ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
АНДРОСОВА Марина Євгеніївна
УДК: 577.12:576.36:591.112.2-008.64
РОЛЬ ОПІОЇДІВ У РЕГУЛЯЦІЇ МЕХАНІЗМІВ АПОПТОЗУ ПРИ ГОСТРІЙ СЕРЦЕВІЙ НЕДОСТАТНОСТІ В ЕКСПЕРИМЕНТІ
14.01.32 – медична біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Луганськ – 2008

Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Луганському державному медичному університеті
Міністерства охорони здоров’я України
Науковий керівник доктор медичних наук, професор
Комаревцева Ірина Олександрівна,
Луганський державний медичний університет
МОЗ України,
завідуюча кафедри медичної хімії.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор
Кульчицький Олег Костянтинович,
Інститут геронтології АМН України,
завідувач лабораторії регуляції метаболізму
доктор медичних наук, професор
Савченкова Лариса Василівна,
Луганський державний медичний університет
МОЗ України,
завідуюча кафедри клінічної фармакології та фармакотерапії
Захист відбудеться “12” червня 2008 року о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.03 в Луганському державному медичному університеті за адресою: 91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1 Г.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного медичного університету (м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1Г).
Автореферат розісланий “10 ” травня 2008 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
І.А. Вишницька

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Серцева недостатність (СН) є найбільш частим і серйозним ускладненням багатьох захворювань серцево-судинної системи [Graham I., et al., 2007]. У структурі кардіоваскулярної смертності майже 50 % випадків пов’язано з прогресуючою дисфункцією міокарда [Zegers E.S., Verheugt F.W., 2007]. За даними Фремінгемського дослідження, дотепер СН продовжує залишатися потенційно летальною стадією ішемічної хвороби серця, артеріальної гіпертензії, міокардитів, кардіоміопатій, вад та інших захворювань серця. СН характеризується не тільки широким поширенням, але й високим рівнем інвалідізації й смертності хворих. Прогноз хворих залишається невтішним. Так, середня 5-річна смертність в усій популяції хворих з хронічною серцевою недостатністю (ХСН) залишається неприпустимо високою й складає 70 % для чоловіків і 63 % для жінок [Remme W.J., et al., 2007]. Серед хворих з важкими стадіями СН смертність коливається в межах 35–50 % протягом 1-го року, складає 50–70 % через 2 роки й перевищує 70 % через 3 роки після встановлення діагнозу [Swedberg K., et al., 2005].
Широке застосування на теперішній час антрациклінових анти­біотиків у складі схем поліхіміотерапії дозволило суттєво підвищити ефективність лікування з досягненням повної ремісії або регресії пухлин у дорослих у 40–70 %, а в дітей в 70–98 % випадків [Калінкіна Н.В., 2000]. У той же час, окрім позитивного терапевтичного ефекту антрацикліни через низьку вибірність дії викликають ряд порушень з боку здорових органів і систем: пригнічення кровотворення, ураження шлунково-кишкового тракту, легень, але найбільше ураження припадає на серце [Фисенко Л.Н. и др., 2004; Lipshultz S.E., et al.,2004]. Інколи кардіальні ускладнення настільки серйозні, що терапія цими цитостатиками стає неможливою й зупиняється до досягнення чіткого протипухлинного ефекту.
За даними різних авторів, частота кардіальних ускладнень при лікуванні антрациклінами коливається від 1,5 до 71 % [Doyle J., еt al., 2005; Peng X., еt al., 2005] і чітко корелює з їх кумулятивною дозою [Minotti G., еt al., 2004]. Особливе значення має той факт, що антрациклінові ураження серця довгий час можуть не проявлятися клінічно. Однак, незважаючи на це, патологічний процес прогресує й призводить до необоротних змін міокарда й в результаті до застійної СН.
Ендогенна опіоїдна система бере активну участь у формуванні відповідних реакцій організму на зміну умов існування й внутрішнього середовища [Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б., 2002]. Результати різноманітних досліджень при ішемії-реперфузії, імобілізаційному стресі й аритмогенних впливах указують на позитивний ефект активування периферичних опіатних рецепторів (ОР) застосуванням їх синтетичних агоністів [Лишманов Ю.Б., 1994; Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б., 2002]. Однак ще залишається недослідженим ефект активації цих рецепторів на тлі окисного стресу.
Таким чином, ураховуючи труднощі прогнозування кардіотоксичності антрациклінів за клінічними ознаками, імовірність її проявлення після довгого періоду часу після закінчення хіміотерапії й особливо тяжке протікання в разі розвитку застійної СН, можна вважати, що ця проблема являє собою первинний клінічний інтерес, а вивчення патогенетичних механізмів кардіотоксичної дії цих препаратів і розробка критеріїв ранньої діагностики дозволять теоретично обґрунтувати методи корекції пошкоджень серця на ранніх етапах і, таким чином, попередити розвиток тяжких пізніх кардіальних ускладнень.
Мета дослідження. Встановити роль біохімічних регуляторних систем серця – опіатних рецепторів, обміну оксиду азоту, К⁺_АТФ–каналів, сфінгозинового шляху в розвитку апоптозу й в перерозподілі тканинної води при гострій серцевій недостатності в експерименті.
Завдання дослідження:
1.                Вивчити ступінь розвитку апоптотичних процесів біохімічно за ДНК-фрагментацією в порівнянні з морфологічною детекцією при використанні ядерного барвника Хехст у тканині міокарда при антрацикліновій моделі гострої серцевої недостатності (ГСН) і за умов активації ОР.
2.                Визначити особливості оксид азоту–залежного механізму активації апоптозу в тканині міокарда за рівнем стабільних метаболітів оксиду азоту – нітрит- і нітрат-аніонів та вплив активації периферичних ОР на їх вміст.
3.                Встановити роль ОР у регуляції К⁺_АТФ–каналів плазматичної й мітохондріальної мембран кардіоміоцитів за умов стимульованого апоптозу.
4.                Дати характеристику реактивності прооксидантно-антиоксидантної системи міокарда за умов активації периферичних ОР при стимуляції клітинної загибелі.
5.                Вивчити стан сфінгомієлінового метаболічного шляху в кардіоміоцитах при стимуляції апоптозу й на тлі активації периферичних ОР.
6.                На основі даних ядерно-магнітно-резонансної (ЯМР) релаксометрії вивчити релаксаційні механізми апоптозу при розвитку експериментальної ГСН і при активації ОР.
Об’єкт дослідження – стан апоптотичного процесу в міокарді на моделі ГСН.
Предмет дослідження – реакції різноманітних шляхів регуляції апоптозу міокарда – ОР, К⁺_АТФ–каналів, оксиду азоту (NO), вільного сфінгозину (СФЗ).
Наукова новизна отриманих результатів. На антрацикліновій моделі ГСН встановлено внесок вивчених шляхів регуляції в розвиток апоптотичних процесів у міокарді, що дозволить поглибити знання про програмовану клітинну загибель на молекулярному рівні й встановити її роль у патогенезі СН.
Вперше виявлено, що активація ОР у міокарді за умов розвитку антрациклінової ГСН викликає антиапоптотичний ефект.
Встановлено, що блокування К⁺_АТФ-каналів міокарда негативно впливало на показники фрагментованої ДНК (ф-ДНК) міокарда, що в свою чергу попереджалося попередньою активацією периферичних ОР.
Розуміння ролі NO в регуляції апоптозу при цій моделі ГСН розкрило можливі шляхи його фармакологічної корекції блокаторами ендогенного NO в клінічній практиці.
Комплексне вивчення ЯМР-релаксаційних показників біологічних рідин у взаємозв’язку з рівнем апоптозу в кардіоміоцитах дозволило з’ясувати механізми порушення водного балансу організму в цілому при СН.
Отримані ЯМР-показники дали патогенетичне обґрунтування їх системному ефекту при ГСН, підвищуючи діагностичну значимість цього методу експрес-діагностики серцево-судинної патології.
Результати дослідження дозволили розвити наукові уявлення про низку біохімічних сигнальних шляхів апоптозу при серцево-судинній патології й сприятимуть розробкам терапевтичних підходів у клінічній кардіології.
Практична значимість роботи. Визначені закономірності реактивності механізмів, які модулюють апоптоз при стимуляції опіоїдної регуляції біохімічних функцій, мають суттєве значення для можливого попередження розвитку патологічних проявів у віддалений період після формування ГСН.
ЯМР-параметри тканин можуть бути використані при оцінці біохімічних змін, що протікають у міокарді при введенні препаратів з різною про- й антиапоптотичною спрямованістю.
Факт тривалої активності антиоксидантної системи й відсотка ф-ДНК у відповідь на попередню активацію ОР до формування ГСН дещо пояснює патогенез і патоморфоз останньої, що розвинулася після застосування антрациклінових антибіотиків. Результати роботи використовуються в учбовому процесі, при роботі аспірантів і наукових співробітників за методами біохімічного аналізу патологічних процесів у тканинах і клітинних культурах.
Одержані результати сприятимуть удосконаленню біохімічної корекції розладів, що формуються на тлі окисного стресу, не лише в лабораторних умовах, але й при подальших розробках і патогенетичній терапії в клініці.
Особистий внесок здобувача. Автором здійснено аналіз попередніх наукових літературних даних, обґрунтована актуальність і необхідність дослідження, його мета й завдання, сформовано групи спостереження. Особисто розроблено програму дослідження, обґрунтовано й відібрано методи дослідження, розроблено протокол для фіксації результатів і структуру бази даних. Самостійно проведені біохімічні дослідження процесів стимуляції клітинної загибелі й регуляторного впливу активації ОР у сформованих групах тварин. Здобувач безпосередньо приймала участь у проведенні імунофлуоресцентного й гістологічного аналізів. Заповнена база даних, проведений статистичний аналіз та інтерпретація отриманих результатів. Особисто виконано інформаційний пошук, написання всіх розділів, створення ілюстрацій та формування висновків.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були повідомлені й апробовані на I-й регіональній науково-практичній конференції молодих вчених і студентів “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні” (м. Луганськ, 2005 р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, інтернів і молодих вчених “Проблеми захисту інтелектуальної власності в медицині та біології” (м. Луганськ, 2005 р.); II-й регіональній науково-практичній конференції молодих учених і студентів “Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні” (м. Луганськ, 2006 р.); 60-й ювілейній науково-практичній конференції студентів і молодих вчених “Актуальні проблеми сучасної медицини”, (м. Київ, 2006 р.); IX-му Українському біохімічному з’їзді (м. Харків, 2006 р.); міжкафедральних засіданнях працівників кафедри медичної хімії й науково-дослідницького центру Луганського державного медичного університету.
Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 14 наукових праць. Серед них: 6 статей у фахових виданнях (2 – без співавторів), 3 патенти на корисну модель, 5 тез доповідей у матеріалах п’ятьох наукових конференцій.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 4 розділів основної частини (огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень), висновків і списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 7 таблицями й 34 рисунками. Повний обсяг дисертації – 110 сторінок. Список літератури 250 джерел (87 кирилицею, 163 латиницею).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали й методи дослідження. Експеримент було проведено на 492 білих щурах-самцях 16–18-тижневого віку, маса яких становила 250–300 грам. При постановці експерименту ми керувалися “Загальними етичними правилами експериментів на тваринах”, ухваленими I Національним конгресом з біоетики від 20 вересня 2001 року, Київ, Україна. Протокол експерименту узгоджений з комісією з біоетики Луганського державного медичного університету.
У тварин формували ГСН шляхом введення доксорубіцину гідрохлориду (ВАТ “Київмедпрепарат”, м. Київ) у дозі 20 мг/кг у вигляді 2 % водного розчину одноразово інтраперітонеально. Контрольним щурам вводили відповідний об’єм 0,9 % ізотонічного розчину натрію хлориду. Тварин спостерігали до сьомої доби експерименту включно.
Даларгін (синтетичний лей-енкефалін, D-Ala²-Leu⁵-Arg⁶-енкефалін) (ЗАТ “БИОЛИК”, м. Харків) вводили інтраперітонеально в дозі 100 мкг/кг маси щурів у вигляді 0,1 % водного розчину за 20 хвилин до формування ГСН протягом усіх діб її розвитку. Ін'єкцію налоксону (антагоніст ОР) (ЗАТ “БИОЛИК”, м. Харків) у дозі 0,5 мг/кг у вигляді 0,04 % водного розчину вводили інтраперітонеально за 20 хвилин до введення даларгіну й протягом періоду спостереження, одноразово.
Неселективне інгібування АТФ-чутливих К⁺_АТФ-каналів викликали ін'єкцією глібенкламіду (ТОВ “Фармацевтична компанія “ЗДОРОВ’Я”, м. Харків) у дозі 0,3 мг/кг у вигляді 0,05 % водного розчину за 20 хвилин до введення даларгіну протягом усього періоду спостереження.
У кожній експериментальній групі тварин проводили морфологічну детекцію апоптозу кардіоміоцитів за допомогою флуоресцентної мікроскопії з використанням барвника Хехст 33342, який зв’язується з ДНК; імунофлуоресцентний аналіз (МТТ-аналіз) і кількісне визначення генетичних маркерів апоптозу р53, Bcl-2 в тканині міокарда; у тій же тканині методом фотометрії визначали відсоток ф-ДНК (Messmer U.K., 1996), активність супероксиддисмутази (СОД) і вміст вільного СФЗ (модифікований метод Прохорової М.І., 1982); рівень NO в тканині міокарда й сироватці крові за концентрацією NO₂^- й NO₃^- (Орлова Е.А., 2001); час релаксації протонів води тих же тканин за даними ЯМР-релаксометра "Mіnіspec pc 100" фірми "Bruker" (Німеччина), укомплектованого модульними програмами: EDM 110A; EDM 510A; 511A; 610A; 612A; 613A, що дозволяють змінювати послідовність імпульсів; загальну оксидантну активність (ЗОА) і загальну антиоксидантну активність (ЗАА) сироватки.
Первинний цифровий матеріал експериментальних досліджень був оброблений традиційними методами варіаційної статистики (Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2000). Для оцінки достовірності отриманих результатів був використаний критерій Стьюдента. Результати розціню­вались як достовірні при р<0,05.
Результати дослідження та їх обговорення. Одним з найбільш характерних біохімічних критеріїв оцінки активності процесів апоптозу в тканині є показник фрагментації виділеної ДНК (Walker P.R., 1994). Проведені нами дослідження показали (Рис. 1), що найбільший рівень ф-ДНК при моделюванні ГСН (Шляхто Е.В. та ін., 2006; Giordano F.J., 2005) був на третю добу експерименту – 96,28 % (р<0,01) з подальшим зниженням значень до сьомої доби – 14,17 % (р<0,01). Попередня активація периферичних м- й д-ОР (Fryer R.M., et al, 2000; Лишманов Ю.Б. и др., 2000) призвела до достовірного зниження рівня ф-ДНК по відношенню до групи ГСН на третю, п’яту й сьому добу – падіння відсотка фрагментації склало 20,17 % (р<0,05), 19,56 % (р<0,001) і 6,97 % (р<0,05) відповідно.
Ці дані мали своє підтвердження при морфологічній оцінці зрізів сердець відповідних експериментальних груп із застосуванням гематоксилін-еозину й імунофлуоресцентного забарвлення за Хехстом.
При паралельному введенні глібенкламіду (неселективного блокатора К⁺_АТФ-каналів) і даларгіну спостерігалося повне усування цитопротекторного ефекту останнього. Механізм цитопротекторної дії активаторів мітохондріальних каналів повністю не вивчено, однак встановлено, що вони поперед-жають розпад АТФ. Наші дані дозволяють припустити, що активація м- й д-ОР призводить до відкриття К⁺_АТФ–каналів внутрішніх мембран мітохондрій, що може сприяти енергетиці клітини.

Рис. 1. Рівень фрагментації ДНК на тлі формування ГСН й при попередній активації периферичних ОР (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);

 ** - показники достовірні по відношенню до групи ГСН+Дал (р<0,05);
 # - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
Завдяки механізмам своєї дії білок р53 розглядається як проапоптотичний маркер (Das D. K., et al, 2004). Вивчення експресії р53 (Рис. 2) показало її значне підсилення, починаючи з першої доби: на 5,3 %, 44,6 % (р<0,01), 57,2 % (р<0,01) і 69,3 % (р<0,01) щодо групи контролю відповідно діб спостереження. Застосування даларгіну призвело до зниження експресії на третю добу на 3,2 %, на п’яту – на 21,9 % й на сьому – на 38,7 % відносно групи ГСН.

Рис. 2. Експресія р53 при активації периферичних ОР на тлі формування ГСН (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
 ** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
 # - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
Відомо, що кардіоміоцити експресують білки Bcl-2 родини (Berry С., et al., 2000). Щодо формування окисного стресу в міокарді експресія внутрішньоклітинного антиапоптотичного маркера Всl-2 (Рис. 3) супроводжувалась її зниженням на третю добу на 13,6 % (р<0,01), на п’яту – на 29,7 % (р<0,01) і на сьому – на 18,9 % (р<0,01).
Попередня активація периферичних м- й д-ОР призвела до зниження експресія на третю добу лише на 7,5 %, на п’яту – на 11,4 % (р<0,05) і на сьому – на 12,3 % щодо групи контролю (Рис. 3).


Рис. 3. Експресія Всl-2 при активації периферичних ОР на тлі формування ГСН (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
 ** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
 # - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
Трансмембранні оксидоредуктази широко включені до контролю внутрішньоклітинного окисно-відновного стану (Berridge M.V. et al., 2000). Вивчення метаболічної активності клітин міокарда за здатністю мітохондріальних НАДН-дегідрогеназ перетворювати водорозчинний МТТ у забарвлений нерозчинний у воді формазан показало (Рис. 4), що при окисному стресі зниження їх активності склало на першу добу 20,6 % (р<0,01), на третю – 21,5 % (р<0,01), на п’яту – 17,2 % й на сьому – 8,3 % (р<0,01) відносно контрольних значень.
 За умов попередньої активації периферичних ОР активність мітохондріальних дегідрогеназ була нижча за контрольні значення на першу добу на 14,6 %, на третю – на 16,4 %, на п’яту – на 10,3 % (р<0,05) і на сьому – на 4,9 % (р<0,05).


Рис. 4. Активність мітохондріальних дегідрогеназ на тлі формування ГСН й при попередній активації периферичних ОР (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
 ** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
 # - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
У зв’язку з тим, що NO розглядається як біфункціональна молекула, механізм дії якої залежить від умов, за яких вона синтезується (Манухина Е.Б. и др., 2002), нами було вивчено концентрацію його стабільних метаболітів. Формування ГСН в міокарді супроводжувалося підвищенням загального рівня NO_х уже з першої доби: на 30,81 % (р<0,05), 49,04 % (р<0,001), 32,17 % (р<0,01) і 14,26 % відповідно діб спостереження.
Попереднє застосування даларгіну, як активатора периферичних м- й д-ОР, призвело до зниження загального вмісту NO_х. Показник був підвищеним лише на 23,04 % (р<0,01), на 30,83 % (р<0,01) (зниження на 12,22 % (р<0,05) відносно групи ГСН), на 14,59 % (р<0,05) (нижче на 13,31 % (р<0,05) щодо групи ГСН) і на 2,34 % (зниження на 10,47 % (р<0,05) відносно групи ГСН) відповідно діб спостереження.
Порушення функції ендотелію при формуванні окисного стресу призвело до пригнічення механізмів синтезу фізіологічних, нетоксичних доз NO, що можна було спостерігати за зниженим відсотком NO₂^- від загальної кількості NO_х: на першу добу на 23,56 %, на третю – на 40,94 % (р<0,001), на п’яту – на 55,22 % (р<0,001) і на сьому – на 38,98 % (р<0,001) (Рис. 5).

А	Б

Рис. 5. Співвідношення рівнів стабільних метаболітів NO₂^- й NO₃^- в тканині міокарда в загальній кількості NO_х при активації периферичних ОР (Б) на тлі формування ГСН (А) (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
# - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
При застосуванні даларгіну показник відсотка нітрит-аніона в загальній кількості NO_х був збільшений на першу добу на 4,51 % відносно групи контролю й на 36,71 % (р<0,001) щодо групи ГСН; на третю й п’яту добу частка NO₂^- залишалася зниженою відносно контрольних значень на 28,87 % (р<0,05) і 32,62% (р<0,01) відповідно (але збільшеною на 20,43 % й 50,47 % (р<0,001) відповідно щодо групи ГСН); на сьому добу спостерігалося зниження відсотка NO₂^- на 16,96 % відносно групи контролю й підвищення на 36,09 % (р<0,001) щодо групи ГСН.
Останнім часом вважається, що при стимуляції апоптозу оксидантами в різних типах клітин активується сфінгомієлін-церамідний шлях (Dyntar D., et al., 2001; Son J.H., et al., 2007). Нами було проведене визначення рівня вільного СФЗ в тканині міокарда (Рис. 6).
Так, у щурів контрольної групи вміст вільного СФЗ дорівнював 2,08±0,31 мкг/г. Експериментальна ГСН супроводжувалася збільшенням концентрації СФЗ, яка складала: 3,05±0,19 мкг/г (p<0,05), 7,02±1,13 мкг/г (p<0,001), 7,05±1,14 мкг/г (p<0,001) і 9,77±0,94 мкг/г (p<0,001) відповідно до діб спостереження. При активації периферичних м- й д-ОР підвищення рівня СФЗ мало такі значення: 2,87±0,26 мкг/г, 4,13±0,47 мкг/г (p<0,01), 3,77±0,48 мкг/г (p<0,05) і 4,34±0,41 мкг/г (p<0,001) відповідно до діб спостереження.
Проведене дослідження кореляційного зв’язку між вмістом вільного СФЗ й рівнем ф-ДНК лише підтверджує один з механізмів розвитку ГСН при цій моделі (Suzuki E., et al., 2004; Matsunaga T., еt al., 2004).

Рис. 6. Співвідношення відсотка вільного СФЗ до відсотка ф-ДНК при активації периферичних ОР на тлі формування ГСН (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
 ** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
 # - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
Більш низький відсоток збільшення СФЗ може констатувати менш виражений рівень медіації для подальшої деструкції фосфоліпідних компонентів клітинних мембран та апоптотичної загибелі кардіоміоцитів (Рис. 6).
Характеризуючи прооксидантну й антиокисну рівновагу в тканинах ми оцінили активність СОД, як ключового ферменту антиоксидантного захисту (Molavi B. et al., 2004; Childs C. et al., 2002). Встановлено, що формування окисного стресу супроводжувалося значним підвищенням активності цього ферменту з максимальними значеннями на першу добу спостереження й подальшим поступовим зниженням до сьомої доби (Табл. 1).
Попереднє застосування агоністу ОР також викликало значне підвищення активності цього ферменту, а відмінністю було те, що до останньої доби експерименту значення залишалися доволі високими, і це, можливо, забезпечило захист клітин міокарда від проапоптотичної дії активних форм кисню.
З метою підтвердження системного характеру зазначених впливів ми провели біохімічне дослідження ЗОА й ЗАА сироватки крові. Ці показники досить виразно говорили про наявність найбільших пошкоджень у системі антиоксидантного захисту, переважно на третю й п’яту добу, коли вони мали статистично достовірну відмінність щодо контрольних величин. Також дуже чітко простежувалася динаміка змін у бік активації антиоксидантного захисту при активації периферичних ОР, що мало виражений кореляційний зв’язок з рівнем ф-ДНК.
Таблиця 1.
Показники активності СОД, ЗОА й ЗАА сироватки крові при активації периферичних ОР на тлі формування ГСН (%)

	СОД, % інгіб.		ЗОА (%)		ЗАА (%)
	ГСН	ГСН+Дал	ГСН	ГСН+Дал	ГСН	ГСН+Дал
Контроль,(n=6)	17,51±0,8	17,51±0,8	55,32±0,9	55,32±0,9	55,17±0,7	55,17±0,7
1 доба, (n=6)	81,71±1,8*	83,46±1,4*	58,86±1,6	56,11±1,3	25,75±0,6**	53,63±0,9#
3 доба, (n=6)	48,25±1,1*	36,38±1,2	68,57±1,2*	59,32±1,4#	20,89±1,1**	32,51±1,8*,#
5 доба, (n=6)	47,86±1,0*	45,33±1,3*	63,98±1,2*	57,64±1,2#	37,09±1,4**	44,76±1,3*
7 доба, (n=6)	28,79±1,1*	44,36±1,6*,#	57,72±1,8	55,59±1,1	47,78±1,5*	51,83±1,1

Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
 ** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
 # - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
Існує припущення, що в процесі апоптозу спостерігається порушення об’єм-регулюючих механізмів клітини (Yu S., et al., 2000; Segal M.S., et al, 2001), у тому числі й роботи Cl^-- і К⁺-об’єм-регулюючих каналів. Нами були досліджені ЯМР-релаксаційні показники клітинного об’єму залежно від періоду спостереження (Табл. 2).
Динаміка показників спін-спінової й спін-гратчастої релаксації до третьої доби формування окисного стресу свідчить про втрату тканиною міокарда фракції вільної води, що, за експериментальними даними, супроводжувалося дегідратацією тканин серця на першу добу й подальшою тенденцією до гідратації, починаючи з третьої доби (Рис. 7, 8).
Таблиця 2.
Розподіл показників Т1 і Т2 в тканині міокарда при активації периферичних ОР на тлі формування ГСН (мс)

	Т1 (мс)		Т2 (мс)
	ГСН	ГСН+Дал	ГСН	ГСН+Дал
Контроль(n=6)	554,88±22,46	554,88±22,46	44,95±0,41	44,95±0,41
1 доба, (n=6)	484,25±27,86*	680,79±17,38**,#	42,13±0,47**	46,87±0,68*, #
3 доба, (n=6)	544,81±35,86	658,56±8,75**,#	42,62±2,35	45,92±0,81
5 доба, (n=6)	545,81±44,79	693,72±10,12**,#	47,64±0,62**	49,17±0,88**,#
7 доба, (n=6)	667,85±17,91**	692,19±20,15**	46,24±1,39	38,88±1,58**,#

Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
 ** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01);
 # - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
Отримані дані лише підтверджують етапність вивченого раніше механізму розвитку ГСН при застосуванні антрациклінових антибіотиків (утрата клітиною рідини й подальше “зморщення”), який заснований на інгібуванні синтезу нуклеїнових кислот, модифікації в транспорті сарколемального Са²⁺, розвитку дисбалансу в електролітному складі (Minotti G., et al., 2004). Інтервал утрати структурованої внутрішньоклітинної води співпадав з початком максимальних проявів клітинної деградації, тому нами було виявлено, що показник фракції внутрішньоклітинної води (Ра) мав досить чіткий кореляційний зв'язок з відсотком фрагментації ДНК в тканині міокарда.

Рис. 7. Розподіл показників внутрішньо- (Ра) й позаклітинної (Рb) води в тканині міокарда при формуванні ГСН (%).
Примітки: ** - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,01).
На рис. 7 і 8 видно, що на тлі застосування даларгіну Т1-релаксація була достовірно вища за групу формування патології, а Т2 – мала тенденцію до зниження. Таке сполучення часових складових указує, що сигнал іде від кристалічної фракції води, тобто спостерігається її приріст. При цьому частка внутрішньоклітинної води на першу, третю й сьому добу мала тенденцію наближення до контрольних значень.

Рис. 8. Розподіл показників внутрішньо- (Pa) й позаклітинної (Pb) води в тканині міокарда при активації периферичних ОР на тлі формування ГСН (%).
Примітки: * - показники достовірні по відношенню до групи контролю (р<0,05);
 # - показники достовірні по відношенню до групи ГСН (р<0,05).
У наших дослідженнях формування стану окисного стресу в міокарді супроводжувалося підвищенням експресії про- (р53) і зниженням експресії антиапоптотичних (Bcl-2) білків, що проявилося підвищенням рівня ф-ДНК кардіоміоцитів. Також спостерігався дисбаланс між захисними силами організму й пошкоджуючими факторами в бік останніх.
Дані, отримані в результаті вивчення розподілу й функцій ОР та опіоїдних пептидів, дозволяють пропонувати застосування цих препаратів з успішним результатом при ряді патологічних станів серцево-судинної системи. Встановлено, що ці ендогенні речовини можуть бути більш сильнодіючими, але викликати меншу кількість побічних ефектів, ніж звичайні фармакологічні засоби [Gross G.J., Peart J.N., 2007].
Встановлені механізми пострецепторної дії ліганду ОР дозволяють говорити про участь у пошкодженні міокарда при гіперсекреції активних форм кисню таких посередників як NO й СФЗ. Стає зрозумілим, що гіперпродукція NO на даній моделі ГСН активувала процеси клітинної загибелі.

ВИСНОВКИ
1.     Активація периферичних м- й д-опіатних рецепторів при антрацикліновій моделі стимуляції апоптозу міокарда супроводжується зниженням його проявів у кардіоміоцитах, активацією антиоксидантної системи й нормалізацією клітинного об’єму за участю системи оксиду азоту, сфінгомієлінового шляху, К⁺_АТФ-каналів.
2.     Вивчено біохімічні ознаки активації апоптотичних процесів у серці на моделі формування гострої серцевої недостатності окисного ґенезу. Відмічено максимальне підвищення деградації ДНК (на 96,28 %) на третю добу спостереження. Встановлено, що за умов активації опіатних рецепторів морфологічні й біохімічні прояви апоптозу мали значно меншу вираженість у тканині міокарда (підвищення на 56,79 %).
3.     Визначено, що початкова стадія гострої серцевої недостатності окисного генезу супроводжувалася максимальним підвищенням загального рівня оксиду азоту в тканині міокарда на третю добу (на 49,04 %). Перерозподіл стабільних метаболітів оксиду азоту в бік нітрит-аніонів при активації периферичних м- й д-опіатних рецепторів свідчить про можливу участь останніх у регуляції системи оксиду азоту.
4.     Антиапоптотичний ефект синтетичного лей-енкефаліну – даларгіну – реалізується через активацію м- й д-опіатних рецепторів за участю К⁺_АТФ-каналів кардіоміоцитів за умов стимульованого апоптозу.
5.     На тлі окисного стресу в міокарді як перша реакція спостерігається підвищення активності системи антиоксидантного захисту (у 4,6 рази) з подальшим її пригніченням. За умов активації периферичних опіатних рецепторів не спостерігалося зниження активності супероксиддисмутази протягом усього експерименту.
6.     Встановлена активація сфінгомієлінового метаболічного шляху в міокарді при експериментальній гострій серцеві недостатності. Вона супроводжувалася прогресуючим підвищенням вільних сфінгоїдних основ (у 4,7 рази). Під впливом даларгіну цей показник значно знижувався (у 2,1 рази).
7.     З першої по третю добу розвитку гострої серцевої недостатності в міокарді встановлені зниження часу релаксації й частки внутрішньоклітинної води кардіоміоцитів, які з третьої по сьому добу змінювались у бік гідратації клітин. При стимуляції апоптозу на цьому тлі через опіатні рецептори спостерігалося збільшення часу релаксації й зменшення внутрішньоклітинного об’єму, що обумовлено ущільненням гідратного шару тканинної води й вказує на нормалізацію клітинних процесів у міокарді.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ
1.     Андросова М.Е. Влияние даларгина на ЯМР-релаксацию сыворотки крови крыс при экспериментальной сердечной недостаточности // Український медичний альманах. – 2006. – Т. 9, № 2. – С. 11–12.
2.     Комаревцева И.А., Андросова М.Е. Содержание фрагментированной ДНК в миокарде крыс при доксорубицин-индуцированной сердечной недостаточности и на фоне введения даларгина // Український медичний альманах. – 2006. – Т. 9, № 3. – С. 71–73.
3.     Комаревцева И.А., Андросова М.Е. Уровень свободного сфингозина в миокарде при введении даларгина на фоне доксорубицин-индуцированной кардиомиопатии // Український медичний альманах. – 2006. – Т. 9, № 4. – С. 49–50.
4.     Комаревцева И.А., Андросова М.Е. ЯМР-релаксация клеток миокарда крыс при стимуляции опиоидных рецепторов на модели сердечной недостаточности // Український медичний альманах. – 2006. – Т. 9, № 5. – С. 61–63.
5.     Андросова М.Е. Стабильные метаболиты оксида азота при экспериментальной сердечной недостаточности на фоне активации опиатных рецепторов // Український журнал клінічної та лабораторної медицини – 2007. – Т. 2, № 1. – С. 61–65.
6.     Комаревцева І.О., Андросова М.Є. Вплив активації периферичних опіатних рецепторів на вміст стабільних метаболітів оксиду азоту, вільного сфінгозину, оксидантно-антиоксидантний стан при експериментальному окисному стресі міокарда // Медична хімія. – 2007. – Т. 9, № 2. – С. 29–33.
7.     Патент України на корисну модель. Спосіб підвищення толерантності кардіоміоцитів до доксорубіцин-індукованого оксидативного стресу / Комаревцева І.О., Андросова М.Є. – № 29411 від 10.01.2008, Бюл. № 1.
8.     Патент України на корисну модель. Метод ранньої діагностики апоптотичних процесів у культурах клітин / Комаревцева І.О., Клімочкіна О.М., Орлова О.А., Андросова М.Є., Шипілова І.В., Бриндак Д.В. – № 25410 від 10.08.2007, Бюл. № 12.
9.     Патент України на корисну модель. Спосіб визначення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в культурі клітин / Комаревцева І.О., Клімочкіна О.М., Андросова М.Є., Шипілова І.В. – № 24577 від 10.07.2007, Бюл. №10.
10.Андросова М.Є., Денисенко А.С., Приходько А.С., Парінов Р.А. Апоптотична загибель кардіоміоцитів щурів під дією доксорубіцину // Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні: Тези I регіональної науково-практичної конференції молодих вчених і студентів. – Луганськ, 2005. – С. 41–42.
11.Androsova M.Ye., Parinov R.A., Shipilov K.V.NMR-relaxometry of serum of animals at doxorubicin induced heart insufficiency // Теоретические и практические аспекты современной медицины: Материалы 78-й научно-практической конференции студентов и молодых учених. – Симферополь, 2006. – С. 115.
12.Андросова М.Е., Паринов Р.А., Соловьева И.В. Биохимические механизмы активации опиоидных рецепторов при сердечной недостаточности у крыс // Перспективи розвитку фармацевтичної науки та практики в Україні: Тези II регіональної науково-практичної конференції молодих вчених і студентів. – Луганськ, 2006. – С. 10–11.
13.Андросова М.Е., Паринов Р.А. Влияние даларгина на сфингозиновый сигнальный путь активации апоптоза при экспериментальной сердечной недостаточности // Актуальні проблеми сучасної медицини: Тези 60 науково-практичної конференції студентів і молодих вчених Національного медичного університету імені О.О.Богомольця з міжнародною участю. – Київ, 2006. – С. 49–50.
14.Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Андросова М.Е., Сенчий В.Н. Активация опиатных рецепторов и уровень метаболитов NO при доксорубицин-индуцированной сердечной недостаточности // IX Укр. біохімічний з”їзд: Матеріали з’їзду – Харків, 2006. – Т. 2. – С. 69.
АНОТАЦІЯ
Андросова М.Є. Роль опіоїдів у регуляції механізмів апоптозу при гострій серцевій недостатності в експерименті. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.32 – медична біохімія. – Луганський державний медичний університет, Луганськ, 2008.
Дисертація присвячена вивченню ролі біохімічних регуляторних систем – опіатних рецепторів, сфінгомієлінового шляху, оксиду азоту й К⁺_АТФ-каналів – у регуляції апоптозу в процесі формування гострої серцевої недостатності.
Встановлено, що стимуляція програми клітинної загибелі при експериментальній гострій серцевій недостатності супроводжується зниженням антиоксидантних властивостей організму, активацією сфінгомієлінового метаболічного шляху, підвищенням вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту (здебільшого за рахунок нітрат-аніону), гідратацією клітин. Досліджено рівень апоптозу в міокарді при активації периферичних опіатних рецепторів за участю К⁺_АТФ – каналів.
У роботі вперше представлена можливість регуляції апоптотичних процесів у міокарді через периферичні м- й д-опіатні рецептори. Встановлено, що в цьому процесі також приймала участь система оксиду азоту (за рахунок конститутивних синтаз), сфінгомієліновий сигнальний шлях, що супроводжувалося більш тривалою стимуляцією антиоксидантної системи організму, приростом у міокарді фракції кристалічної води зі зниженням частки внутрішньоклітинної води. Це підтверджує можливу участь опіоїдів у позитивному впливі на підтримання нормальної життєдіяльності кардіоміоцитів.
Ключові слова: міокард, серцева недостатність, апоптоз, фрагментація ДНК, оксид азоту, сфінгозин, опіатні рецептори, ЯМР-релаксація.

АННОТАЦІЯ
Андросова М.Е. Роль опиоидов в регуляции механизмов апоптоза при острой сердечной недостаточности в эксперименте. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.32 – медицинская биохимия. – Луганский государственный медицинский университет, Луганск, 2008.
Диссертация посвящена изучению роли биохимических регуляторных систем – опиатных рецепторов, сфингомиелинового пути, оксида азота и К⁺_АТФ-каналов – в регуляции апоптоза в процессе формирования острой сердечной недостаточности.
В основе работы лежит: исследование степени развития апоптотических процессов в миокарде биохимически (по фрагментации ДНК) в сопоставлении с морфологической детекцией и иммунофлуоресцентным определением экпрессии проапоптотических (p53) и антиапоптотических (Bcl-2) маркеров (с использованием ядерного красителя Хехст) при стимулировании программируемой клеточной гибели (антрациклиновая модель экспериментальной острой сердечной недостаточности); установление уровня общего оксида азота по содержанию его стабильных метаболитов – нитрит- и нитрат-анионов в ткани миокарда; рассмотрение системы сфингозина, как сигналпередающей в развитии апоптоза; определение активности митохондриальных дегидрогеназ и основного фермента антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы; изменения времени релаксации протонов тканевой воды по данным ЯМР-релаксометрии.
Как показало наше исследование, ДНК-фрагментация имела четкую прямую корреляцию с экспрессией проапоптотических (p53) и обратную корреляцию с экспрессией антиапоптотических (Bcl-2) маркеров. Активация периферических м- и д-опиатных рецепторов даларгином на фоне формирования острой сердечной недостаточности приводила к уменьшению уровня фрагментированной ДНК, что сопровождалось приближением показателей активности митохондриальных дегидрогеназ к контрольным значениям. Это, в свою очередь, сопровождалось угнетением окислительных процессов в миокарде и активацией антиоксидантной системы организма.
При формировании острой сердечной недостаточности было выявлено повышение содержания стабильных метаболитов оксида азота (преимущественно за счет нитрат-аниона). Предварительная активация периферических опиатных рецепторов приводила к снижению общего уровня оксида азота с увеличением доли нитрит-аниона.
Была установлена активация сфингомиелинового сигнального пути при стимуляции окислительных процессов в миокарде, что проявилось прогрессирующим достоверным повышением уровня свободного сфингозина. Корреляционный анализ показал зависимость между уровнем свободных сфингоидных оснований и степенью деградации ДНК (положительная), активностью супероксиддисмутазы (отрицательная) и содержанием стабильных метаболитов оксида азота (положительная).
В условиях стимуляции апоптоза установлено снижение времени релаксации с явлениями дегидратации тканей с первых по третьи сутки наблюдения, где интервал потери структурированной внутриклеточной воды совпадал с началом максимальных проявлений клеточной деградации (сильная положительная корреляционная связь). С третьих по седьмые сутки наблюдалось увеличение клеточного объема. При регуляции апоптоза в этих условиях через опиатные рецепторы наблюдался прирост фракции кристаллической воды. При этом доля внутриклеточной воды имела тенденцию приближения к контрольным значениям.
Установлено повышение уровня фрагментированной ДНК при блокаде К⁺_АТФ-каналов плазматической и митохондриальной мембран клеток миокарда под действием глибенкламида на фоне активации опиатных рецепторов. Эти данные свидетельствуют об участии К⁺_АТФ-каналов в регуляции апоптотических процессов в миокарде.
Таким образом, установленные эффекты активации опиатных рецепторов позволяют говорить об участии в повреждении миокарда при гиперсекреции активных форм кислорода таких посредников как оксид азота и сфингозин.
Это, в свою очередь, дает новые научные представления о биохимических процессах при патологиях и способствует продолжению исследований по разработке иных терапевтических подходов в клинической кардиологии.
Ключевые слова: миокард, сердечная недостаточность, апоптоз, фрагментация ДНК, оксид азота, сфингозин, опиатные рецепторы, ЯМР-релаксация.

SUMMARY
Androsova М.Ye. The role of opioids оn apoptosis mechanisms regulation at acute heart failure in experiment. – Manuscript.
The dissertation on competition a scientific degree of the candidate of medical sciences at a speciality 14.01.32 – medical biochemistry. – Luhansk state medical university, Luhansk, 2008.
The dissertation is dedicated to studying of a biochemical regulation of apoptosis on heart insufficiency formation in signal pathways of cell processes regulation – opioid receptors, sphingomyelinal, nitrogen monoxide and in cell volume regulation.
It was established what cell death program stimulation on experimental acute heart failure is accompanied with decreasing of antioxidant properties of organism, sphingomyelin pathway activation, also increasing on nitrogen monoxide stable metabolites level (mainly about nitrate-anion), with overhydration of cardiomyocytes. The apoptosis level in myocardium through peripheral opioid receptors activation with К⁺_АТФ-channels participation was discovered.
In research work it is for the first time is divsented possibility of apoptotic process regulation in myocardium through peripheral м- and д-opioid receptors. It was established what system of nitrogen monoxide, sphingomyeline signal pathway also took part at this process, and this accompanied with more long stimulation of antioxidant system, increasing in myocardium the crystal water fraction with decreasing of intracellular water part. This confirmed possible participation of opioids in positive influence on normal cardiomyocites vital function maintenance.
Key words: myocardium, heart failure, apoptosis, DNA-fragmentation, nitrogen monoxide, sphingosine, opioid receptors, NMR-relaxation.