Реферат на тему Порівняльний фармакологічний аналіз імунотропних властивостей ряду антибактеріальних препаратів які
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2015-01-01Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
На правах рукопису
Талат Хафіз Сулейман Абу-Кешк
удк:615.28:612.017:616.08
ПОРІВНЯЛЬНИЙ ФАРМАКОЛОГІЧНИЙ АНАЛІЗ ІМУНОТРОПНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ РЯДУ АНТИБАКТЕРІАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ, ЯКІ ЗАСТОСОВУЮТЬСЯ ПРИ ТУБЕРКУЛЬОЗІ ЛЕГЕНІВ
14.03.05 – фармакологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття вченого ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Науково-дослідному інституті легеневих захворювань, який розташований на базі Азербайджанського медичного університету (м. Баку) Міністерства охорони здоров’я Азербайджанської Республіки, і у Національному фармацевтичному університеті Міністерства охорони здоров’я України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор ГАНІЄВ Муса Мехті Огли Азербайджанський медичний університет, завідувач кафедри фармакології
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор ДИКИЙ Ігор Леонідович Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри мікробіології
доктор біологічних наук, професор КЛІМОВА Олена Михайлівна Інститут загальної та невідкладної хірургії АМН України завідувачка діагностичною лабораторією
Захист відбудеться “ 21 ” березня 2008 р. о ______ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).
Автореферат розісланий “___” _________________ 2008 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук, професор Л.М.Малоштан
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Останні роки характеризуються розвитком епідемії туберкульозу (ТБ) у ряді країн, різкою зміною перебігу і структури клінічних форм інфекції.
Основним методом лікування ТБ є хіміотерапія, спрямована на знищення мікобактерій туберкульозу (МБТ). Хіміопрепарати, що застосовуються на різних етапах лікування, мають характерні для кожного з них механізми дії. Більшість протитуберкульозних препаратів (ПТП) справляє різноманітну дію на мікробну клітину, чим обумовлюються їх бактеріостатичний і бактерицидний ефекти. Комбінована хіміотерапія ПТП дозволяє запобігти або істотно затримати виникнення лікарсько-стійких штамів МБТ. Проте не можна виключати стан імунітету організму, що відіграє істотну роль у маніфестації туберкульозу.
В останній час ефективність антибактеріальної та симптоматичної терапії туберкульозу значно зменшилася. Зросла частота дисемінованих процесів, почастішали випадки (72,3%) прогресуючого перебігу з гострим початком і масивним бактеріовиділенням, різко збільшилося (до 50%) число хворих з первинною лікарською стійкістю до МБТ. Стійкість до двох препаратів – ізоніазиду і рифампіцину – відзначена у 12% випадків, до трьох – більш ніж у 67,8% випадків.
Окрім резистентності мікобактерій туберкульозу до ПТП, мала ефективність хіміотерапії пов’язана із застосуванням нераціональних лікарських форм антибактеріальних засобів, які не можуть створити їх високу терапевтичну концентрацію на тривалий час в організмі хворого.
Важливим фактором, що впливає на ефективність терапії при туберкульозі, є наявність у хворих тих чи інших дефектів імунної системи. Для раціонального застосування ПТП необхідно враховувати їх дію на неспецифічну резистентність організму та імунітет. У зв’язку із цим великого значення набуває оцінка імуномодулюючого ефекту препаратів, які застосовуються для хіміотерапії туберкульозу при призначенні їх хворим з різними імунодефіцитними станами. Проте у літературі практично немає даних про взаємовплив ПТП і показників імунітету.
Туберкульоз є переважною причиною смертності від інфекційних агентів. Щорічно реєструється з 2 млн. смертельних випадків і 8 млн. нових випадків захворювань. 2 млрд. людей, тобто третя частина населення земної кулі, інфіковані мікобактеріями туберкульозу (МБТ). Число нових випадків впродовж десятиліття від 1990 до 2000 рр. оцінюється в 90 мільйонів. Наведені дані свідчать про те, що туберкульоз набув характеру пандемії.
У сучасних умовах стає усе більш очевидним, що якість життя хворих із туберкульозом є визначеним критерієм сукупної оцінки їх стану та ефективності проведеної терапії.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є фрагментом планової науково-дослідної тематики Науково-дослідного інституту легеневих захворювань (м. Баку), який розташований на базі Азербайджанського медичного університету МЗ Азербайджанської Республіки (м. Баку, Азербайджан).”Отримання і вивчення нових препаратів із різноманітних химічних груп синтетичного і природного походжння. (No. Державної реєстрації 0106АЗ00790) Здобувач був виконавцем відповідного фрагменту комплексних науково-дослідних тем.
Мета і завдання дослідження. Мета роботи – порівняльне вивчення впливу протитуберкульозних препаратів (рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, канаміцину та ізоніазиду) на стан імунологічної реактивності in vitro та in vivo з подальшим встановленням їх імунотропних властивостей для оптимізації лікування туберкульозу.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:
Вивчити імунологічні особливості впливу протитуберкульозних засобів при експериментальному туберкульозі легенів у морських свинок і щурів.
Визначити характер і ступінь впливу рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, ізоніазиду і канаміцину на показники клітинної і гуморальної ланок імунітету у тварин і людей.
Проаналізувати ефективність протитуберкульозних засобів за впливом їх на кінетичне вираження Т-клітин імунітету у хворих з інфільтративною формою туберкульозу легенів і результатами експерименту у тварин для з'ясування найбільш оптимального протитуберкульозного препарату з імуномодулюючим ефектом.
Вивчити вплив поєднаного застосування рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, ізоніазиду і канаміцину на показники імунітету при експериментальному туберкульозі.
Об’єкт дослідження. Імунотропна активність протитуберкульозних препаратів та їх комбінацій; показники, що характеризують імунну систему.
Предмет дослідження. Протитуберкульозні препарати – рифампіцин, рифабутин, офлоксацин, ізоніазид, канаміцин, а також їх комбінації.
Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані імунологічні, клінічні методи дослідження, а також методи математичної статистики.
Наукова новизна. Вперше в експерименті та клініці проведений порівняльний аналіз імунотропних властивостей протитуберкульозних препаратів – рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, канаміцину та ізоніазиду з метою оптимізації терапії хворих на туберкульоз, у яких спостерігається імунодефіцит. Проведено фенотипування клітин, що дозволило визначити не тільки кількість окремих субпопуляцій, але й вміст у них активованих клітин. Вивчено експресію активаційних молекул на поверхні Т-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій. Показано зростання експресії активаційних маркерів на фоні Т-клітинного дефіциту у хворих туберкульозом легенів. Проведений аналіз імунорегуляторних клітин у хворих з інфільтративною формою туберкульозу. Виявлен вплив ПТП на функціональну активність регуляторних клітин. Визначено зміни відносної кількості активованих маркерів(CD – кластер диференцировки) CD25+ і CD69+ до і після лікування протитуберкульозною терапією, яка включає рифампіцин, рифабутин, офлоксацин і канаміцин. Вивчені імуномодулюючі і супресивні властивості ПТП у період культивування in vitro.
Практичне значення роботи. Наукові дані вперше збагачені інформацією щодо порівняльного аналізу впливу ряду препаратів на імунітет хворих туберкульозом. Розроблено передумови для удосконалення схеми терапії туберкульозу легенів ізоніазидом, рифабутином, офлоксацином як препаратами з найменш вираженими імунодепресивними властивостями. Отримано нові дані, які дозволяють розширити уявлення про участь активованих Т-лімфоцитів у розвитку туберкульозного процесу і визначити нові підходи до корекції порушень функціонування імунної системи на рівні активації імунорегуляторних субпопуляцій. Вивчення Т-клітинної імунної відповіді на вплив протитуберкульозної терапії вказує на необхідність інтенсифікації імунокоригуючої тактики у терапії специфічної інфекції. Визначення піку експресії CD25 і CD69 при культивуванні in vitro до і після стимуляції фітогемаглютиніна (ФГА) і лікарським препаратом допомагає в уточненні рівня дефекту в імунній системі при туберкульозі легенів.Результати проведених досліджень впроваждено в науково-педагогічну діяльність кафедр фармакології,клінічної фармакології та фармакотерапії вищіх навгальних закладі ЙЙЙ та ЙV ривня акредитації.
Особистий внесок здобувача. Робота виконана на базах Науково-дослідного інституту легеневих захворювань, який розташований на базі Азербайджанського медичного університету (м. Баку), і Національного фармацевтичного університету. Разом з науковим керівником були визначені мета і завдання дослідження, розроблений план досліджень. Здобувачем самостійно проведений літературний пошук і науковий аналіз даних щодо теми дисертації, повністю виконані імунологічні тести з морськими свинками і щурами. Спільно з науковим керівником проведений аналіз імунного статусу людей, хворих на інфільтративну форму туберкульозу легенів, а також визначені мета і завдання дослідження, сформульовані висновки і практичні рекомендації. Самостійно проведено статистичне опрацювання результатів досліджень.
Апробація роботи відбулася 28 квітня 2005 р. на міжкафедральній конференції в Азербайджанському медичному університеті (м. Баку), а також на конференції молодих вчених у Національному фармацевтичному університеті (м. Харків, 2007 р.),1 інформаційні лист.
Публікації. Основні положення дисертації опубліковані у 5 статтях провідних фахових видань, 1 тезах та 1 інформаційному листку.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 155 сторінці комп'ютерного тексту і складається з вступу, 5 глав, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури, який включає 187 джерела, з яких 153 – іноземних авторів. Робота ілюстрована 39 таблицями і 45 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. У результаті аналізу літературних джерел щодо протитуберкульозних препаратів для подальших досліджень були обрані рифампіцин, рифабутин, офлоксацин, канаміцин та ізоніазид, а також дві комбінації: ізоніазид + офлоксацин + рифабутин та ізоніазид + канаміцин + рифампіцин.
Враховуючи те, що рівень імунореактивності організму має важливе значення при призначенні хіміотерапії при туберкульозі, нами були досліджені показники імунітету тварин і людей, хворих на туберкульоз легенів.
Експерименти з доклінічного вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на імунітет тварин проводили на щурах і морських свинках. У досліді використані 320 статевозрілих морських свинок обох статей масою 280-305 г і 360 щурів інбредної лінії (WAG Wistar albina glaxo) масою 180-200 г. Під час експерименту тварини знаходилися у стандартних умовах у віварію згідно прийнятих санітарно-гігієнічних умов. Робота з тваринами проводилася відповідно до принципів Європейської конвенції із захисту лабораторних тварин з дотриманням норм GLP.
В експерименті тварин поділяли на 6 груп. У кожній групі було по 60 щурів або 30 морських свинок. Проводили дослідження крові, селезінки та легенів дослідних тварин.
Оцінку стану імунної системи тварин і пацієнтів проводили за допомогою визначення фагоцитарної активності лейкоцитів, уніфікованих методом інкубації культури клітин з частками латексу, а також за тестом з нітросинім тетразолієвим, методиками визначення Е-, ЕАС-, авторозіткоутворюючих клітин при змішуванні крові морських свинок і щурів між собою, визначенням гемолітичної активності сироватки шляхом розведень.
Підрахунок клітин здійснювали загальноприйнятим методом з використанням гемоцитометру (камери Горяєва). Для підрахунку ядровміщуючих клітин застосовували 2% розчин оцтової кислоти.
Вивчення морфології клітин, мієлограм і лейкограм крові проводили у мазках, виготовлених із суспензій клітин і забарвлених азур-ІІ-еозином за Романовським – Гімзе. У кожному мазку вивчали 300 клітин.
У крові тварин і хворих на туберкульоз людей визначали також рівень гемоглобіну, швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ) і лейкоцитарну формулу. Їх вивчали за загальноприйнятими методиками клінічного аналізу крові.
Для оцінки утворення активних форм кисню фагоцитами як показника імунореактивності організму використовували метод спонтанної та індукований зимозаном люмінолзалежної хемілюмінесценції (ЛЗХЛ).
Для більш глибокого дослідження також проведено визначення гемолітичної активності сироватки крові здійснювали за методикою, розробленою Антипенскою Л.В.
Здатність лімфоцитів селезінки щурів формувати Е-розітки з еритроцитами морської свинки і, відповідно, лімфоцитів морської свинки з еритроцитами щурів визначали за методом Jondal M.
Відносну кількість В-лімфоцитів визначали у реакції ЕАС-розіткоутворення.
Циркулюючі імунні комплекси визначали за методом Караулова А.В. за допомогою реакції преципітації з подальшим визначенням оптичної щільності на фотоколоримітрі.
У клінічній частині експерименту було обстежено понад 60 хворих на інфільтративний туберкульоз легенів у віці від 18 до 59 років, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у клініці НДІ легеневих захворювань за період з 2002 до 2005 рр. Серед обстежених переважали чоловіки – 45 (75%), жінок було 15 (25%). Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб, аналогічних за статтю і віком до дослідних груп.
У роботі використані результати обстеження традиційними клініко-рентгенологічними і лабораторними методами, а також проведене вивчення імунного статусу. При дослідженні клітинного, гуморального імунітету, а також параметрів неспецифічного захисту застосовувалися імунологічні методи, що використовували у доклінічних дослідженнях, а також додаткові. Так, субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD21+, CD25+, CD69+) визначали методом проточної цитофлюориметрії. Експресію поверхневих маркерів Т-лімфоцитів визначали за стандартною методикою імунофенотипування з використанням венозної периферичної крові, взятої з ліктьової вени та змішаної з гепарином (25 ОД/мл).
Мононуклеарні клітини виділяли методом центрифугування у градієнті фікол-верографін із щільністю 1,077 г/см3 за A.Boyum. Концентрацію і підрахунок мононуклеарних клітин визначали у камері Горяєва.
Активаційну і проліферативну здатність лімфоцитів оцінювали за адаптованою методикою Павлюк А.С.
Кількісне визначення імуноглобулінів сироватки крові проводили методом радіальної імунодифузії за Манчіні.
Фагоцитарну активність нейтрофілів визначали за нітросинім тетразолім (НСТ) тестом.
За методикою М.Л.Біленького проводили дослідження люмінолзалежної хемілюмінісценції (ЛЗХЛ) фагоцитуючих клітин.
Статистичну обробку отриманих у дослідженнях результатів здійснювали за допомогою параметричних методів аналізу за допомогою коефіцієнта Стьюдента, а також непараметричними методами аналізу з використанням програми Statistica (StatSoft, USA).
Результати досліджень та їх обговорення. Першим етапом наших досліджень було вивчення впливу монотерапії протитуберкульозними препаратами на імунітет експериментальних тварин – щурів і морських свинок.
Вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на показники периферичної крові щурів і морських свинок показало, що у всіх експериментальних групах спостерігалися зміни гематологічних показників (табл. 1, 2).
Таблиця 1
Показники периферичної крові при експериментальному туберкульозі у щурів (M ± m)
НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
На правах рукопису
Талат Хафіз Сулейман Абу-Кешк
удк:615.28:612.017:616.08
ПОРІВНЯЛЬНИЙ ФАРМАКОЛОГІЧНИЙ АНАЛІЗ ІМУНОТРОПНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ РЯДУ АНТИБАКТЕРІАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ, ЯКІ ЗАСТОСОВУЮТЬСЯ ПРИ ТУБЕРКУЛЬОЗІ ЛЕГЕНІВ
14.03.05 – фармакологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття вченого ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Науково-дослідному інституті легеневих захворювань, який розташований на базі Азербайджанського медичного університету (м. Баку) Міністерства охорони здоров’я Азербайджанської Республіки, і у Національному фармацевтичному університеті Міністерства охорони здоров’я України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор ГАНІЄВ Муса Мехті Огли Азербайджанський медичний університет, завідувач кафедри фармакології
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор ДИКИЙ Ігор Леонідович Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри мікробіології
доктор біологічних наук, професор КЛІМОВА Олена Михайлівна Інститут загальної та невідкладної хірургії АМН України завідувачка діагностичною лабораторією
Захист відбудеться “ 21 ” березня 2008 р. о ______ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).
Автореферат розісланий “___” _________________ 2008 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук, професор Л.М.Малоштан
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Останні роки характеризуються розвитком епідемії туберкульозу (ТБ) у ряді країн, різкою зміною перебігу і структури клінічних форм інфекції.
Основним методом лікування ТБ є хіміотерапія, спрямована на знищення мікобактерій туберкульозу (МБТ). Хіміопрепарати, що застосовуються на різних етапах лікування, мають характерні для кожного з них механізми дії. Більшість протитуберкульозних препаратів (ПТП) справляє різноманітну дію на мікробну клітину, чим обумовлюються їх бактеріостатичний і бактерицидний ефекти. Комбінована хіміотерапія ПТП дозволяє запобігти або істотно затримати виникнення лікарсько-стійких штамів МБТ. Проте не можна виключати стан імунітету організму, що відіграє істотну роль у маніфестації туберкульозу.
В останній час ефективність антибактеріальної та симптоматичної терапії туберкульозу значно зменшилася. Зросла частота дисемінованих процесів, почастішали випадки (72,3%) прогресуючого перебігу з гострим початком і масивним бактеріовиділенням, різко збільшилося (до 50%) число хворих з первинною лікарською стійкістю до МБТ. Стійкість до двох препаратів – ізоніазиду і рифампіцину – відзначена у 12% випадків, до трьох – більш ніж у 67,8% випадків.
Окрім резистентності мікобактерій туберкульозу до ПТП, мала ефективність хіміотерапії пов’язана із застосуванням нераціональних лікарських форм антибактеріальних засобів, які не можуть створити їх високу терапевтичну концентрацію на тривалий час в організмі хворого.
Важливим фактором, що впливає на ефективність терапії при туберкульозі, є наявність у хворих тих чи інших дефектів імунної системи. Для раціонального застосування ПТП необхідно враховувати їх дію на неспецифічну резистентність організму та імунітет. У зв’язку із цим великого значення набуває оцінка імуномодулюючого ефекту препаратів, які застосовуються для хіміотерапії туберкульозу при призначенні їх хворим з різними імунодефіцитними станами. Проте у літературі практично немає даних про взаємовплив ПТП і показників імунітету.
Туберкульоз є переважною причиною смертності від інфекційних агентів. Щорічно реєструється з 2 млн. смертельних випадків і 8 млн. нових випадків захворювань. 2 млрд. людей, тобто третя частина населення земної кулі, інфіковані мікобактеріями туберкульозу (МБТ). Число нових випадків впродовж десятиліття від 1990 до 2000 рр. оцінюється в 90 мільйонів. Наведені дані свідчать про те, що туберкульоз набув характеру пандемії.
У сучасних умовах стає усе більш очевидним, що якість життя хворих із туберкульозом є визначеним критерієм сукупної оцінки їх стану та ефективності проведеної терапії.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є фрагментом планової науково-дослідної тематики Науково-дослідного інституту легеневих захворювань (м. Баку), який розташований на базі Азербайджанського медичного університету МЗ Азербайджанської Республіки (м. Баку, Азербайджан).”Отримання і вивчення нових препаратів із різноманітних химічних груп синтетичного і природного походжння. (No. Державної реєстрації 0106АЗ00790) Здобувач був виконавцем відповідного фрагменту комплексних науково-дослідних тем.
Мета і завдання дослідження. Мета роботи – порівняльне вивчення впливу протитуберкульозних препаратів (рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, канаміцину та ізоніазиду) на стан імунологічної реактивності in vitro та in vivo з подальшим встановленням їх імунотропних властивостей для оптимізації лікування туберкульозу.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:
Вивчити імунологічні особливості впливу протитуберкульозних засобів при експериментальному туберкульозі легенів у морських свинок і щурів.
Визначити характер і ступінь впливу рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, ізоніазиду і канаміцину на показники клітинної і гуморальної ланок імунітету у тварин і людей.
Проаналізувати ефективність протитуберкульозних засобів за впливом їх на кінетичне вираження Т-клітин імунітету у хворих з інфільтративною формою туберкульозу легенів і результатами експерименту у тварин для з'ясування найбільш оптимального протитуберкульозного препарату з імуномодулюючим ефектом.
Вивчити вплив поєднаного застосування рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, ізоніазиду і канаміцину на показники імунітету при експериментальному туберкульозі.
Об’єкт дослідження. Імунотропна активність протитуберкульозних препаратів та їх комбінацій; показники, що характеризують імунну систему.
Предмет дослідження. Протитуберкульозні препарати – рифампіцин, рифабутин, офлоксацин, ізоніазид, канаміцин, а також їх комбінації.
Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані імунологічні, клінічні методи дослідження, а також методи математичної статистики.
Наукова новизна. Вперше в експерименті та клініці проведений порівняльний аналіз імунотропних властивостей протитуберкульозних препаратів – рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, канаміцину та ізоніазиду з метою оптимізації терапії хворих на туберкульоз, у яких спостерігається імунодефіцит. Проведено фенотипування клітин, що дозволило визначити не тільки кількість окремих субпопуляцій, але й вміст у них активованих клітин. Вивчено експресію активаційних молекул на поверхні Т-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій. Показано зростання експресії активаційних маркерів на фоні Т-клітинного дефіциту у хворих туберкульозом легенів. Проведений аналіз імунорегуляторних клітин у хворих з інфільтративною формою туберкульозу. Виявлен вплив ПТП на функціональну активність регуляторних клітин. Визначено зміни відносної кількості активованих маркерів(CD – кластер диференцировки) CD25+ і CD69+ до і після лікування протитуберкульозною терапією, яка включає рифампіцин, рифабутин, офлоксацин і канаміцин. Вивчені імуномодулюючі і супресивні властивості ПТП у період культивування in vitro.
Практичне значення роботи. Наукові дані вперше збагачені інформацією щодо порівняльного аналізу впливу ряду препаратів на імунітет хворих туберкульозом. Розроблено передумови для удосконалення схеми терапії туберкульозу легенів ізоніазидом, рифабутином, офлоксацином як препаратами з найменш вираженими імунодепресивними властивостями. Отримано нові дані, які дозволяють розширити уявлення про участь активованих Т-лімфоцитів у розвитку туберкульозного процесу і визначити нові підходи до корекції порушень функціонування імунної системи на рівні активації імунорегуляторних субпопуляцій. Вивчення Т-клітинної імунної відповіді на вплив протитуберкульозної терапії вказує на необхідність інтенсифікації імунокоригуючої тактики у терапії специфічної інфекції. Визначення піку експресії CD25 і CD69 при культивуванні in vitro до і після стимуляції фітогемаглютиніна (ФГА) і лікарським препаратом допомагає в уточненні рівня дефекту в імунній системі при туберкульозі легенів.Результати проведених досліджень впроваждено в науково-педагогічну діяльність кафедр фармакології,клінічної фармакології та фармакотерапії вищіх навгальних закладі ЙЙЙ та ЙV ривня акредитації.
Особистий внесок здобувача. Робота виконана на базах Науково-дослідного інституту легеневих захворювань, який розташований на базі Азербайджанського медичного університету (м. Баку), і Національного фармацевтичного університету. Разом з науковим керівником були визначені мета і завдання дослідження, розроблений план досліджень. Здобувачем самостійно проведений літературний пошук і науковий аналіз даних щодо теми дисертації, повністю виконані імунологічні тести з морськими свинками і щурами. Спільно з науковим керівником проведений аналіз імунного статусу людей, хворих на інфільтративну форму туберкульозу легенів, а також визначені мета і завдання дослідження, сформульовані висновки і практичні рекомендації. Самостійно проведено статистичне опрацювання результатів досліджень.
Апробація роботи відбулася 28 квітня 2005 р. на міжкафедральній конференції в Азербайджанському медичному університеті (м. Баку), а також на конференції молодих вчених у Національному фармацевтичному університеті (м. Харків, 2007 р.),1 інформаційні лист.
Публікації. Основні положення дисертації опубліковані у 5 статтях провідних фахових видань, 1 тезах та 1 інформаційному листку.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 155 сторінці комп'ютерного тексту і складається з вступу, 5 глав, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури, який включає 187 джерела, з яких 153 – іноземних авторів. Робота ілюстрована 39 таблицями і 45 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. У результаті аналізу літературних джерел щодо протитуберкульозних препаратів для подальших досліджень були обрані рифампіцин, рифабутин, офлоксацин, канаміцин та ізоніазид, а також дві комбінації: ізоніазид + офлоксацин + рифабутин та ізоніазид + канаміцин + рифампіцин.
Враховуючи те, що рівень імунореактивності організму має важливе значення при призначенні хіміотерапії при туберкульозі, нами були досліджені показники імунітету тварин і людей, хворих на туберкульоз легенів.
Експерименти з доклінічного вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на імунітет тварин проводили на щурах і морських свинках. У досліді використані 320 статевозрілих морських свинок обох статей масою 280-305 г і 360 щурів інбредної лінії (WAG Wistar albina glaxo) масою 180-200 г. Під час експерименту тварини знаходилися у стандартних умовах у віварію згідно прийнятих санітарно-гігієнічних умов. Робота з тваринами проводилася відповідно до принципів Європейської конвенції із захисту лабораторних тварин з дотриманням норм GLP.
В експерименті тварин поділяли на 6 груп. У кожній групі було по 60 щурів або 30 морських свинок. Проводили дослідження крові, селезінки та легенів дослідних тварин.
Оцінку стану імунної системи тварин і пацієнтів проводили за допомогою визначення фагоцитарної активності лейкоцитів, уніфікованих методом інкубації культури клітин з частками латексу, а також за тестом з нітросинім тетразолієвим, методиками визначення Е-, ЕАС-, авторозіткоутворюючих клітин при змішуванні крові морських свинок і щурів між собою, визначенням гемолітичної активності сироватки шляхом розведень.
Підрахунок клітин здійснювали загальноприйнятим методом з використанням гемоцитометру (камери Горяєва). Для підрахунку ядровміщуючих клітин застосовували 2% розчин оцтової кислоти.
Вивчення морфології клітин, мієлограм і лейкограм крові проводили у мазках, виготовлених із суспензій клітин і забарвлених азур-ІІ-еозином за Романовським – Гімзе. У кожному мазку вивчали 300 клітин.
У крові тварин і хворих на туберкульоз людей визначали також рівень гемоглобіну, швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ) і лейкоцитарну формулу. Їх вивчали за загальноприйнятими методиками клінічного аналізу крові.
Для оцінки утворення активних форм кисню фагоцитами як показника імунореактивності організму використовували метод спонтанної та індукований зимозаном люмінолзалежної хемілюмінесценції (ЛЗХЛ).
Для більш глибокого дослідження також проведено визначення гемолітичної активності сироватки крові здійснювали за методикою, розробленою Антипенскою Л.В.
Здатність лімфоцитів селезінки щурів формувати Е-розітки з еритроцитами морської свинки і, відповідно, лімфоцитів морської свинки з еритроцитами щурів визначали за методом Jondal M.
Відносну кількість В-лімфоцитів визначали у реакції ЕАС-розіткоутворення.
Циркулюючі імунні комплекси визначали за методом Караулова А.В. за допомогою реакції преципітації з подальшим визначенням оптичної щільності на фотоколоримітрі.
У клінічній частині експерименту було обстежено понад 60 хворих на інфільтративний туберкульоз легенів у віці від 18 до 59 років, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у клініці НДІ легеневих захворювань за період з 2002 до 2005 рр. Серед обстежених переважали чоловіки – 45 (75%), жінок було 15 (25%). Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб, аналогічних за статтю і віком до дослідних груп.
У роботі використані результати обстеження традиційними клініко-рентгенологічними і лабораторними методами, а також проведене вивчення імунного статусу. При дослідженні клітинного, гуморального імунітету, а також параметрів неспецифічного захисту застосовувалися імунологічні методи, що використовували у доклінічних дослідженнях, а також додаткові. Так, субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD21+, CD25+, CD69+) визначали методом проточної цитофлюориметрії. Експресію поверхневих маркерів Т-лімфоцитів визначали за стандартною методикою імунофенотипування з використанням венозної периферичної крові, взятої з ліктьової вени та змішаної з гепарином (25 ОД/мл).
Мононуклеарні клітини виділяли методом центрифугування у градієнті фікол-верографін із щільністю 1,077 г/см3 за A.Boyum. Концентрацію і підрахунок мононуклеарних клітин визначали у камері Горяєва.
Активаційну і проліферативну здатність лімфоцитів оцінювали за адаптованою методикою Павлюк А.С.
Кількісне визначення імуноглобулінів сироватки крові проводили методом радіальної імунодифузії за Манчіні.
Фагоцитарну активність нейтрофілів визначали за нітросинім тетразолім (НСТ) тестом.
За методикою М.Л.Біленького проводили дослідження люмінолзалежної хемілюмінісценції (ЛЗХЛ) фагоцитуючих клітин.
Статистичну обробку отриманих у дослідженнях результатів здійснювали за допомогою параметричних методів аналізу за допомогою коефіцієнта Стьюдента, а також непараметричними методами аналізу з використанням програми Statistica (StatSoft, USA).
Результати досліджень та їх обговорення. Першим етапом наших досліджень було вивчення впливу монотерапії протитуберкульозними препаратами на імунітет експериментальних тварин – щурів і морських свинок.
Вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на показники периферичної крові щурів і морських свинок показало, що у всіх експериментальних групах спостерігалися зміни гематологічних показників (табл. 1, 2).
Таблиця 1
Показники периферичної крові при експериментальному туберкульозі у щурів (M ± m)
| Групи | Гемоглобін, г/л | ШОЕ, мм/год. | Кількість лейкоцитів, ´ 109 |
| Контрольна група | 120,0 ± 3,2 | 1,0 ± 0,02 | 6,2 ± 0,05 |
| Після зараження | 129,1 ± 2,6 | 2,0 ± 0,03* | 7,7 ± 0,03* |
| З офлоксацином | 116,1 ± 2,0 | 1,0 ± 0,03 | 6,5 ± 0,04 |
| З канаміцином | 105,1 ± 3,0 | 1,5 ± 0,01 | 4,8 ± 0,05 |
| З рифампіцином | 106,1 ± 2,6 | 1,5 ± 0,02 | 5,6 ± 0,6 |
| З рифабутином | 118,0 ± 2,2 | 1,0 ± 0,01 | 6,4 ± 0,03 |
Таблиця 2
Показники периферичної крові у експериментальних морських свинок (M ± m)
| Групи | Гемоглобін, г/л | ШОЕ, мм/год. | Кількість лейкоцитів, ´ 109 |
| Контрольна група | 112,0 ± 5,3 | 3,0 ± 0,02 | 6,6 ± 0,5 |
| Після зараження | 123,0 ± 5,9* | 5,0 ± 0,06* | 8,4 ± 0,3* |
| З офлоксацином | 116,0 ± 5,0 | 3,0 ± 0,03 | 6,9 ± 0,6 |
| З канаміцином | 105,0 ± 4,2* | 4,5 ± 0,01* | 5,7 ± 0,8 |
| З рифампіцином | 118,0 ± 4,0 | 5,0 ± 0,03* | 5,9 ± 0,2 |
| З рифабутином | 115,0 ± 2,0 | 4,0 ± 0,02* | 6,8 ± 0,5 |
Рівень гемоглобіну в обох видів тварин після їх зараження туберкульозною паличкою підвищувався. Призначення канаміцину морським свинкам і щурам призводило до зниження гемоглобіну до рівня, що був нижче, а ніж у здорових тварин. Застосування рифампіцину призводило до зниження рівня гемоглобіну в щурів нижче норми, а у морських свинок показник повертався практично до контрольних значень. Терапія офлоксацином і рифабутином сприяла поверненню гемоглобіну до вихідного рівня(в обох видів тварин). Тобто призначення канаміцину і рифампіцину морським свинкам і щурам несприятливо впливало на кровотворення.
Показник ШОЕ у заражених щурів збільшувався в 2 рази, а в морських свинок – у 1,7 рази. Призначення офлоксацину повертало цей показник в обох видів тварин до рівня здорових. Те ж саме спостерігали після застосування рифабутину в щурів, а у морських свинок ШОЕ була на 33,3% вищою.
Після застосування канаміцину і рифампіцину ШОЕ, у порівнянні з групою контролю, збільшувалася у 1,5 рази у щурів. У морських свинок призначення канаміцину і рифампіцину мало впливало на показники ШОЕ у порівнянні з нелікованими тваринами.
Вивчення впливу лікування антибіотиками на загальну кількість лейкоцитів у щурів і морських свинок мало тенденції, аналогічні іншим показникам периферичної крові. Після зараження показник збільшувався – відповідно, на 24,2% і 27,3% для щурів і морських свинок.
Після лікування антибіотиками рівень лейкоцитів знижувався, що свідчить про пригнічення запального процесу. Призначення офлоксацину і рифабутину сприяло приведенню кількості лейкоцитів практично до рівня здорових тварин (відповідно, 104,5% і 103,0% до контролю). Кількість лейкоцитів у групах, пролікованих канаміцином і рифампіцином, виявилася нижчою за контроль, відповідно, на 13,6% і 10,6%.
У лейкоцитарній формулі після зараження тварин спостерігали збільшення кількості еозинофілів, моноцитів і лімфоцитів, а рівень палочкоядерних і сегментоядерних нейтрофілів знижувався або залишався на рівні заражених тварин.
Таким чином, призначення для лікування рифабутину та офлоксацину сприяло поверненню більшості показників периферичної крові до нормального рівня, у той час як канаміцин і рифампіцин сприяли пригніченню клітинного імунітету.
Вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на фагоцитарну активність нейтрофілів показало, що мінімальні зміни показників фагоцитозу в щурів відбулися в експериментах із застосуванням офлоксацину (табл. 2). Розходження з контрольною групою склали, відповідно, для фагоцитарного індексу 9,5% і 9,1% (через 30 і 60 хвилин), а фагоцитарного числа – 14,3% і 11,1%. Дещо більше відрізнялися результати, отримані при застосуванні рифабутину. Фагоцитарна активність нейтрофілів у щурів, яким були призначені канаміцин і рифампіцин, була приблизно схожою: фагоцитарний індекс знижувався при застосуванні канаміцину в 1,6 разів, а при застосуванні рифампіцину – у 1,5 рази. При цьому впродовж години цей показник не змінювався. Фагоцитарне число при цьому через 30 хвилин зменшилося у 1,4 рази, а через 1 годину в групі тварин, де застосовувався канаміцин, воно знижувалося у 1,5 рази, а у групі, лікованій рифампіцином, – у 1,3 рази.
Таким чином, найкраще фагоцитарна активність зберігалася у групах щурів, що приймали офлоксацин, і дещо гірше у тих тварин, яким як лікування був призначений рифабутин.
Вивчення фагоцитарної активності нейтрофілів показало, що після зараження морських свинок фагоцитарний індекс і фагоцитарне число знижувалися. Лікування антибіотиками сприяло збільшенню зазначених параметрів. Мінімальний пригнічюючий вплив на імунітет морських свинок справляли рифабутин і офлоксацин.
НСТ-тест, що відбиває ступінь активації кисеньзалежних механізмів бактерицидної активності фагоцитуючих клітин, також проводили на щурах і морських свинках. У групі заражених і не лікованих тварин оптична щільність знижувалася у порівнянні з інтактною групою. Аналогічні дані були отримані для груп морських свинок і щурів, яким вводили рифампіцин, що свідчить про пригнічюючий вплив його на імунітет. У той же час результати практично на рівні контролю були отримані у тварин, яких лікували офлоксацином і рифабутином. Проте в експериментах на морських свинках мінімальний вплив на імунітет справляв офлоксацин і дещо більше рифабутин, що свідчить про імунотропну дію цих препаратів.
Оцінка утворення активних форм кисню фагоцитами методом спонтанної та індукованої зимозаном люмінолзалежної хемілюмінесценції (ЛЗХЛ) показала, що після зараження тварин показник спонтанної ЛЗХЛ падав на 35% і 33,3%, відповідно, у щурів і морських свинок, а ЛЗХЛ, індукована зимозаном, зменшувалася на 11,8% і 8,0% відповідно. Після введення дослідних протитуберкульозних засобів обидва показники ЛЗХЛ збільшувалися в обох видів тварин. В експериментальних групах тварин, яким вводили рифабутин і офлоксацин, досліджуваний показник практично не відрізнявся від аналогічного в групі інтактних тварин або наближався до них.
Дослідження рівню циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові щурів показало, що у всіх експериментальних групах, крім щурів, яким вводили канаміцин, спостерігали підвищення цього показника. У групі тварин “після зараження” цей показник підвищувався найбільше у порівнянні з іншими групами – на 33,3%. Дещо менше рівень ЦІК підвищувався після введення офлоксацину і рифампіцину. Результат, близький до інтактних щурів, отриманий у групі, яку лікували рифабутином. А ось після введення рифампіцину досліджуваний параметр знижувався, на відміну від усіх інших препаратів на 16,7%. Таким чином, в експерименті з вивченням ЦІК результати на рівні контролю спостерігали після введення рифабутину, що свідчить про його позитивний вплив на імунні процеси в організмі тварин.
У серії аналогічних експериментів, проведених на морських свинках, дані трохи відрізнялися від таких у щурів. Після зараження рівень ЦІК збільшувався в 5,25 рази. Після лікування він знижувався тільки у групі морських свинок, які приймали офлоксацин. Лікування іншими препаратами не справляло істотного впливу на ЦІК. Тобто імунотропна активність була виявлена в офлоксацину.
Рівень гетерофільних гемолізинів, який дає можливість судити про наявність інфекційного процесу, також вивчали на морських свинках і щурах. Встановлено, що після зараження тварин рівень гетерофільних гемолізинів підвищувався на 45,5% у щурів і на 51,8% у морських свинок. Після введення антибіотиків показник в основному знижувався. При цьому в групах тварин, які одержували рифабутин і офлоксацин, параметр прагнув до контрольного рівня, а у тих, хто одержував канаміцин і рифампіцин, – до рівня після зараження. Це свідчить про мінімальний пригнічюючий вплив на імунітет.
Встановлено також, що у групах тварин, що піддалися зараженню мікобактеріями туберкульозу і не одержували лікування, рівень Т-лімфоцитів знижувався на 36,7% і 33,4%, відповідно для щурів і морських свинок. Антибактеріальна терапія сприяла збільшенню цього показника. Найкращі результати щодо збереження імунної активності організму були отримані у тварин, лікованих рифабутином, і трохи гірше – при введенні офлоксацину.
Визначення рівня В-лімфоцитів показало, що у всіх дослідних групах тварин, у порівнянні з контрольною, рівень В-лімфоцитів знижувався. Найбільш значуще зменшення рівня розеткоутворюючих клітин (РУК) у ЕАС-реакції у щурів було після введення рифампіцину –19,0%. Після лікування рифабутином і канаміцином результати мало відрізнялися від контрольних. Отже, у даному експерименті мінімальний вплив на рівень В-лімфоцитів у щурів мали канаміцин і рифабутин. Дослідження, проведені в експериментах на морських свинках, підтвердили дані, отримані у дослідах на щурах.
Визначення рівня лімфоцитів за реакцією авторозеткоутворення (ауто-РУК) показало, що у щурів рівень Ауто-РУК був однаковим у чотирьох групах тварин (заражених і нелікованих; а також після введення офлоксацину, канаміцину, рифампіцину). У порівнянні з інтактною групою він був менше на 22,2%. Відмінність склав рифабутин: його рівень Ауто-РУК склав 8%, тобто на 11,1% менше, а ніж у контролі. Тобто мінімальний вплив на клітинний імунітет у щурів спостерігався під впливом рифабутину. В другій серії дослідів, проведених на морських свинках, ми одержали результати, аналогічні попереднім.
На наступному етапі досліджень був вивчений вплив комбінацій протитуберкульозних препаратів на імунітет морських свинок.
Вивчення показників периферичної крові у морських свинок після комбінованої протитуберкульозної терапії показало, що після застосування комбінації ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином показники периферичної крові були на рівні контрольних або наближалися до них. Комбінація ізоніазиду з канаміцином і рифампіцином пригнічувала кровотворення.
Вивчення показників фагоцитарної активності нейтрофілів у хворих тваринпісля комбінованої антибіотикотерапії показало, що показники фагоцитарної активності нейтрофілів були найбільш наближеними до контрольної групи після застосування комбінації ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином.
При вивченні фагоцитуючої активності клітин у морських свинок за допомогою НСТ-тесту встановлено, що імунотропна дія була виявлена при використанні комбінації ізоніазиду з рифабутином і офлоксацином.
Дослідження ЛЗХЛ показало, що застосування ізоніазиду разом з офлоксацином і рифабутином сприяло збереженню імунітету у тварин. Встановлено також, що найбільш сприятливий вплив на рівень циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові морських свинок мала комбінація ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином.
Визначення рівня гетерофільних гемолізинів свідчить про те, що імунотропну дію має комбінація ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином.
При вивченні впливу поєднаного застосування протитуберкульозних засобів на рівень Т-лімфоцитів мінімальний негативний вплив на імунітет справляла та сама комбінація антибіотиків.
Встановлено також, що поєднання ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином в експерименті виявила імунотропну дію при визначенні рівня В-лімфоцитів і в реакції авторозеткоутворення.
Таким чином, в експериментах на тваринах виявлена найбільш сприятлива комбінація препаратів для раціональної антибіотико терапії туберкульозу. Це поєднання ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином.
Заключним етапом наших досліджень було вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на імунітет людей.
У всіх пацієнтів відзначалися зміни гематологічних показників: лейкоцитоз, палочкоядерний зсув нейтрофілів, лімфопенія (табл. 3). Рівномірне підвищення ШОЕ і збільшення палочкоядерних нейтрофілів у крові. Вивчення показників імунітету в хворих на ТБ легенів виявило істотні зміни у всіх ланках імунного статусу. При усіх формах ТБ легенів поряд з достовірним наростанням лейкоцитозу спостерігалося зниження відносного числа лімфоцитів. Вміст CD3-клітин був знижений на 65,8%. У хворих виражене пригнічення функціональної активності Т-клітин встановлене в 73,1% випадків, зниження показників специфічної клітинної відповіді – у 61,8% пацієнтів. Одночасно відзначене підвищення CD25+- маркерів і особливо показників гуморального імунітету. Число CD19+ і CD21+ було збільшено у 70,7% хворих. При оцінці фагоцитарної ланки виявлялося зниження середніх величин фагоцитарного індексу, спонтанної й індукованої ЛЗХЛ, індексу стимуляції.
Таблиця 3
Лейкоцитарна формула крові хворих на туберкульоз людей, що брали участь в експерименті
| Групи | Еозинофіли | Палочкоядерні нейтрофилі | Сегментоядерні нейтрофіли | Моноцити | Лімфоцити |
| Контрольна група | 3,0 ± 0,01 | 5,1 ± 0,06 | 60,1 ± 5,3 | 5,0 ± 0,06 | 25,2 ± 3,8 |
| До лікування | 6,0 ± 0,02* | 3,0 ± 0,02* | 42,0 ± 4,0* | 8,0 ± 0,02* | 24,5 ± 4,0 |
| Після лікування офлоксацином | 4,0 ± 0,01** | 4,0 ± 0,03 | 57,2 ± 4,4** | 6,0 ± 0,04** | 25,0 ± 3,5 |
| Після лікування канаміцином | 6,0 ± 0,03* | 3,0 ± 0,03* | 19,0 ± 2,8*** | 8,1 ± 0,05* | 24,6 ± 6,0 |
| Після лікування рифампіцином | 6,1 ± 0,01* | 3,0 ± 0,04* | 43,0 ± 3,9* | 7,0 ± 0,04* | 24,7 ± 2,9 |
| Після лікування рифабутином | 5,0 ± 0,02* | 4,0 ± 0,02* | 45,0 ± 5,4* | 6,0 ± 0,03** | 24,9 ± 1,7 |
Таким чином, у хворих усіх груп виявлене глибоке порушення вихідного імунного статусу, що супроводжується чітким зменшенням у крові CD3+, CD4+, CD8+, збільшенням CD16+, CD19+, CD21+, CD25+, зниженням фагоцитарного індексу, спонтанної й індукованої ЛХЗЛ, індексу стимуляції. Одночасно з цим збільшувалася кількість ЦІК.
Для визначення впливу рифампіцину, рифабутину, офлоксацину і канаміцину на клітинну системну імунну відповідь досліджували цільну кров 60 хворих на ТБ легенів до початку протитуберкульозної терапії.
У хворих туберкульозом при стимуляції тільки з рифампіцином при зіставленні зі зразками групи порівняння знижувався вміст CD3+, CD16+ і CD25+ відповідно на 5.4, 4.0 і 6,5%, при цьому рівень CD4+ і CD8+-клітин практично не відрізнявся від відповідних показників групи порівняння. У дослідній групі, де використовували рифабутин, відзначається тенденція до підвищення CD4+ (2,5%) і CD8+ (2,6%), рівномірне зниження CD16+ (4,0%) і помітне зниження активованих клітин – 11,3%. У хворих, лікованих офлоксацином, не виявлені розходження із вмістом CD3, CD8 і CD25. Цей препарат також як і рифабутин, сприяв зниженню концентрації CD16+ (6,3%) і зростанню CD4+ (3,3%). При стимуляції лімфоцитів канаміцином спостерігалося зниження CD3+ на 3,6%, CD16+ - на 13,1%, CD25 - на 4,0% і CD4+-на 2,1%. Канаміцин впливав тільки на рівні субпопуляцій, і його імунотропна дія носила імунодепресивний характер. У хворих, який був призначений рифабутин, збільшення CD3+ носило виражений характер. У хворих з інфільтративною формою ефект офлоксацину помітно відбивався на концентрації CD4. Аналогічно цьому відзначалося підвищення CD8+ у пробах у хворих з інфільтративним туберкульозом, які вживали офлоксацин.
На підставі отриманих результатів і наявних літературних даних ми не виключаємо вплив ПТП на апоптоз при ТБ легенів. Можна припустити, що, ефективно впливаючи на МБТ, знищуючи інфіковані макрофаги, рифампіцин і рифабутин могли б сприяти посиленню імунної відповіді. Однак, зрушення в імунній системі, зокрема низькі рівні CD3+, CD4+ і CD8+ і поєднаний з ними високий вміст CD25+, очевидно, є результатом посиленого апоптозу і мають визначену причетність до порушень імунної відповіді (табл. 4).
Таблиця 4
Вміст рецепторів активації в обстежених груп
| Показники | Контрольна група | Групи хворих з інфільтративним ТБ (n = 61) |
| CD3+25+ | 2,3 ± 0,06 | 6,0 ± 0,04* |
| CD3+69+ | 2,4 ±0,04 | 5,3 ± 0,09* |
| CD4+25+ | 3,0 ±0,02 | 7,0 ± 0,09* |
| CD4+69+ | 3,4 ± 0,03 | 6,7 ± 0,06* |
| CD8+25+ | 1,1± 0,05 | 1,9 ± 0,02 |
| CD8+69+ | 3,0 ± 0,05 | 4,0 ± 0,06 |
| CD4+25+/CD8+25+ | 2,7 ± 0,08 | 3,7 ± 0,05 |
| CD4+69+/CD8+69+ | 1,3 ± 0,04 | 1,6 ± 0,02 |
У пацієнтів обстежених груп у периферичній крові виявлялися Т-лімфоцити з фенотипом CD3+CD25+, CD4+CD25+, CD8+CD25+, CD3+CD69+, CD4+CD69+ і CD8+CD69+. У хворих ТБ легень дані показники в периферичній крові значно зростають у середньому в 2,5 рази. Відповідно змінювалися співвідношення CD4+CD25+/CD8+CD25+ і CD4+CD69+/CD8+CD69+. У хворих на ТБ у порівнянні з контролем ці показники вірогідно зростають.
В осіб контрольної групи в культурі лімфоцитів стимульованих ФГА in vitro прогресивно зростало кількість клітин, які несуть одночасно диференційовані CD4+ або CD8+ і маркер активації CD25+. У популяції CD3+-лімфоцитів виявлялося виражене зростання вмісту активованих клітин. Пік співвідношення CD4+CD25+/CD8+CD25+ спостерігався до 4 годин культивування, проте через 24 години зменшувався.
При інфільтративній формі до лікування вміст CD3+, CD4+ і CD8+ Т-клітин, експресуючих CD25+, був у середньому в 1-1,5 рази вище, а ніж у крові осіб контрольної групи. Концентрація активаційних маркерів CD3+CD69+, CD4+CD69+, CD8+CD69+ у хворих ТБ перевищувала контрольні показники в 1,3 рази.
Аналіз отриманих результатів культивування показав зміну вмісту CD8+CD69+-маркерів у залежності від ваги туберкульозного процесу, а також від тривалості культивування.
З метою оцінки дії кожного препарату окремо на активаційні маркери ми провели культивування лімфоцитів із включенням у зразки розчинів ПТП: рифампіцину, рифабутину, офлоксацину і канаміцину. Порівняння даних показало, що рифампіцин не впливав на активність CD4+CD25+-маркерів і пригнічував активність CD3+CD25+ і CD8+CD25+-клітин в усі години культивування, а також CD3+CD69+-маркерів до 96 години, однак потім препарат підсилював їх активність. Виявлено незначну стимуляцію рифампіцином CD4+CD69+-Т-клітин. Ми спостерігали збільшення кількості CD8+CD69+-маркерів через 24 і 96 годин культивування, але підйом до 120 годин перемінився зниженням даної субпопуляції. У зразках з рифабутином зареєстроване посилення активності CD3+CD25+, CD3+CD69+ і CD8+CD25+-клітин. Пік активності CD3+CD25+ і CD8+CD25+-маркерів відзначався через 120 годин культивування, і був вищим за аналогічні показники без стимуляції ПТП відповідно на 12,9 і 7,4%. Максимальна активність CD3+CD69+-клітин, зареєстрована до 96 годин, перевищувала порівняльні значення на 3,0%. Менш виражена стимуляція активності імунної відповіді відзначалася серед CD4+CD69+-маркера. Пік активності спостерігався між 8-24 годинами (20,0% і 28,8% проти порівняльних 15,4% і 27,7%). В інші години рівень не відрізнявся від показників у зразках, що не містять препарат. Препарат не впливав на активність CD8+CD69+- і пригнічував функціональну активність CD4+CD25+-клітин. На відміну від рифабутину, офлоксацин позитивно впливав на рівень CD3+CD25+, CD3+CD69+, CD4+CD25+ і CD4+CD69+-клітин, різниця між порівняльними даними склала відповідно 16,1%, 15,1%, 10,6% і 7,6%. При цьому концентрація CD8+-фенотипу, експресуючого CD25+ і CD69+-маркери під дією ФГА й офлоксацину, тільки до 24 годин підвищувалася відповідно на 29,6 і 34,0%, а потім поступово знижувалася і після 120 годин культивування була нижче вихідних величин. Вивчення функціональної активності CD3+, CD4+ і CD8+-лімфоцитів, експресуючих активаційні маркери, показало пригнічення їх активності під дією канаміцину. Зростання активності відзначалося тільки до 24 годин культивування CD4+CD25+ і CD8+CD25+ відповідно на 13,4% і 14,5% при порівнянні зі зразками без препарату. Отже, найбільш виражену дію на експресію активаційних маркерів справляв офлоксацин і найменшу – канаміцин.
У процесі культивування з рифампіцином і офлоксацином відбувалося збільшення кількості CD8+-клітин, експресуючих CD69+-маркер, особливо між 4 і 96 годинами, тоді як рифабутин у процесі культивування сприяв експресії CD8+-фенотипом крім CD69+ і CD25+-маркера. При порівнянні співвідношень між CD4+CD25+/CD8+CD25+ у зразках лімфоцитів без препаратів і з рифампіцином, офлоксацином і канаміцином виявлене зростання, у той час як з рифабутином відзначається зменшення цього показника. Порівняльний аналіз співвідношення CD4+CD69+/CD8+CD69+ показав його збільшення у всіх зразках. Очевидно, порушення імунної відповіді в хворих ТБ пов’язано не тільки зі зміною кількості клітин, але і з порушенням процесів їх активації. На підставі отриманих результатів можна констатувати у хворих на ТБ зниження кількісного вмісту Т-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій різних фенотипів не тільки в крові, але й у процесі індукованої активації in vitro.
Таким чином, отримані результати експресії активаційних маркерів на поверхні CD3+, CD4+ і CD8+-лімфоцитів під дією рифампіцину, рифабутину, офлоксацину і канаміцину розширюють уявлення про активовані Т-клітини у розвитку туберкульозного процесу і зіграють позитивну роль у визначенні нових підходів до корекції порушень імунної системи на рівні активації імунорегуляторних субпопуляций.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі проведено порівняльне вивчення впливу протитуберкульозних препаратів (рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, канаміцину та ізоніазиду) та їх комбінацій на стан імунологічної реактивності організму in vitro та in vivo, проаналізований вплив вище названих препаратів та їх комбінацій на показники імунітету, встановлені їх імунотропні властивості з метою оптимізації хіміотерапії туберкульозу. Дослідження проводили на до клінічному рівні (на щурах та морських свинках), а такою у клініці серед людей, хворих на туберкульоз легенів.
Оцінка показників периферичної крові (рівня гемоглобіну, ШОЕ, лейкоцитарної формули) у щурів і морських свинок показала, що рифабутин і офлоксацин сприяють поверненню їх до початкового рівня у експериментальних тварин: підвищені у заражених туберкульозом тварин рівні гемоглобіну, ШОЕ та лейкоцитів знижувалися.
В експерименті при модельному туберкульозі у морських свинок і щурів встановлено, що офлоксацин і рифабутин мають більш виражені імунотропні властивості, ніж рифампицин і канаміцин. Аналогічна закономірність виявлялася і у впливі даних препаратів на показники імунітету у людини.
Показники фагоцитарної активності нейтрофілів, рівень циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові щурів і морських свинок, рівень Т- і В-лімфоцитів після лікування канаміцином і рифампіцином знаходилися на рівні заражених тварин. Показники гуморального і клітинного імунітету, отримані після застосування рифабутину і офлоксацину, були аналогічними або наближалися до норми, що свідчить про позитивний вплив даних препаратів на імунні механізми експериментальних тварин і людей.
В периферичній крові хворих на туберкульоз легенів виявлено глибоке порушення початкового імунного статусу з чітким вторинним імунодефіцитом, що супроводжувався зменшенням в крові CD3+ у 65,8% хворих, CD4+ у 73,1% і CD8+ у 61,8%, збільшенням CD16+, CD19+ і CD21+ у 70,7%, CD25+, пониженням фагоцитарного індексу і фагоцитарного числа, спонтанної та індукованої ЛХЗЛ.
У хворих на туберкульоз легенів стимуляція рифампіцином знижувала вміст CD3 на 5,4%, CD16 - на 4,0% і CD25 - на 6,5%; рифабутином підвищує CD4 (2,5%) і CD8 (2,6%), знижує CD16 (4,0%) і CD25 (11,3%); офлоксацином знижує концентрацію CD16 (6,3%) і збільшує CD4 (3,3%); канаміцином знижує CD3 на 3,6%, CD16-на 13,1%, CD25-на 4,0% і CD4- на 2,1%.
Ріфампіцин не впливав на активність CD4+CD25+-маркерів і пригнічував активність CD3+CD25+ і CD8+CD25+-клітин у весь час культивування, а також CD3+CD69+-маркерів до 96 годин in vitro. Ріфабутін посилював активність CD3+CD25+, CD3+CD69+ і CD8+CD25+-клітин і пригнічував функціональну активність CD4+CD25+-клітин. Офлоксацин позитивно впливав на рівень CD3+CD25+, CD3+CD69+, CD4+CD25+ і CD4+CD69+-клітин. Канаміцин пригнічував функціональну активність CD3+, CD4+ і CD8+-лімфоцитів, експресуючих активаційні маркери. Найбільш виражену дію на експресію активаційних маркерів мав офлоксацин, а якнайменш виражену – канаміцин.
При комбінованій терапії експериментальних тварин, заражених туберкульозом, введення в схеми лікування рифабутину, офлоксацину та ізоніазиду сприяло прояву імунотропних властивостей. Серед вивчених комбінацій найкращий імунозбережуючий ефект виявило поєднання ізоніазиду з офлоксацином та рифабутином.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛИКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Абу-Кешк Талат Хафиз. Современный взгляд на химиотерапию туберкулеза и иммунитет // Azerbaijan medical journal. – 2003. – № 1. – С. 124-127.
2. Абу-Кешк Талат Хафиз. Т-клеточная защита у больных туберкулезом легких при воздействии рифампицина, рифабутина, офлоксацина и канамицина // Здоровье. – 2003. – № 9. – С. 11-14.
3. Абу-Кешк Талат Хафиз. Уровень маркеров активации у больных туберкулезом легких на фоне противотуберкулезной терапии // Azerbaijan medical journal. – 2004. – № 1. – С. 69-71.
4. Абу-Кешк Талат Хафиз. Динамика маркеров активации in vitro у больных туберкулезом легких // Фармацевтический бюлетень. – 2004. – № 1. – С. 34-36.
5. Абу-Кешк Талат Хафиз. Показатели иммунной системы больных туберкулезом легких на фоне противотуберкулезной терапии // Здоровье. – 2004. – № 6. – С. 26-29.
6. Абу-Кешк Талат Хафиз, Деримедведь Л.В. Действие рифампицина, рифабутина, офлоксацина и канамицина на экспрессию Т-клеток // Актуальні питання створення нових лікарських засобів. Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених. 17-18 травня 2007 р., м. Харків. – Харків: Вид-во НФаУ, 2007. – С. 215.
7. Абу-Кешк Талат Хафиз. Рациональное применение комбинации противотуберкулезных препаратов. Информационный листок. –№ 19. – 2007. – Отдел оперативной полиграфии ЗАТ “ХЦНТЕИ”. – Харьков, 2007. – 4 с.
АНОТАЦІЯ
Абу-Кешк Талат Хафіз. Порівняльний фармакологічний аналіз імунотропних властивостей ряду антибактеріальних препаратів, які застосовуються при туберкульозі легенів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. Національний фармацевтичний університет. – Харків, 2008.
Дисертація присвячена порівняльному аналізу впливу протитуберкульозних препаратів (канаміцину, рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, ізоніазиду) на імунну систему експериментальних тварин (морських свинок, щурів) та людей з інфільтративною формою туберкульозу.
Проведено ряд імунологічних тестів: визначення фагоцитарної активності нейтрофілів, НСТ-тест, визначення рівнів ЛЗХЛ, В- і Т-лімфоцитів, СD-маркерів. Показано, що у експериментальних тварин найменший пригнічуючий вплив на імунітет справляли рифабутин і офлоксацин. Клінічні дослідження, проведені на людях, хворих на інфільтративну форму туберкульозу, підтвердили результати, отримані в дослідах на тваринах.
Експерименти, проведені на морських свинках, яким вводили комбінації вище вказаних препаратів, показали, що імунотропна активність спостерігалася при застосуванні ізоніазиду з офлоксацином и рифабутином. Таким чином, включення офлоксацину і рифабутину до схеми лікування туберкульозу легенів сприяє збереженню імунних властивостей організму людей и тварин.
Ключові слова: туберкульоз легенів, канаміцин, рифампіцин, рифабутин, офлоксацин, ізоніазид, імунотропна дія.
АННОТАЦИЯ
Абу-Кешк Талат Хафиз. Сравнительный фармакологический анализ иммунотропных свойств ряда антибактериальных препаратов, применяющихся при туберкулезе легких. - Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 14.03.05 – фармакология. Национальный фармацевтический университет. - Харьков, 2008.
Диссертация посвящена сравнительному анализу влияния противотуберкулезных препаратов (канамицина, рифампицина, рифабутина, офлоксацина, изониазида) на иммунную систему экспериментальных животных (морских свинок, крыс) и людей с инфильтративной формой туберкулеза.
Проведен ряд иммунологических тестов: определение фагоцитарной активности нейтрофилов, НСТ-тест, определение уровней розеткообразования, ЛЗХЛ, В- и Т-лимфоцитов, СD-маркеров. Изучено также влияние канамицина, рифампицина, рифабутина и офлоксацина на показатели периферической крови у животных и людей.
Показано, что у экспериментальных животных и людей, применение в качестве монотерапии канамицина и рифампицина приводило к угнетению показателей иммунитета. В то же время минимальное подавляющее влияние на иммунитет оказывали рифабутин и офлоксацин.
Оценка показателей периферической крови (уровня гемоглобина, ШОЕ, лейкоцитарной формулы) у крыс и морских свинок показала, что рифабутин и офлоксацин способствуют возвращению их у экспериментальных животных к исходному уровню: повышенные у зараженных туберкулезом животных уровни гемоглобина, СОЭ и лейкоцитов снижались.
Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов показало, что после заражения морских свинок и крыс фагоцитарный индекс и фагоцитарное число снижались. Лечение антибиотиками способствовало увеличению изучаемых параметров. Минимальное угнетающее влияние на иммунитет животных оказывали рифабутин и офлоксацин.
В НСТ-тесте, проведенном на крысах и морских свинках, в группе зараженных и нелеченых животных оптическая плотность снижалась в сравнении с интактной группой. Аналогичные данные были получены для групп морских свинок и крыс, которым вводили рифампицин, что свидетельствует о угнетающем его влиянии на иммунитет. В то же время результаты практически на уровне контроля были получены у животных, которых лечили офлоксацином и рифабутином.
Оценка образования активных форм кислорода фагоцитами методом спонтанной и индукцируемой зимозаном люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) показала, что в экспериментальных группах животных, которым вводили рифабутин и офлоксацин, исследуемый показатель практически не отличался от аналогичного в группе интактных животных или приближался к ним.
Аналогичные данные были получены при изучении циркулирующих иммунных комплексов, уровня гетерофильных гемолизинов, а также в реакциях розеткообразования.
У больных туберкулезом легких стимуляция рифампицином снижает содержание CD3 на 5,4, CD16 – на 4,0% и CD25 – на 6,5%; рифабутином повышает CD4 (2,5%) и CD8 (2,6%), снижает CD16 (4,0%) и CD25 (11,3%); офлоксацином снижает концентрацию CD16 (6,3%) и увеличивает CD4 (3,3%); канамицином снижает CD3 на 3,6%, CD16-на 13,1%, CD25-на 4,0% и CD4- на 2,1%.
Рифампицин не влиял на активность CD4+CD25+-маркеров и угнетал активность CD3+CD25+ и CD8+CD25+-клеток в течение всего времени культивирования, а также CD3+CD69+-маркеров до 96 часов in vitro. Рифабутин усиливал активность CD3+CD25+, CD3+CD69+ и CD8+CD25+-клеток и угтенал функциональную активность CD4+CD25+-клеток. Офлоксацин положительно влиял на уровень CD3+CD25+, CD3+CD69+, CD4+CD25+ и CD4+CD69+-клеток. Канамицин угнетал функциональную активность CD3+, CD4+ і CD8+-лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры. Найболее выраженное действие на экспрессию активационных маркеров имел офлоксацин, а наименее выраженную – канамицин.
Эксперименты, проведенные на морских свинках, которым вводили комбинации выше указанных препаратов, показали, что иммунотропная активность наблюдалась при применении изониазида с офлоксацином и рифабутином. Таким образом, включение офлоксацина и рифабутина в схемы лечения туберкулеза легких способствует сохранению иммунных свойств организма людей и животных.
Клинические исследования, проведенные на больных инфильтративной формой туберкулеза, подтвердили результаты, полученные в опытах на животных: иммунотропное действие было выявлено у тех пациентов, которые принимали офлоксацин или рифабутин.
Ключевые слова: туберкулез легких, канамицин, рифампицин, рифабутин, офлоксацин, изониазид, иммунотропное действие.
ANNOTATION
Abu-Keshk Talat Hafiz. Comparative pharmacological analysis of immunotropic properties of row of the antibacterial divparations used by pulmonary tuberculosis. – Manuscript.
The thesis on receipt of scientific degree of candidate of pharmaceutical sciences on speciality 14.03.05 – pharmacology. National pharmaceutical university. - Kharkov, 2007.
Dissertation is devoted to the comparative analysis of influencing of antituberculous divparations (kanamycin, rifampicin, rifabutin, ofloxacin, izoniazid) on the immune system of experimental animals (guinea-pigs, rats) and people with the infiltrative pulmonary tuberculosis.
The row of immunological tests was carry out: determination of fagocitic activity of neutrofil, NSТ-test, determination of the LZHL, V- and T-limfocyts levels, СD-markers. We fixed, that less supdivss immunity of animals rifabutin and ofloxacin. The clinical researches conducted in people with infiltrative pulmonary tuberculosis, confirmed results with animals.
Also was carry out experiments on guinea-pigs. Them divscribed combinations of divparations. The application of izoniazid with ofloxacin and rifabutin have immunotropic activity. Thus, the inclusion of ofloxacin and rifabutin in the charts of medical treatment of pulmonary tuberculosis was save of immune properties of human and animal organism.
Keywords: pulmonary tuberculosis, kanamycin, rifampicin, rifabutin, ofloxacin, izoniazid, immunotropic action.
В осіб контрольної групи в культурі лімфоцитів стимульованих ФГА in vitro прогресивно зростало кількість клітин, які несуть одночасно диференційовані CD4+ або CD8+ і маркер активації CD25+. У популяції CD3+-лімфоцитів виявлялося виражене зростання вмісту активованих клітин. Пік співвідношення CD4+CD25+/CD8+CD25+ спостерігався до 4 годин культивування, проте через 24 години зменшувався.
При інфільтративній формі до лікування вміст CD3+, CD4+ і CD8+ Т-клітин, експресуючих CD25+, був у середньому в 1-1,5 рази вище, а ніж у крові осіб контрольної групи. Концентрація активаційних маркерів CD3+CD69+, CD4+CD69+, CD8+CD69+ у хворих ТБ перевищувала контрольні показники в 1,3 рази.
Аналіз отриманих результатів культивування показав зміну вмісту CD8+CD69+-маркерів у залежності від ваги туберкульозного процесу, а також від тривалості культивування.
З метою оцінки дії кожного препарату окремо на активаційні маркери ми провели культивування лімфоцитів із включенням у зразки розчинів ПТП: рифампіцину, рифабутину, офлоксацину і канаміцину. Порівняння даних показало, що рифампіцин не впливав на активність CD4+CD25+-маркерів і пригнічував активність CD3+CD25+ і CD8+CD25+-клітин в усі години культивування, а також CD3+CD69+-маркерів до 96 години, однак потім препарат підсилював їх активність. Виявлено незначну стимуляцію рифампіцином CD4+CD69+-Т-клітин. Ми спостерігали збільшення кількості CD8+CD69+-маркерів через 24 і 96 годин культивування, але підйом до 120 годин перемінився зниженням даної субпопуляції. У зразках з рифабутином зареєстроване посилення активності CD3+CD25+, CD3+CD69+ і CD8+CD25+-клітин. Пік активності CD3+CD25+ і CD8+CD25+-маркерів відзначався через 120 годин культивування, і був вищим за аналогічні показники без стимуляції ПТП відповідно на 12,9 і 7,4%. Максимальна активність CD3+CD69+-клітин, зареєстрована до 96 годин, перевищувала порівняльні значення на 3,0%. Менш виражена стимуляція активності імунної відповіді відзначалася серед CD4+CD69+-маркера. Пік активності спостерігався між 8-24 годинами (20,0% і 28,8% проти порівняльних 15,4% і 27,7%). В інші години рівень не відрізнявся від показників у зразках, що не містять препарат. Препарат не впливав на активність CD8+CD69+- і пригнічував функціональну активність CD4+CD25+-клітин. На відміну від рифабутину, офлоксацин позитивно впливав на рівень CD3+CD25+, CD3+CD69+, CD4+CD25+ і CD4+CD69+-клітин, різниця між порівняльними даними склала відповідно 16,1%, 15,1%, 10,6% і 7,6%. При цьому концентрація CD8+-фенотипу, експресуючого CD25+ і CD69+-маркери під дією ФГА й офлоксацину, тільки до 24 годин підвищувалася відповідно на 29,6 і 34,0%, а потім поступово знижувалася і після 120 годин культивування була нижче вихідних величин. Вивчення функціональної активності CD3+, CD4+ і CD8+-лімфоцитів, експресуючих активаційні маркери, показало пригнічення їх активності під дією канаміцину. Зростання активності відзначалося тільки до 24 годин культивування CD4+CD25+ і CD8+CD25+ відповідно на 13,4% і 14,5% при порівнянні зі зразками без препарату. Отже, найбільш виражену дію на експресію активаційних маркерів справляв офлоксацин і найменшу – канаміцин.
У процесі культивування з рифампіцином і офлоксацином відбувалося збільшення кількості CD8+-клітин, експресуючих CD69+-маркер, особливо між 4 і 96 годинами, тоді як рифабутин у процесі культивування сприяв експресії CD8+-фенотипом крім CD69+ і CD25+-маркера. При порівнянні співвідношень між CD4+CD25+/CD8+CD25+ у зразках лімфоцитів без препаратів і з рифампіцином, офлоксацином і канаміцином виявлене зростання, у той час як з рифабутином відзначається зменшення цього показника. Порівняльний аналіз співвідношення CD4+CD69+/CD8+CD69+ показав його збільшення у всіх зразках. Очевидно, порушення імунної відповіді в хворих ТБ пов’язано не тільки зі зміною кількості клітин, але і з порушенням процесів їх активації. На підставі отриманих результатів можна констатувати у хворих на ТБ зниження кількісного вмісту Т-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій різних фенотипів не тільки в крові, але й у процесі індукованої активації in vitro.
Таким чином, отримані результати експресії активаційних маркерів на поверхні CD3+, CD4+ і CD8+-лімфоцитів під дією рифампіцину, рифабутину, офлоксацину і канаміцину розширюють уявлення про активовані Т-клітини у розвитку туберкульозного процесу і зіграють позитивну роль у визначенні нових підходів до корекції порушень імунної системи на рівні активації імунорегуляторних субпопуляций.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі проведено порівняльне вивчення впливу протитуберкульозних препаратів (рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, канаміцину та ізоніазиду) та їх комбінацій на стан імунологічної реактивності організму in vitro та in vivo, проаналізований вплив вище названих препаратів та їх комбінацій на показники імунітету, встановлені їх імунотропні властивості з метою оптимізації хіміотерапії туберкульозу. Дослідження проводили на до клінічному рівні (на щурах та морських свинках), а такою у клініці серед людей, хворих на туберкульоз легенів.
Оцінка показників периферичної крові (рівня гемоглобіну, ШОЕ, лейкоцитарної формули) у щурів і морських свинок показала, що рифабутин і офлоксацин сприяють поверненню їх до початкового рівня у експериментальних тварин: підвищені у заражених туберкульозом тварин рівні гемоглобіну, ШОЕ та лейкоцитів знижувалися.
В експерименті при модельному туберкульозі у морських свинок і щурів встановлено, що офлоксацин і рифабутин мають більш виражені імунотропні властивості, ніж рифампицин і канаміцин. Аналогічна закономірність виявлялася і у впливі даних препаратів на показники імунітету у людини.
Показники фагоцитарної активності нейтрофілів, рівень циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові щурів і морських свинок, рівень Т- і В-лімфоцитів після лікування канаміцином і рифампіцином знаходилися на рівні заражених тварин. Показники гуморального і клітинного імунітету, отримані після застосування рифабутину і офлоксацину, були аналогічними або наближалися до норми, що свідчить про позитивний вплив даних препаратів на імунні механізми експериментальних тварин і людей.
В периферичній крові хворих на туберкульоз легенів виявлено глибоке порушення початкового імунного статусу з чітким вторинним імунодефіцитом, що супроводжувався зменшенням в крові CD3+ у 65,8% хворих, CD4+ у 73,1% і CD8+ у 61,8%, збільшенням CD16+, CD19+ і CD21+ у 70,7%, CD25+, пониженням фагоцитарного індексу і фагоцитарного числа, спонтанної та індукованої ЛХЗЛ.
У хворих на туберкульоз легенів стимуляція рифампіцином знижувала вміст CD3 на 5,4%, CD16 - на 4,0% і CD25 - на 6,5%; рифабутином підвищує CD4 (2,5%) і CD8 (2,6%), знижує CD16 (4,0%) і CD25 (11,3%); офлоксацином знижує концентрацію CD16 (6,3%) і збільшує CD4 (3,3%); канаміцином знижує CD3 на 3,6%, CD16-на 13,1%, CD25-на 4,0% і CD4- на 2,1%.
Ріфампіцин не впливав на активність CD4+CD25+-маркерів і пригнічував активність CD3+CD25+ і CD8+CD25+-клітин у весь час культивування, а також CD3+CD69+-маркерів до 96 годин in vitro. Ріфабутін посилював активність CD3+CD25+, CD3+CD69+ і CD8+CD25+-клітин і пригнічував функціональну активність CD4+CD25+-клітин. Офлоксацин позитивно впливав на рівень CD3+CD25+, CD3+CD69+, CD4+CD25+ і CD4+CD69+-клітин. Канаміцин пригнічував функціональну активність CD3+, CD4+ і CD8+-лімфоцитів, експресуючих активаційні маркери. Найбільш виражену дію на експресію активаційних маркерів мав офлоксацин, а якнайменш виражену – канаміцин.
При комбінованій терапії експериментальних тварин, заражених туберкульозом, введення в схеми лікування рифабутину, офлоксацину та ізоніазиду сприяло прояву імунотропних властивостей. Серед вивчених комбінацій найкращий імунозбережуючий ефект виявило поєднання ізоніазиду з офлоксацином та рифабутином.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛИКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Абу-Кешк Талат Хафиз. Современный взгляд на химиотерапию туберкулеза и иммунитет // Azerbaijan medical journal. – 2003. – № 1. – С. 124-127.
2. Абу-Кешк Талат Хафиз. Т-клеточная защита у больных туберкулезом легких при воздействии рифампицина, рифабутина, офлоксацина и канамицина // Здоровье. – 2003. – № 9. – С. 11-14.
3. Абу-Кешк Талат Хафиз. Уровень маркеров активации у больных туберкулезом легких на фоне противотуберкулезной терапии // Azerbaijan medical journal. – 2004. – № 1. – С. 69-71.
4. Абу-Кешк Талат Хафиз. Динамика маркеров активации in vitro у больных туберкулезом легких // Фармацевтический бюлетень. – 2004. – № 1. – С. 34-36.
5. Абу-Кешк Талат Хафиз. Показатели иммунной системы больных туберкулезом легких на фоне противотуберкулезной терапии // Здоровье. – 2004. – № 6. – С. 26-29.
6. Абу-Кешк Талат Хафиз, Деримедведь Л.В. Действие рифампицина, рифабутина, офлоксацина и канамицина на экспрессию Т-клеток // Актуальні питання створення нових лікарських засобів. Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених. 17-18 травня 2007 р., м. Харків. – Харків: Вид-во НФаУ, 2007. – С. 215.
7. Абу-Кешк Талат Хафиз. Рациональное применение комбинации противотуберкулезных препаратов. Информационный листок. –№ 19. – 2007. – Отдел оперативной полиграфии ЗАТ “ХЦНТЕИ”. – Харьков, 2007. – 4 с.
АНОТАЦІЯ
Абу-Кешк Талат Хафіз. Порівняльний фармакологічний аналіз імунотропних властивостей ряду антибактеріальних препаратів, які застосовуються при туберкульозі легенів. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. Національний фармацевтичний університет. – Харків, 2008.
Дисертація присвячена порівняльному аналізу впливу протитуберкульозних препаратів (канаміцину, рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, ізоніазиду) на імунну систему експериментальних тварин (морських свинок, щурів) та людей з інфільтративною формою туберкульозу.
Проведено ряд імунологічних тестів: визначення фагоцитарної активності нейтрофілів, НСТ-тест, визначення рівнів ЛЗХЛ, В- і Т-лімфоцитів, СD-маркерів. Показано, що у експериментальних тварин найменший пригнічуючий вплив на імунітет справляли рифабутин і офлоксацин. Клінічні дослідження, проведені на людях, хворих на інфільтративну форму туберкульозу, підтвердили результати, отримані в дослідах на тваринах.
Експерименти, проведені на морських свинках, яким вводили комбінації вище вказаних препаратів, показали, що імунотропна активність спостерігалася при застосуванні ізоніазиду з офлоксацином и рифабутином. Таким чином, включення офлоксацину і рифабутину до схеми лікування туберкульозу легенів сприяє збереженню імунних властивостей організму людей и тварин.
Ключові слова: туберкульоз легенів, канаміцин, рифампіцин, рифабутин, офлоксацин, ізоніазид, імунотропна дія.
АННОТАЦИЯ
Абу-Кешк Талат Хафиз. Сравнительный фармакологический анализ иммунотропных свойств ряда антибактериальных препаратов, применяющихся при туберкулезе легких. - Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 14.03.05 – фармакология. Национальный фармацевтический университет. - Харьков, 2008.
Диссертация посвящена сравнительному анализу влияния противотуберкулезных препаратов (канамицина, рифампицина, рифабутина, офлоксацина, изониазида) на иммунную систему экспериментальных животных (морских свинок, крыс) и людей с инфильтративной формой туберкулеза.
Проведен ряд иммунологических тестов: определение фагоцитарной активности нейтрофилов, НСТ-тест, определение уровней розеткообразования, ЛЗХЛ, В- и Т-лимфоцитов, СD-маркеров. Изучено также влияние канамицина, рифампицина, рифабутина и офлоксацина на показатели периферической крови у животных и людей.
Показано, что у экспериментальных животных и людей, применение в качестве монотерапии канамицина и рифампицина приводило к угнетению показателей иммунитета. В то же время минимальное подавляющее влияние на иммунитет оказывали рифабутин и офлоксацин.
Оценка показателей периферической крови (уровня гемоглобина, ШОЕ, лейкоцитарной формулы) у крыс и морских свинок показала, что рифабутин и офлоксацин способствуют возвращению их у экспериментальных животных к исходному уровню: повышенные у зараженных туберкулезом животных уровни гемоглобина, СОЭ и лейкоцитов снижались.
Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов показало, что после заражения морских свинок и крыс фагоцитарный индекс и фагоцитарное число снижались. Лечение антибиотиками способствовало увеличению изучаемых параметров. Минимальное угнетающее влияние на иммунитет животных оказывали рифабутин и офлоксацин.
В НСТ-тесте, проведенном на крысах и морских свинках, в группе зараженных и нелеченых животных оптическая плотность снижалась в сравнении с интактной группой. Аналогичные данные были получены для групп морских свинок и крыс, которым вводили рифампицин, что свидетельствует о угнетающем его влиянии на иммунитет. В то же время результаты практически на уровне контроля были получены у животных, которых лечили офлоксацином и рифабутином.
Оценка образования активных форм кислорода фагоцитами методом спонтанной и индукцируемой зимозаном люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) показала, что в экспериментальных группах животных, которым вводили рифабутин и офлоксацин, исследуемый показатель практически не отличался от аналогичного в группе интактных животных или приближался к ним.
Аналогичные данные были получены при изучении циркулирующих иммунных комплексов, уровня гетерофильных гемолизинов, а также в реакциях розеткообразования.
У больных туберкулезом легких стимуляция рифампицином снижает содержание CD3 на 5,4, CD16 – на 4,0% и CD25 – на 6,5%; рифабутином повышает CD4 (2,5%) и CD8 (2,6%), снижает CD16 (4,0%) и CD25 (11,3%); офлоксацином снижает концентрацию CD16 (6,3%) и увеличивает CD4 (3,3%); канамицином снижает CD3 на 3,6%, CD16-на 13,1%, CD25-на 4,0% и CD4- на 2,1%.
Рифампицин не влиял на активность CD4+CD25+-маркеров и угнетал активность CD3+CD25+ и CD8+CD25+-клеток в течение всего времени культивирования, а также CD3+CD69+-маркеров до 96 часов in vitro. Рифабутин усиливал активность CD3+CD25+, CD3+CD69+ и CD8+CD25+-клеток и угтенал функциональную активность CD4+CD25+-клеток. Офлоксацин положительно влиял на уровень CD3+CD25+, CD3+CD69+, CD4+CD25+ и CD4+CD69+-клеток. Канамицин угнетал функциональную активность CD3+, CD4+ і CD8+-лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры. Найболее выраженное действие на экспрессию активационных маркеров имел офлоксацин, а наименее выраженную – канамицин.
Эксперименты, проведенные на морских свинках, которым вводили комбинации выше указанных препаратов, показали, что иммунотропная активность наблюдалась при применении изониазида с офлоксацином и рифабутином. Таким образом, включение офлоксацина и рифабутина в схемы лечения туберкулеза легких способствует сохранению иммунных свойств организма людей и животных.
Клинические исследования, проведенные на больных инфильтративной формой туберкулеза, подтвердили результаты, полученные в опытах на животных: иммунотропное действие было выявлено у тех пациентов, которые принимали офлоксацин или рифабутин.
Ключевые слова: туберкулез легких, канамицин, рифампицин, рифабутин, офлоксацин, изониазид, иммунотропное действие.
ANNOTATION
Abu-Keshk Talat Hafiz. Comparative pharmacological analysis of immunotropic properties of row of the antibacterial divparations used by pulmonary tuberculosis. – Manuscript.
The thesis on receipt of scientific degree of candidate of pharmaceutical sciences on speciality 14.03.05 – pharmacology. National pharmaceutical university. - Kharkov, 2007.
Dissertation is devoted to the comparative analysis of influencing of antituberculous divparations (kanamycin, rifampicin, rifabutin, ofloxacin, izoniazid) on the immune system of experimental animals (guinea-pigs, rats) and people with the infiltrative pulmonary tuberculosis.
The row of immunological tests was carry out: determination of fagocitic activity of neutrofil, NSТ-test, determination of the LZHL, V- and T-limfocyts levels, СD-markers. We fixed, that less supdivss immunity of animals rifabutin and ofloxacin. The clinical researches conducted in people with infiltrative pulmonary tuberculosis, confirmed results with animals.
Also was carry out experiments on guinea-pigs. Them divscribed combinations of divparations. The application of izoniazid with ofloxacin and rifabutin have immunotropic activity. Thus, the inclusion of ofloxacin and rifabutin in the charts of medical treatment of pulmonary tuberculosis was save of immune properties of human and animal organism.
Keywords: pulmonary tuberculosis, kanamycin, rifampicin, rifabutin, ofloxacin, izoniazid, immunotropic action.
