії та токсичних властивостей багатокомпонентних середовищ на основі нових кріопротекторів рядів поліолів і амідів при кріоконсервуванні клітин і загальному охолодженні організму гомойотермних тварин”, номер держреєстрації 0106U002166.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – дослідити вплив ряду факторів кріоконсервування на збереженість структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів на етапах низькотемпературного консервування.
Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:
1. Дослідити у порівняльному аспекті ефективність кріоконсервування концентратів тромбоцитів, виділених з донорської крові двома методами: із збагаченої тромбоцитами плазми та лейко-тромбоцитарного шару, за умови подовження терміну їх зберігання перед заморожуванням до 18 – 24 годин при 22 ± 2 єС.
2. Вивчити антирадикальні властивості кріопротекторів різних класів хімічних сполук за здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі та дослідити їх вплив на інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” на етапі експозиції.
3. Дослідити вплив кріопротекторів: диметилсульфоксиду, диметилацетаміду та 1,2-пропандіолу на структурну цілісність і функціональні властивості тромбоцитів на етапі експозиції.
4. Визначити вплив швидкості охолодження кріобіологічної системи у температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур на структурну цілісність та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів.
5. Оцінити ефективність кріоконсервування концентратів тромбоцитів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу (диметилсульфоксид, диметилацетамід, 1,2-пропандіол, комбінації диметилацетаміду і 1,2-пропандіолу).
Об’єкт дослідження – зміни параметрів структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів крові людини під впливом факторів кріоконсервування.
Предмет дослідження – тромбоцити крові людини.
Методи дослідження – кріобіологічні, біохімічні, цитологічні, гематологічні, статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у порівняльному аспекті вивчено вплив комплексу факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів, що були виділені з донорської крові двома методами – із збагаченої тромбоцитами плазми і лейко-тромбоцитарного шару та зберігалися перед заморожуванням протягом 18 – 24 годин при 22 ± 2 єC.
Встановлено фактори, які мають визначальний вплив на ефективність кріоконсервування тромбоцитів – склад кріозахисного середовища та швидкість охолодження кріобіологічної системи в інтервалі кристалізації і зоні евтектичних температур. Вперше експериментально доведена доцільність використання при заморожуванні тромбоцитів комбінації кріопротекторів – ДМАЦ та 1,2-ПД. Теоретично обґрунтована і експериментально апробована програма заморожування концентратів тромбоцитів з оптимальними швидкостями проходження температурного інтервалу кристалізації. Вагомим підтвердженням важливості застосування розробленої програми охолодження є вперше встановлений факт збереження структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів при їх заморожуванні без кріопротектора, за умови поєднання процедури температурної ініціації кристалізації з наступною контрольованою швидкістю охолодження в температурному інтервалі від 0/-1,5 до -35…-40 єC.
Вперше проведене порівняльне дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів різних класів хімічних сполук та їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Показано, що характер впливу кріопротекторів на інтенсивність процесів ПОЛ у системі визначається, перш за все, їх хімічною природою, а не здатністю до перехоплення гідроксильних радикалів. Експериментально встановлено, що 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 0,7 М не впливають на рівень пероксидації ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” на етапі експозиції.
Практичне значення одержаних результатів. Експериментально встановлена висока ефективність способу кріоконсервування концентратів тромбоцитів у кріозахисному середовищі на основі комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,7 М при застосуванні розробленої програми заморожування з контрольованою швидкістю охолодження у температурному інтервалі кристалізації, дозволяє рекомендувати його при подальшому створенні технології довгострокового зберігання тромбоцитів для клінічного застосування. Практичне значення для роботи низькотемпературних банків крові мають отримані у роботі експериментальні дані про можливість збільшення до 18 – 24 годин проміжку часу між виділенням і заморожуванням концентратів тромбоцитів (загальноприйнятий термін 4 – 6 годин) за умови їх зберігання при температурі 22 ± 2 єC і постійному перемішуванні. Розроблено новий спосіб максимального видалення кріопротекторів із суспензії тромбоцитів за умов мінімального механічного та осмотичного навантаження на кров’яні пластинки [Пат. №15014 Україна, 2006]. Показано, що для більш повної оцінки морфофункціонального стану тромбоцитів на етапах кріоконсервування доцільним є застосування методу люмінесцентної мікроскопії, який базується на різній здатності кров’яних пластинок акумулювати акридиновий оранжевий (АО) в залежності від їх структурної цілісності та функціональних властивостей.
Особистий внесок дисертанта. Дисертантом самостійно підготовлено огляд літератури за темою дисертації, отримано експериментальні дані, проведено статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів досліджень. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:
– в роботах [2,6,7,8,9] у визначенні інтенсивності ПОЛ в системах “тромбоцити-плазма”, “тромбоцити-плазма-кріопротектор”; дослідженні здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі; проведенні статистичної обробки отриманих результатів;
– в роботах [1,3,4,5] у здійсненні виділення концентратів тромбоцитів, плануванні та проведенні експериментів з дослідження впливу методу виділення концентратів тромбоцитів, кріопротекторів, режимів заморожування на морфофункціональні властивості тромбоцитів; відпрацюванні способу видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів; проведенні статистичної обробки отриманих результатів; визначенні ступеня пошкодження тромбоцитів за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі; відпрацюванні методики приготування цитологічних препаратів та проведенні люмінесцентної мікроскопії.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на щорічній конференції молодих учених ІПКіК НАН України “Холод у біології і медицині” (Харків, 2005 рік); конференції молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2005” (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005 рік); 4-й національній науково-практичній конференції з міжнародною участю “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленськ, Росія, 2005 рік), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 рік).
Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 9 робіт, з яких: 4 наукових статті у спеціалізованих фахових виданнях, 4 тез доповідей на наукових конференціях, 1 деклараційний патент на корисну модель.
Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 162 сторінках друкованого тексту, з яких 124 сторінки основного змісту. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, переліку використаних літературних джерел (22 сторінки), що вміщує 222 джерела. Дисертацію ілюстровано 7 таблицями та 48 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень
Матеріалом для досліджень були концентрати тромбоцитів (КТ), отримані фракціонуванням донорської крові, заготовленої на консерванті “Глюгіцир” в полімерні контейнери “Гемакон”. Виділення КТ здійснювали двома методами: із збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) [Волкова Р.И. и др., 1992] та з лейко-тромбоцитарного шару (ЛТШ) [Аграненко В.А. и др., 1991]. Перед проведенням експериментальних досліджень КТ зберігали у контейнерах “Компопласт” до 18 – 24 годин при 22 ± 2 єC в умовах постійного перемішування зі швидкістю 2 об/хв. У межах 2 – 4 годин після виділення КТ визначали його кількісний склад [Перфильева Е.А. и др., 2003; Ронин В.С., 1983].
У роботі використовували кріопротектори: ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ, гліцерин (ГЛ), оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 (ОЕГn=5), очищені та ідентифіковані у відділі кріопротекторів ІПКіК НАН України. З метою мінімізації осмотичного стресу додавання розчинів кріопротекторів до КТ у співвідношенні 1:1 здійснювали при 22 ± 2 єC у відповідності до рекомендованих схем [Arnaud F.G. et al., 1990; Компаниец А.М., 1992; 1995; Woods E.J. et al., 1999]. Дослідження здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі їх генерації проводили за методом [Halliwell B. еt al., 1987]. Визначення вмісту гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у системах “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” здійснювали за методом [Asakawa J., 1980]. Кінцеві концентрації ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складали 0,5; 0,7 та 1 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М; час експозиції КТ з кріопротекторами – 5; 15; 30 хвилин. Інтенсивність індукованого іонами заліза ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” визначали за методом [Владимиров Ю.А., 1972] одразу після введення індуктора та через 15 і 30 хвилин. Кінцева концентрація ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складала 0,7 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М.
Морфофункціональні властивості тромбоцитів: здатність накопичувати АО [Деменко В.Д. и др., 1990], здатність до індукованої АДФ та колагеном агрегації [Born G.V.R., 1962], реакцію на гіпотонічний шок (РГШ) [Компаниец А.М., 1992] досліджували у межах 2 – 4 годин після виділення КТ та після 18 – 24 годин зберігання, а також після експозиції КТ з ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ у кінцевих концентраціях 0,7 та 1,4 М протягом 5; 30 хвилин і наступного видалення кріопротекторів розробленим способом [Пат. № 15014 Україна, 2006]. Агрегаційну здатність тромбоцитів додатково визначали у присутності вищезазначених кріопротекторів у кінцевій концентрації 0,1 М. Ступінь пошкодження кров’яних пластинок на етапах виділення та зберігання КТ визначали за активністю у супернатанті ферменту лактатдегідрогенази (ЛДГ) [Лемешко В.В. и др., 1989]. Ступінь пошкодження тромбоцитів на етапі експозиції КТ з кріопротекторами визначали за активністю у супернатанті ферментів: ЛДГ та Г6ФДГ [Родионова В.Л. и др., 2005]. Кінцеві концентрації ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ складали 0,7 М, а комбінацій ДМАЦ + 1,2-ПД: 0,7 та 0,35 М; час експозиції КТ з кріопротекторами та їх комбінаціями становив 15 хвилин.
Кріозахисні розчини (1,4 М ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ДМАЦ + 1,2-ПД та 0,7 М ДМАЦ + 1,2-ПД на плазмі, плазма без кріопротектора) вводили в КТ у співвідношенні 1:1 при 22 ± 2 єC протягом 1 хвилини, одразу після чого здійснювали заморожування зразків за допомогою програмного заморожувача “Cryoson” (Німеччина) у кріоампулах “Nunc”. Об’єм зразка становив 1,6 мл.
При порівняльному дослідженні ефективності кріоконсервування КТ, виділених з донорської крові двома методами, застосовували ДМСО у кінцевій концентрації 0,7 М та програму заморожування №1.
програму №1: охолодження зразка від 22 ± 2 °C до -35…-40 °C проводили зі швидкістю 1°C/хв, після чого – занурювали у рідкий азот;
програму №2: зразок охолоджували аналогічно програмі №1, але додатково вводили процедуру температурної ініціації кристалізації, після чого застосовували контрольовану швидкість охолодження 6 – 7 °C/хв;
програму №3: охолодження зразка проводили аналогічно програмі №2, але після процедури температурної ініціації кристалізації зменшували швидкість його охолодження до 0,2 – 0,3 °C/хв.
Заморожування зразків за зазначеними програмами здійснювали з кріопротектором та без нього. При застосуванні програм, що передбачали процедуру температурної ініціації кристалізації, величина переохолодження не перевищувала 0,5 – 1 °С.
При дослідженні впливу швидкості заморожування КТ з ДМСО в зоні евтектичних температур (від -35…40 до -80 єC) на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів застосовували програми №4 – №7 (табл. 1).
Показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів, отримані після кріоконсервування КТ за програмами №4 – №7, порівнювали з відповідними показниками після заморожування КТ того ж донора за програмами №1, №2 та №8 [Balint B. еt al., 2006], що за даними літератури забезпечує високий рівень збереженості кров’яних пластинок. При дослідженні кріозахисної ефективності середовищ різного композиційного складу застосовували програми заморожування №1 та №2.
Таблиця 1
Програми заморожування №4 – №7
| Прог- рами | Швидкість охолодження в температурних інтервалах | ||
| від 22 ± 2 до -35…-40 °C | від -35…-40 до -80 °C | від -80 до -196 °C | |
| №4 | 1 °C/хв | 0,5 – 1 °С/хв | занурення в рідкий азот |
| №5 | 1 °C/хв | 5 – 7 °С/хв | занурення в рідкий азот |
| №6 | 1 °C/хв | 10 – 15 °С/хв | занурення в рідкий азот |
| №7 | 1 °C/хв | 25 – 30 °С/хв | занурення в рідкий азот |
Статистичну обробку одержаних результатів проводили із застосуванням критерію Стьюдента та непараметричного критерію Вілкоксона-Манна-Уітні.
Результати досліджень та їх обговорення
Відомо, що процедура отримання КТ спричиняє зміну морфофункціонального стану певної частини кров’яних пластинок, їх активацію [Bode A.P., 1990; Estebanell E. et al., 2000]. Ступінь активації залежить від умов та способу виділення клітин [Bцck M. et al, 2002]. На першому етапі досліджень, при оцінці морфофункціонального стану тромбоцитів, виділених з донорської крові двома різними методами, ми застосували люмінесцентну мікроскопію, яка базується на здатності кров’яних пластинок акумулювати в гранулярному апараті флуорохром АО. Порівняльний аналіз співвідношення морфологічних форм тромбоцитів в препаратах ЗТП та КТ показав, що останні містять значно більшу кількість активованих гранулярних, агранулярних форм (рис. 1) та агрегатів тромбоцитів, характеризуються нижчим показником гранулярності та вищим ступенем мікровезикуляції (табл. 2). Зазначені ознаки активації тромбоцитів виявилися більш вираженими в препаратах КТ із ЗТП, ніж КТ з ЛТШ.
Таблиця 2
Показники активації тромбоцитів ЗТП, КТ з ЛТШ та КТ із ЗТП (М ± у, n = 6)
| Показники | Компонент | ||
| ЗТП | КТ з ЛТШ | КТ із ЗТП | |
| Агрегати тромбоцитів (в полі зору) | 0 – 1 | 2 – 3 | 4 – 6 |
| Мікровезикуляція | – / + | ++ | +++ |
| Показник гранулярності | 4,5 ± 0,4 | 2,8 ± 0,6 | 1,9 ± 0,7* |
У межах 2 – 4 годин після виділення КТ спостерігалося значне пригнічення індукованої АДФ і колагеном агрегації кров’яних пластинок у порівнянні з даними для ЗТП (рис. 2А, 2Б). При цьому агрегація тромбоцитів КТ з ЛТШ була достовірно вищою від агрегації тромбоцитів КТ із ЗТП. Протягом наступних 18 – 24 годин зберігання КТ при 22 ± 2 єС агрегаційна здатність тромбоцитів дещо відновлювалася. Показники агрегації тромбоцитів КТ з ЛТШ достовірно не відрізнялися від відповідних показників тромбоцитів ЗТП. Агрегаційна здатність тромбоцитів КТ із ЗТП залишалася значно нижчою, ніж тромбоцитів ЗТП та КТ з ЛТШ. Ступінь РГШ тромбоцитів КТ із ЗТП виявився достовірно нижчим, ніж тромбоцитів ЗТП та КТ з ЛТШ в межах 2 – 4 годин після виділення (рис. 2В). Після 18 – 24 годин зберігання при 22 ± 2 єС не виявлено достовірних відмінностей між показниками РГШ тромбоцитів КТ, виділених різними методами. Активність ЛДГ після виділення КТ обома методами була значно вищою порівняно з активністю ферменту у ЗТП до виділення КТ. Виявлено також суттєві відмінності між активністю ЛДГ у КТ, отриманих різними методами. Отже, результати досліджень показали, що обрані нами методи виділення КТ спричиняють різний ступінь активації/травматизації тромбоцитів.
Наступним етапом роботи було порівняльне дослідження ефективності кріоконсервування КТ, виділених з донорської крові двома різними методами. Виявилося, що кріоконсервування КТ з ДМСО за програмою №1 призводить до значного порушення або втрати здатності тромбоцитів до накопичення АО. Про це свідчить збільшення у КТ після відігрівання вмісту активованих форм тромбоцитів та наявність формених елементів, що не включають флуорохром –акридин-негативних (рис. 1).
Для кращої репрезентації здатності популяції в цілому до накопичення АО ми ввели інтегральний показник – індекс акумуляції флуорохрому (ІАФ), для обчислення якого застосували формулу Астальді і Верга [Меньшиков В.В., 1982]. Розрахований для зразків ЗТП ІАФ (2,84 ± 0,057) виявився достовірно вищим порівняно з ІАФ, розрахованими для КТ із ЗТП (1,57 ± 0,039) та КТ з ЛТШ (1,75 ± 0,058). ІАФ тромбоцитів КТ із ЗТП виявився достовірно нижчим, ніж ІАФ КТ з ЛТШ не тільки до, а й після кріоконсервування (відповідно 0,79 ± 0,025 та 0,98 ± 0,023).
У результаті кріоконсервування значно порушувалася також агрегаційна здатність тромбоцитів та РГШ (рис. 2). Встановлено, що збереженість цих морфофункціональних властивостей тромбоцитів після відігрівання значною мірою залежить від ступеня активації/травматизації останніх перед заморожуванням. Саме тому вибір способу одержання тромбоцитів для подальшого їх кріоконсервування є надзвичайно важливим. Метод виділення КТ з ЛТШ забезпечує менший ступінь активації кров’яних пластинок, нижчий вміст тромбоцитарних агрегатів та залишкових клітин і, як результат, – вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей клітин після кріоконсервування. У подальших експериментах з кріоконсервування ми використовували КТ, виділені з ЛТШ.
Активація вільнорадикальних процесів із залученням мембранних ліпідів при заморожуванні-відігріванні сприяє поглибленню структурної дезорганізації мембран та розвитку їх деструкції [Richter E. et al., 1985; Белоус А.М., 1997]. Порівняльне дослідження антирадикальних властивостей органічних сполук різних хімічних класів, що найчастіше застосовуються при низькотемпературному консервуванні тромбоцитів, показало: всі кріопротектори з ряду досліджених мають здатність перехоплювати гідроксильні радикали в модельній системі їх генерації і за даною властивістю розташувалися у порядку зростання: ГЛ < ДМАЦ < ОЕГn=5 ≈ 1,2-ПД < ДМСО. Метою наступного етапу нашої роботи було дослідити, яким чином впливає введення кріопротекторів у концентраціях, що використовуються при кріоконсервуванні тромбоцитів крові людини, на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Вміст ГПЛ у системі “тромбоцити-плазма” достовірно не підвищувався після введення у неї ДМАЦ і 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,5 та 0,7 М (рис. 3). Введення у систему “тромбоцити-плазма” ДМСО, гліцерину, ОЕГn=5 у будь-якій концентрації та 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 1 М супроводжувалося достовірним підвищенням вмісту ГПЛ порівняно з контролем. Протягом наступних 30 хвилин не відбувалося достовірних змін вмісту ГПЛ в окремо взятих системах “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” незалежно від концентрації останнього.
Присутність у системі “тромбоцити-плазма” таких кріопротекторів, як ГЛ та ОЕГn=5 у досліджуваних концентраціях призводила до достовірного підвищення інтенсивності індукованого іонами заліза ПОЛ порівняно з контролем (рис. 4). Інтенсивність індукованого ПОЛ у системі за присутності ДМАЦ, 1,2-ПД та ДМСО у концентрації 0,7 М залишалася на рівні контролю.
Очевидно, характер впливу кріопротектора на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”, перш за все, визначається його хімічною природою та концентрацією. Можливо, структурні зміни мембрани, пов’язані з відносно швидким додаванням повільно проникаючого через мембрану тромбоцитів ГЛ та непроникаючого ОЕГn=5, роблять її більш чутливою до окислювальних впливів. Нам не вдалося виявити залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі та характером їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”.
Важливою умовою адекватної оцінки морфофункціонального стану тромбоцитів на етапах кріоконсервування є максимальне видалення кріопротектора із суспензії кров’яних пластинок. Процедура видалення кріопротекторів, яку зазвичай здійснюють центрифугуванням з наступним ресуспендуванням осаджених клітин у плазмі, призводить до додаткового суттєвого пошкодження кров’яних пластинок [Zilber M. et al., 2003; Schoenfeld H. et al., 2005]. Нами був розроблений і апробований спосіб максимального видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів за умов мінімального механічного та осмотичного навантаження на кров’яні пластинки [Пат. №15014 Україна, 2006]. Застосування розробленого способу в наших дослідженнях дозволило отримати більш достовірну інформацію щодо впливу кріопротекторів та інших факторів кріоконсервування на морфофункціональний стан тромбоцитів.
Дослідженнями встановлено, що експозиція КТ з ДМСО, ДМАЦ та 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,7 М не супроводжується помітними змінами морфофункціональних властивостей тромбоцитів: здатності до акумуляції АО, індукованої АДФ та колагеном агрегації, РГШ. Достовірні зміни морфофункціональних властивостей тромбоцитів спостерігалися при підвищенні концентрації кріопротекторів у суспензії клітин до 1,4 М: у КТ збільшувався вміст активованих форм та агрегатів, зменшувався показник гранулярності, змінювалися показники агрегаційної здатності та РГШ. Так як обрані кріопротектори у кінцевій концентрації 0,7 М не викликали значних змін морфофункціонального стану тромбоцитів, у подальших експериментах з кріоконсервування вони застосовувалися у даній концентрації.
Відомо, що одним із відповідальних етапів при низькотемпературному консервуванні є охолодження біологічного об’єкта в температурному інтервалі кристалізації кріобіологічної системи. Значний вплив на характер кристалізаційних процесів мають швидкість охолодження та ступінь переохолодження [Белоус А.М. и др., 1987]. На першому етапі було досліджено вплив процедури заморожування КТ з 0,7 М ДМСО та без кріопротектора в температурному інтервалі від 0/-1,5 до -35…-40 єC на ступінь пошкодження тромбоцитів, визначений за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі, та на показники їх морфофункціональної збереженості. Отримані результати свідчать, що заморожування за програмою №2, яка передбачає застосування процедури температурної ініціації кристалізації, має результатом значно менший ступінь пошкодження тромбоцитів, ніж заморожування за лінійною програмою №1 (рис. 5). Причому, в присутності кріопротектора значення процедури ініціації кристалізації було помітно меншим, ніж за його відсутності. Не виявлено достовірних відмінностей між показниками пошкодження тромбоцитів після заморожування КТ без кріопротектора за програмою №2 з ініціацією кристалізації та після кріоконсервування КТ з 0,7 М ДМСО за лінійною програмою №1. Так як програма №2 передбачає застосування не тільки процедури ініціації кристалізації, а й наступної контрольованої (6 – 7 °C/хв) швидкості охолодження, ми вирішили дослідити значення швидкості охолодження кріобіологічної системи після ініціації кристалізації. Для цього додатково застосували програму №3, що забезпечувала швидкість охолодження в зазначеному температурному інтервалі 0,2 – 0,3 °C/хв. Ступінь пошкодження тромбоцитів, заморожених з 0,7 М ДМСО та без кріопротектора за програмою №3, виявився достовірно вищим, а рівень збереженості функціональних властивостей – нижчим, ніж заморожених за програмою №2. Зменшення швидкості охолодження призвело до збільшення часу знаходження клітин у системі, що кристалізується. Очевидно, основним механізмом пошкодження клітин за цих умов став так званий “ефект розчину”, значення якого в присутності кріопротектора було помітно меншим. Отже, лише поєднання процедури зняття переохолодження з наступною певною контрольованою швидкістю охолодження в температурному інтервалі кристалізації може забезпечити істотне зниження ступеня пошкодження кров’яних пластинок.
Дослідженнями останніх років виявлено явище низькотемпературного евтектичного розшарування розчину ДМСО і показано, що даний фізичний чинник може викликати летальні пошкодження кріолабільних клітин [Kyryliuk G.L. et al., 2006]. Зменшити його вплив запропоновано шляхом проходження температурного інтервалу, в якому відбувається евтектичне розшарування розчину кріопротектора, з підібраною експериментально швидкістю охолодження. Тому важливим було дослідити вплив швидкості заморожування КТ з 0,7 М ДМСО в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 єC) на ступінь пошкодження кров’яних пластинок. З підвищенням швидкості проходження даного температурного інтервалу (від 0,5 – 1 до 25 – 30 єC/хв) спостерігалася тенденція до зменшення ступеня пошкодження кріоконсервованих тромбоцитів (рис. 6). Але швидкість, що реалізувалася при прямому зануренні зразка у рідкий азот (програма №1), була занадто великою, про що свідчить підвищення активності Г6ФДГ і ЛДГ у позаклітинному середовищі (р<0,05). Показники агрегації тромбоцитів, кріоконсервованих за програмами з різними швидкостями охолодження в зоні евтектичних температур, достовірно не відрізнялися між собою. Достовірні відмінності виявлені між показниками РГШ тромбоцитів, заморожених за програмами №1 та №7, 8.
Ступінь пошкодження тромбоцитів після кріоконсервування за програмою Balint B. (№8), яка передбачала проходження з різною контрольованою швидкістю інших температурних інтервалів, достовірно не відрізнявся від аналогічних показників після кріоконсервування за програмами №2,4,5,6,7. Ефективність даної програми заморожування виявилася достовірно вищою порівняно з програмами №1 та №3 (рис. 5; 6).
Таким чином, швидкість охолодження суспензії тромбоцитів у температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур є фактором, що має визначальний вплив на ефективність кріоконсервування КТ.
Дослідження впливу композиційного складу середовища кріоконсервування на морфофункціональні показники кріоконсервованих тромбоцитів показали, що найвищий рівень збереженості індукованої АДФ агрегації забезпечив ДМАЦ та його комбінації з 1,2-ПД (рис. 7А). За здатністю зберігати дану властивість тромбоцитів досліджені кріопротектори та їх комбінації розмістилися в порядку зростання: 0,7 М 1,2-ПД ≤ 0,7 М ДМСО < 0,7 М ДМАЦ ≈ 0,35 М ДМАЦ + 1,2-ПД ≤ 0,7 М ДМАЦ + 1,2-ПД. Найбільш високий рівень збереженості індукованої колагеном агрегації тромбоцитів забезпечив ДМСО при застосуванні програми заморожування №2 з ініціацією кристалізації (рис. 7Б). Не виявлено достовірних відмінностей між даною здатністю тромбоцитів, кріоконсервованих з ДМСО за програмою №1 без ініціації кристалізації, з ДМАЦ за обома програмами та комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД за програмою №2.
Найвищий ступінь збереженості РГШ спостерігався після кріоконсервування КТ з ДМСО за обома програмами та з 0,7 М комбінацією ДМАЦ + 1,2-ПД за програмою №2 з ініціацією кристалізації (рис. 7В). Причому, за даним тестом не виявлено достовірних відмінностей між результатами кріоконсервування КТ з ДМСО за лінійною програмою №1 та з 0,7 М комбінацією ДМАЦ з 1,2-ПД за програмою №2 з ініціацією кристалізації. Відмінностей між ступенем агрегації та РГШ тромбоцитів, заморожених за різними програмами в однакових за складом кріозахисних середовищах, також не виявлено (р>0,05). Достовірно вищі показники агрегації та РГШ тромбоцитів, заморожених з 0,35 М комбінацією ДМАЦ + 1,2-ПД за програмою №2, ніж за програмою №1, свідчать про те, що зі зменшенням вмісту кріопротектора у кріозахисному середовищі значення програми заморожування зростає.
Здатність ДМАЦ у досліджених концентраціях суттєво пригнічувати активність ЛДГ та Г6ФДГ, ускладнила аналіз даних, отриманих за даним тестом. Оцінка ступеня пошкодження тромбоцитів за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі виявилася прийнятною при порівнянні ефективності програм заморожування за умови використання одного кріопротектора, або кріопротекторів різних хімічних класів, які не впливають на активність зазначених ферментів. За даним тестом ефективність кріоконсервування за програмою з ініціацією кристалізації є вищою, ніж за програмою без ініціації кристалізації при застосуванні всіх досліджуваних кріопротекторів і їх комбінацій (рис. 8). Кріоконсервування з ДМСО має результатом менший ступінь пошкодження, ніж кріоконсервування з 1,2-ПД та 0,35 М комбінацією ДМАЦ з 1,2-ПД.
Вперше для оцінки кріоконсервованих тромбоцитів нами був застосований метод люмінесцентної мікроскопії з використанням АО. Найбільша кількість акридин-негативних форм спостерігалася після кріоконсервування з ДМАЦ та 1,2-ПД (відповідно 53 ± 6 % та 49 ± 8 %). Не виявлено достовірних відмінностей між вмістом акридин-позитивних і гранулярних тромбоцитів після кріоконсервування з ДМСО (відповідно 67 ± 8 % і 29 ± 4 %) та комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД (відповідно 0,7 М: 47 ± 4 % і 14 ± 5,6 %; 0,35 М: 57 ± 4 % і 25 ± 6,5 %). Слід зазначити, що КТ, заморожені без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації за субпопуляційний складом займали проміжне положення між КТ, кріоконсервованими з ДМАЦ і 1,2-ПД з одного боку та КТ, кріоконсервованими з ДМСО і комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД з іншого: акридин-позитивних – 55 ± 5,6 %, гранулярних – 20 ± 5 %. Заморожування КТ без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації мало результатом значно вищий вміст акридин-позитивних та нижчий – акридин-негативних тромбоцитів порівняно із заморожуванням за лінійною програмою №1.
Аналіз результатів дослідження кріопротекторної активності обраних органічних сполук показав, що за показниками структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Отримані дані дозволяють рекомендувати дану комбінацію кріопротекторів у якості основи кріозахисного середовища при розробці технології низькотемпературного консервування тромбоцитів для клінічного застосування.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі проведено теоретичне узагальнення проблеми низькотемпературного консервування тромбоцитів крові людини і експериментально обґрунтований новий підхід до її вирішення. На основі дослідження впливу ряду факторів кріоконсервування на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів визначені умови підвищення збереженості їх життєздатності та гемостатичного потенціалу на етапах низькотемпературного консервування.
1. Встановлено, що композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів (агрегаційна здатність, реакція на гіпотонічний шок, здатність до накопичення флуорохрому, активність цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі). Вперше експериментально доведена доцільність використання комбінацій кріопротекторів у складі кріозахисного розчину при кріоконсервуванні тромбоцитів.
2. Показано важливе значення ступеня активації тромбоцитів на етапі виділення з донорської крові: концентрати тромбоцитів, отримані з лейко-тромбоцитарного шару, характеризувалися за всіма досліджуваними параметрами нижчим ступенем активації і виявили вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей до і після кріоконсервування порівняно з концентратами тромбоцитів, отриманими із збагаченої тромбоцитами плазми.
3. Встановлено, що всім дослідженим кріопротекторам притаманна антирадикальна активність. За здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації кріопротектори розташувалися у порядку зростання: гліцерин < диметилацетамід < оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 ≈ 1,2-пропандіол < диметилсульфоксид.
4. Характер впливу кріопротекторів на інтенсивність перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” залежить від їх хімічної природи та концентрації. З ряду досліджених кріозахисних сполук 1,2-пропандіол та диметилацетамід у кінцевій концентрації 0,7 М суттєво не впливають на рівень пероксидації ліпідів, навіть за умови індукції іонами заліза. Не виявлено залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів в модельній системі та характером їх впливу на процеси перекисного окислення ліпідів в системі “тромбоцити-плазма”.
5. Експозиція тромбоцитів протягом 30 хвилин з диметилсульфоксидом, диметилацетамідом та 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, за умов мінімізації осмотичного та механічного стресу при введенні та видаленні кріопротекторів розробленим способом [Пат. №15014 Україна, 2006], не викликає значних змін їх морфофункціонального стану. З підвищенням концентрації кріопротекторів до 1,4 М виявляються ознаки активації, порушення агрегаційних та осморегуляторних властивостей тромбоцитів.
6. Встановлена залежність збереженості структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів від швидкості охолодження у температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 єC). Значення фактору швидкості охолодження в даному температурному інтервалі зростає зі зменшенням вмісту кріопротектора у складі кріозахисного середовища, а особливо – за його відсутності. Процедура температурної ініціації кристалізації сприяла підвищенню ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів лише за умови наступного застосування певної контрольованої швидкості охолодження. Розроблена програма заморожування концентратів тромбоцитів, яка передбачає процедуру температурної ініціації кристалізації з подальшим охолодженням зі швидкістю 6 – 7 °С/хв в даному температурному інтервалі.
7. Експериментально доведена важливість застосування контрольованої швидкості охолодження в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 єC). Порівняльний аналіз результатів кріоконсервування концентратів тромбоцитів з диметилсульфоксидом виявив залежність ступеня пошкодження тромбоцитів від швидкості охолодження в даному температурному інтервалі: спостерігалася тенденція до підвищення збереженості тромбоцитів при охолодженні із швидкістю 25 – 30 єC/хв у порівнянні із швидкостями 0,5 – 1 °С/хв, 5 – 7 °С/хв, 10 – 15 °С/хв та достовірні відмінності у порівнянні зі швидкістю, що реалізується при прямому зануренні в рідкий азот.
8. Заморожування тромбоцитів за розробленою програмою у середовищі, що містить комбінацію диметилацетаміду з 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, підвищує рівень збереженості структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів після кріоконсервування порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо.
9. Експериментально визначені умови підвищення ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів людини є реальною основою подальшої розробки і впровадження в роботу низькотемпературних банків крові технології їх довгострокового низькотемпературного зберігання для використання у практичній медицині.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Компанієць А.М., Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Погребняк М.Л. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування // Проблемы криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 2. – С. 182 – 191.
2. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів та їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” // Медична хімія. – 2006. – Т. 8, № 3. – С. 25 – 28.
3. Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Вплив кінетики охолодження на результати кріоконсервування тромбоцитів крові людини // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”, випуск 33. – К.: Нора-друк, 2006. – С. 113–118.
4. Книш О.В. Вплив вихідного морфофункціонального стану тромбоцитів на результати їх кріоконсервування // Актуальні проблеми сучасної медицини. Вісник Української медичної стоматологічної академії. – 2007. – Т. 7, випуск 3 (19). – С. 170 – 173.
5. Пат. № 15014 Україна, МПК8 А0N 1/02. Спосіб видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів / Грищенко В.І., Компанієць А.М., Книш О.В. / Заявл. 18.11.05; Опубл. 15.06.06, Бюл. № 6.
6. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Никитченко Ю.В., Компаниец А.М. Исследование антиоксидантных свойств криопротекторов различных классов химических соединений // Сборник трудов “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека”. – Смоленск, Россия, 2005. – С. 366 – 368.
7. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Дослідження впливу кріопротекторів на рівень спонтанного та індукованого іонами заліза ПОЛ у системі тромбоцити-плазма-кріопротектор // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 5. – С. 143.
8. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Порівняльна характеристика антирадикальних властивостей кріопротекторів у системах: модельній та “тромбоцити-плазма” // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т. 15, № 4. – С. 740 – 741.
9. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Линник Т.П., Компаниец А.М. Зависимость антирадикальной активности криопротекторов ряда полиолов и их оксиэтильных производных от химической структуры // Збірник матеріалів ІХ Українського біохімічного з’їзду. – Харків, 2006. – Т. 1. – С. 156 – 157.
АНОТАЦІЇ
Книш О.В. Дослідження впливу факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів людини. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 – кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.
Дисертація присвячена вивченню впливу ряду факторів кріоконсервування на структурну цілісність та функціональні властивості тромбоцитів крові людини на етапах низькотемпературного консервування. Досліджено здатність кріопротекторів різних класів хімічних сполук перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації та впливати на інтенсивність процесів ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Показано, що вихідний морфофункціональний стан тромбоцитів, композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів. Вперше експериментально доведено, що застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Встановлена можливість ефективного кріоконсервування концентратів тромбоцитів, виділених з лейко-тромбоцитарного шару, які зберігалися упродовж 18 – 24 годин при температурі 22 ± 2 єС.
Ключові слова: тромбоцити, кріоконсервування, кріопротектори, ПОЛ, програми заморожування.
Аннотация
Кныш О.В. Влияние факторов криоконсервирования на морфофункциональные свойства тромбоцитов человека. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 – криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.
Диссертационная работа посвящена изучению влияния ряда факторов криоконсервирования на структурную целостность и функциональные свойства тромбоцитов крови человека на этапах низкотемпературного консервирования. Показана зависимость сохранности структуры и функций криоконсервированных тромбоцитов от степени активации/травматизации на этапе выделения КТ из донорской крови. Выделение КТ методом из лейко-тромбоцитарного слоя вызывает меньшую активацию тромбоцитов, что подтверждается более низким содержанием в концентрате активированных форм и агрегатов, менее выраженной микровезикуляцией и высокими показателями гранулярности тромбоцитов по сравнению с КТ, выделенными методом из обогащенной тромбоцитами плазмы. Результатом менее выраженной активации тромбоцитов на этапе выделения явился более высокий уровень сохранности их структурной целостности и функциональных свойств после криоконсервирования.
В сравнительном аспекте исследованы антирадикальные свойства криопротекторов, принадлежащих к различным классам химических соединений, по их способности к перехвату гидроксильных радикалов в модельной системе. Показано, что способность криопротекторов влиять на процессы ПОЛ в системе “тромбоциты-плазма” определяется их химической структурой и концентрацией. Не обнаружено зависимости между антирадикальной активностью криопротекторов в модельной системе и характером их влияния на процессы ПОЛ в системе “тромбоциты-плазма”.
Выделены факторы, которые имеют определяющее значение для результатов криоконсервирования тромбоцитов – состав криозащитной среды и скорость охлаждения криобиологической системы в интервале кристаллизации и зоне эвтектических температур. Теоретически обоснована и экспериментально разработана программа замораживания КТ с оптимальными скоростями прохождения температурного интервала кристаллизации. Показано, что большое значение для результатов криоконсервирования имеет также контролируемая скорость охлаждения КТ в зоне эвтектических температур.
Впервые экспериментально установлена целесообразность применения при замораживании тромбоцитов комбинации ДМАЦ и 1,2-ПД. Использование данной комбинации криопротекторов в конечной концентрации 0,7 М и разработанной программы замораживания позволяет значительно повысить уровень сохранности структурной целостности и функциональных свойств криоконсервированных тромбоцитов по сравнению с использованием каждого из криопротекторов отдельно.
Разработан новый способ максимального удаления криопротекторов из суспензии тромбоцитов, обеспечивающий минимальную механическую и осмотическую нагрузку на кровяные пластинки.
Ключевые слова: тромбоциты, криоконсервирование, криопротекторы, ПОЛ, программы замораживания.
ANNOTATION
Knysh O.V. Effect of cryodivservation factors on morphofunctional properties of human platelets. – Manuscript.
Thesis for obtaining scientific degree of the candidate of medical sciences (PhD equivalent) on specialty 14.01.35 – cryomedicine. – Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, 2008.
The thesis covers studying the effect of some cryodivservation factors on structural integrity and functional properties of human blood platelets at low temperature divservation stages. The ability of cryoprotectants of different classes of chemical compounds to scavenge the hydroxyl radicals in model system of their generation and to affect the intensity of LPO processes in the “platelets-plasma” system was investigated. It has been shown that initial morphofunctional state of platelets, compositions of cryoprotective medium and cooling rate of cell suspension within temperature crystallization interval and zone of eutectic temperatures have a crucial effect on the parameters of structural integrity and functional properties of cryodivserved platelets. For the first time it was experimentally proved that use of combination of DMAC with 1,2-PD increased the cryodivservation efficiency of platelets if compared to the application of each cryoprotectant separately. The possibility of effective cryodivservation of platelet concentrates divpared by the buffy coat method and stored for 18 –24 hrs at 22 ± 2 єC was found.
Key words: platelets, cryodivservation, cryoprotectants, LPO, freezing programs.
Здатність ДМАЦ у досліджених концентраціях суттєво пригнічувати активність ЛДГ та Г6ФДГ, ускладнила аналіз даних, отриманих за даним тестом. Оцінка ступеня пошкодження тромбоцитів за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі виявилася прийнятною при порівнянні ефективності програм заморожування за умови використання одного кріопротектора, або кріопротекторів різних хімічних класів, які не впливають на активність зазначених ферментів. За даним тестом ефективність кріоконсервування за програмою з ініціацією кристалізації є вищою, ніж за програмою без ініціації кристалізації при застосуванні всіх досліджуваних кріопротекторів і їх комбінацій (рис. 8). Кріоконсервування з ДМСО має результатом менший ступінь пошкодження, ніж кріоконсервування з 1,2-ПД та 0,35 М комбінацією ДМАЦ з 1,2-ПД.
Вперше для оцінки кріоконсервованих тромбоцитів нами був застосований метод люмінесцентної мікроскопії з використанням АО. Найбільша кількість акридин-негативних форм спостерігалася після кріоконсервування з ДМАЦ та 1,2-ПД (відповідно 53 ± 6 % та 49 ± 8 %). Не виявлено достовірних відмінностей між вмістом акридин-позитивних і гранулярних тромбоцитів після кріоконсервування з ДМСО (відповідно 67 ± 8 % і 29 ± 4 %) та комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД (відповідно 0,7 М: 47 ± 4 % і 14 ± 5,6 %; 0,35 М: 57 ± 4 % і 25 ± 6,5 %). Слід зазначити, що КТ, заморожені без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації за субпопуляційний складом займали проміжне положення між КТ, кріоконсервованими з ДМАЦ і 1,2-ПД з одного боку та КТ, кріоконсервованими з ДМСО і комбінаціями ДМАЦ з 1,2-ПД з іншого: акридин-позитивних – 55 ± 5,6 %, гранулярних – 20 ± 5 %. Заморожування КТ без кріопротектора за програмою №2 з температурною ініціацією кристалізації мало результатом значно вищий вміст акридин-позитивних та нижчий – акридин-негативних тромбоцитів порівняно із заморожуванням за лінійною програмою №1.
Аналіз результатів дослідження кріопротекторної активності обраних органічних сполук показав, що за показниками структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Отримані дані дозволяють рекомендувати дану комбінацію кріопротекторів у якості основи кріозахисного середовища при розробці технології низькотемпературного консервування тромбоцитів для клінічного застосування.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі проведено теоретичне узагальнення проблеми низькотемпературного консервування тромбоцитів крові людини і експериментально обґрунтований новий підхід до її вирішення. На основі дослідження впливу ряду факторів кріоконсервування на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів визначені умови підвищення збереженості їх життєздатності та гемостатичного потенціалу на етапах низькотемпературного консервування.
1. Встановлено, що композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів (агрегаційна здатність, реакція на гіпотонічний шок, здатність до накопичення флуорохрому, активність цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі). Вперше експериментально доведена доцільність використання комбінацій кріопротекторів у складі кріозахисного розчину при кріоконсервуванні тромбоцитів.
2. Показано важливе значення ступеня активації тромбоцитів на етапі виділення з донорської крові: концентрати тромбоцитів, отримані з лейко-тромбоцитарного шару, характеризувалися за всіма досліджуваними параметрами нижчим ступенем активації і виявили вищий рівень збереженості морфофункціональних властивостей до і після кріоконсервування порівняно з концентратами тромбоцитів, отриманими із збагаченої тромбоцитами плазми.
3. Встановлено, що всім дослідженим кріопротекторам притаманна антирадикальна активність. За здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації кріопротектори розташувалися у порядку зростання: гліцерин < диметилацетамід < оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 ≈ 1,2-пропандіол < диметилсульфоксид.
4. Характер впливу кріопротекторів на інтенсивність перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” залежить від їх хімічної природи та концентрації. З ряду досліджених кріозахисних сполук 1,2-пропандіол та диметилацетамід у кінцевій концентрації 0,7 М суттєво не впливають на рівень пероксидації ліпідів, навіть за умови індукції іонами заліза. Не виявлено залежності між здатністю кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів в модельній системі та характером їх впливу на процеси перекисного окислення ліпідів в системі “тромбоцити-плазма”.
5. Експозиція тромбоцитів протягом 30 хвилин з диметилсульфоксидом, диметилацетамідом та 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, за умов мінімізації осмотичного та механічного стресу при введенні та видаленні кріопротекторів розробленим способом [Пат. №15014 Україна, 2006], не викликає значних змін їх морфофункціонального стану. З підвищенням концентрації кріопротекторів до 1,4 М виявляються ознаки активації, порушення агрегаційних та осморегуляторних властивостей тромбоцитів.
6. Встановлена залежність збереженості структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів від швидкості охолодження у температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 єC). Значення фактору швидкості охолодження в даному температурному інтервалі зростає зі зменшенням вмісту кріопротектора у складі кріозахисного середовища, а особливо – за його відсутності. Процедура температурної ініціації кристалізації сприяла підвищенню ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів лише за умови наступного застосування певної контрольованої швидкості охолодження. Розроблена програма заморожування концентратів тромбоцитів, яка передбачає процедуру температурної ініціації кристалізації з подальшим охолодженням зі швидкістю 6 – 7 °С/хв в даному температурному інтервалі.
7. Експериментально доведена важливість застосування контрольованої швидкості охолодження в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 єC). Порівняльний аналіз результатів кріоконсервування концентратів тромбоцитів з диметилсульфоксидом виявив залежність ступеня пошкодження тромбоцитів від швидкості охолодження в даному температурному інтервалі: спостерігалася тенденція до підвищення збереженості тромбоцитів при охолодженні із швидкістю 25 – 30 єC/хв у порівнянні із швидкостями 0,5 – 1 °С/хв, 5 – 7 °С/хв, 10 – 15 °С/хв та достовірні відмінності у порівнянні зі швидкістю, що реалізується при прямому зануренні в рідкий азот.
8. Заморожування тромбоцитів за розробленою програмою у середовищі, що містить комбінацію диметилацетаміду з 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, підвищує рівень збереженості структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів після кріоконсервування порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо.
9. Експериментально визначені умови підвищення ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів людини є реальною основою подальшої розробки і впровадження в роботу низькотемпературних банків крові технології їх довгострокового низькотемпературного зберігання для використання у практичній медицині.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Компанієць А.М., Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Погребняк М.Л. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування // Проблемы криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 2. – С. 182 – 191.
2. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів та їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” // Медична хімія. – 2006. – Т. 8, № 3. – С. 25 – 28.
3. Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Вплив кінетики охолодження на результати кріоконсервування тромбоцитів крові людини // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”, випуск 33. – К.: Нора-друк, 2006. – С. 113–118.
4. Книш О.В. Вплив вихідного морфофункціонального стану тромбоцитів на результати їх кріоконсервування // Актуальні проблеми сучасної медицини. Вісник Української медичної стоматологічної академії. – 2007. – Т. 7, випуск 3 (19). – С. 170 – 173.
5. Пат. № 15014 Україна, МПК8 А0N 1/02. Спосіб видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів / Грищенко В.І., Компанієць А.М., Книш О.В. / Заявл. 18.11.05; Опубл. 15.06.06, Бюл. № 6.
6. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Никитченко Ю.В., Компаниец А.М. Исследование антиоксидантных свойств криопротекторов различных классов химических соединений // Сборник трудов “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека”. – Смоленск, Россия, 2005. – С. 366 – 368.
7. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Дослідження впливу кріопротекторів на рівень спонтанного та індукованого іонами заліза ПОЛ у системі тромбоцити-плазма-кріопротектор // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 5. – С. 143.
8. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Порівняльна характеристика антирадикальних властивостей кріопротекторів у системах: модельній та “тромбоцити-плазма” // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т. 15, № 4. – С. 740 – 741.
9. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Линник Т.П., Компаниец А.М. Зависимость антирадикальной активности криопротекторов ряда полиолов и их оксиэтильных производных от химической структуры // Збірник матеріалів ІХ Українського біохімічного з’їзду. – Харків, 2006. – Т. 1. – С. 156 – 157.
АНОТАЦІЇ
Книш О.В. Дослідження впливу факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів людини. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 – кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.
Дисертація присвячена вивченню впливу ряду факторів кріоконсервування на структурну цілісність та функціональні властивості тромбоцитів крові людини на етапах низькотемпературного консервування. Досліджено здатність кріопротекторів різних класів хімічних сполук перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації та впливати на інтенсивність процесів ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Показано, що вихідний морфофункціональний стан тромбоцитів, композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів. Вперше експериментально доведено, що застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Встановлена можливість ефективного кріоконсервування концентратів тромбоцитів, виділених з лейко-тромбоцитарного шару, які зберігалися упродовж 18 – 24 годин при температурі 22 ± 2 єС.
Ключові слова: тромбоцити, кріоконсервування, кріопротектори, ПОЛ, програми заморожування.
Аннотация
Кныш О.В. Влияние факторов криоконсервирования на морфофункциональные свойства тромбоцитов человека. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 – криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.
Диссертационная работа посвящена изучению влияния ряда факторов криоконсервирования на структурную целостность и функциональные свойства тромбоцитов крови человека на этапах низкотемпературного консервирования. Показана зависимость сохранности структуры и функций криоконсервированных тромбоцитов от степени активации/травматизации на этапе выделения КТ из донорской крови. Выделение КТ методом из лейко-тромбоцитарного слоя вызывает меньшую активацию тромбоцитов, что подтверждается более низким содержанием в концентрате активированных форм и агрегатов, менее выраженной микровезикуляцией и высокими показателями гранулярности тромбоцитов по сравнению с КТ, выделенными методом из обогащенной тромбоцитами плазмы. Результатом менее выраженной активации тромбоцитов на этапе выделения явился более высокий уровень сохранности их структурной целостности и функциональных свойств после криоконсервирования.
В сравнительном аспекте исследованы антирадикальные свойства криопротекторов, принадлежащих к различным классам химических соединений, по их способности к перехвату гидроксильных радикалов в модельной системе. Показано, что способность криопротекторов влиять на процессы ПОЛ в системе “тромбоциты-плазма” определяется их химической структурой и концентрацией. Не обнаружено зависимости между антирадикальной активностью криопротекторов в модельной системе и характером их влияния на процессы ПОЛ в системе “тромбоциты-плазма”.
Выделены факторы, которые имеют определяющее значение для результатов криоконсервирования тромбоцитов – состав криозащитной среды и скорость охлаждения криобиологической системы в интервале кристаллизации и зоне эвтектических температур. Теоретически обоснована и экспериментально разработана программа замораживания КТ с оптимальными скоростями прохождения температурного интервала кристаллизации. Показано, что большое значение для результатов криоконсервирования имеет также контролируемая скорость охлаждения КТ в зоне эвтектических температур.
Впервые экспериментально установлена целесообразность применения при замораживании тромбоцитов комбинации ДМАЦ и 1,2-ПД. Использование данной комбинации криопротекторов в конечной концентрации 0,7 М и разработанной программы замораживания позволяет значительно повысить уровень сохранности структурной целостности и функциональных свойств криоконсервированных тромбоцитов по сравнению с использованием каждого из криопротекторов отдельно.
Разработан новый способ максимального удаления криопротекторов из суспензии тромбоцитов, обеспечивающий минимальную механическую и осмотическую нагрузку на кровяные пластинки.
Ключевые слова: тромбоциты, криоконсервирование, криопротекторы, ПОЛ, программы замораживания.
ANNOTATION
Knysh O.V. Effect of cryodivservation factors on morphofunctional properties of human platelets. – Manuscript.
Thesis for obtaining scientific degree of the candidate of medical sciences (PhD equivalent) on specialty 14.01.35 – cryomedicine. – Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, 2008.
The thesis covers studying the effect of some cryodivservation factors on structural integrity and functional properties of human blood platelets at low temperature divservation stages. The ability of cryoprotectants of different classes of chemical compounds to scavenge the hydroxyl radicals in model system of their generation and to affect the intensity of LPO processes in the “platelets-plasma” system was investigated. It has been shown that initial morphofunctional state of platelets, compositions of cryoprotective medium and cooling rate of cell suspension within temperature crystallization interval and zone of eutectic temperatures have a crucial effect on the parameters of structural integrity and functional properties of cryodivserved platelets. For the first time it was experimentally proved that use of combination of DMAC with 1,2-PD increased the cryodivservation efficiency of platelets if compared to the application of each cryoprotectant separately. The possibility of effective cryodivservation of platelet concentrates divpared by the buffy coat method and stored for 18 –24 hrs at 22 ± 2 єC was found.
Key words: platelets, cryodivservation, cryoprotectants, LPO, freezing programs.
