Реферат Этапы получение лизина
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2015-10-28Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ УКРАИНЫ
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
“ХАРЬКОВСКИЙ ПОЛИТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ”
Кафедра биотехнологии и аналитической химии
Реферат на тему: “ПРОИЗВОДСТВО L-ЛИЗИНА”
с курса “Фармацевтическая биотехнология”
|
Харків 2010
ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗИНА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ ПУТЕМ
В отличие от производства кормовых дрожжей промышленное получение лизина и других аминокислот осуществляется в строго асептических условиях, на стерильных питательных средах с использованием чистой культуры продуцента. Принципиальная технологическая последовательность процесса получения лизина следующая: приготовление посевного материала; подготовка и стерилизация питательной среды, всей аппаратуры и коммуникаций; культивирование продуцента в промышленных ферментаторах (ферментация); выделение целевого продукта (L-лизина).
Приготовление посевного материала
Посевная культура продуцента может быть приготовлена двумя способами; периодическим и непрерывным. В настоящее время на биохимических заводах, выпускающих лизин, приготовление посевной культуры ведется преимущественно периодическим методом.
Свободную от фага и посторонней микрофлоры исходную культуру продуцента с чашек Петри с агаром Хоттингера пересевают в пробирки с 2%-ным мясопептонным агаром и выращивают в течение суток при температуре 29-30 °С. На основе этой культуры готовят на стерильной водопроводной воде суспензию плотностью 108 клеток на 1 мл (ориентировочно 8-10 мл воды на одну пробирку). Полученной суспензией засевают стерильную питательную среду в качалочных колбах.
Для получения посевного материала используют среды различного состава. Чаще всего в среду входят меласса (3-5 %), кукурузный экстракт (2,5-3,0 %) и поваренная соль (до 0,4 %). Среду подтитровывают 20 %-ным раствором едкого натра до величины рН 7-7,2. В качалочные колбы объемом 750 мл заливают по 100-120 мл среды и стерилизуют в автоклаве. После охлаждения среду в каждой колбе засевают 2 мл посевной суспензии и выращивают куль-туру в течение суток на качалках (180-200 об/мин) при температуре 29-30 °С - это так называемые маточные посевные колбы. Затем засевают посевные колбы со средой того же состава из расчета 5 % маточной суточной культуры. Посевные колбы выдерживают на качалках в течение суток при температуре 30 °С. Культурой из посевных колб засевают первый инокуля-тор из расчета 0,05- 0,1 % по объему и выращивают ее в течение суток отъемно-доливным способом при аэрации и перемешивании. Температура выращивания 29-30 °С.
В инокуляторе состав среды может быть таким же или другим, более близким к производственной питательной среде. Для каждого продуцента состав среды устанавливают экспериментально.
Посевную срелу стерилизуют, как правило, в посевном аппарате. Если производственные ферментаторы имеют очень большую емкость или производительность завода велика, предусматривают еще одну ступень инокуляторов, объемы которых больше предыдущих, так как количество задаваемой в аппарат посевной культуры сравнительно высоко (1-5, а для ряда продуцентов 20-30 % по объему). Следует помнить, что при периодическом способе получения посевной культуры независимо от количества стадий длительность выращивания продуцента на каждой стадии составляет 16-24 ч.
В настоящее время предложен и разработан для производства L-лизина непрерывный способ получения посевного материала. Обновление исходной культуры и первые этапы размножения культуры осуществляют в лабораторных условиях, но вместо качалочных колб выращивания культуры проводят на специальном лабораторном стенде в небольших аппаратах с автоматическим регулированием заданных параметров, что позволяет значительно увеличить количество получаемой культуры и сократить время выращивания производственной культуры за счет увеличения дозы посевного материала.
В инокулятор загружают стерильную среду на 1/3 объема, задают с лабораторного стенда 5-6 % посевной культуры, подключают инокуляторы к сборнику со стерильной питательной средой и при интенсивной аэрации и перемешивании среды осуществляют выращивание до тех пор, пока среда с культурой не займет 1/2 полного объема инокулятора. Затем начинают подачу культуральной жидкости из ниокулятора в посевной ферментатор, в который поступает и свежая питательная среда. Скорость подачи среды и культуры зависит от физиологических особенностей продуцента. Когда посевной ферментатор будет заполнен на 0,6 (полное заполнение), подачу культуры из инокулятора переключают на следующий посевной ферментатор и т. д. Из посевного ферментатора готовый посевной материал направляют в производство или в предварительно простерилиэованные сборники объемом 25-35 м3.
Такая схема позволяет использовать в производстве до 30 % посевного материала. По этой схеме из инокулятора поток культуры направляют в посевной аппарат только во время загрузки. Инокулятор или посевной аппарат поочередно выполняют функции промежуточной емкости для обеспечения непрерывности при поочередной подготовке и стерилизации аппаратуры. Когда схема работает на установившемся режиме, три посевных ферментатора находятся в стадии выращивания культуры, а четвертый - в состоянии подготовки. Межстерилиэационный период для аппаратуры, предназначенной для производства посевной культуры - продуцента аминокислот, составляет 72 ч. Таких линий на производстве может быть несколько в зависимости от производительности предприятия и количества задаваемого посевного материала. При использовании посевного материала, полученного методом непрерывного культивирования, и содержании его в среде в количестве более 15 %, время ферментации сокращают на 17-25 %.
Экономический коэффициент образования лизина не зависит от методики приготовления посевного материала. Но используя непрерывный способ, следует помнить, что при длительной работе батареи возможно возникновение ревертантов и утрата свойств продуцентом. Наблюдение за культурой здесь особенно важно.
Инокуляторы или посевные ферментаторы имеют сравнительно простые конструкции. Главное требование - это минимальное количество штуцеров, смотровых окон, люков, отсутствие вращающихся деталей, надежные устройства для герметизации ферментатора. Перспективны посевные ферментаторы с пневматическим перемешиванием, где диспергирование достигается при введении в ферментатор воздуха через сопло с коническим расширением. Диаметр отверстий сопла от 1 мм в лабораторных до 10 мм в промышленных инокуляторах. Конструкция посевного ферментатора приведена на рис. 1.
Рис. 1. Сопло-конусный ферментатор ФСКА-3 с системой циркуляции и пенога-шеиия:
1 — ввод пены с воздухом в циклон; 2 — посевной штуцер; 3 — светильник; 4 — корпус ферментатора; 5 —манометры; 6 — пароводяная рубашка; 7 — подвод воздуха; 8 — штуцера для воды, пара и конденсата; 9 — пробоотборник; 10 и 11 — штуцера для термометра и отвода культуральной жидкости; 12 — опора аппарата; 13 — аэратор; 14 - обратная труба; 15 - конический барботер; 16 и 19 — смотровые окна; 17 — циклон; 19 — лопасти пеногасителя; 20 — стеклянная часть циклона; 21 — подача питательной среды.
При использовании этого аппарата можно обойтись без химического пеногасителя.
Готовая посевная культура независимо от способа ее выращивания должна быть свободна от фага (для продуцентов из рода Вгеvibacterium), посторонней микрофлоры и иметь титр около 109 клеток на 1 мл.
Приготовление и стерилизация питательной среды, аппаратов и коммуникаций
Промышленная технология лизина, разработанная в нашей стране, предусматривает использование питательной среды для выращивания продуцентов лизина, состоящей из мелассы, кукурузного экстракта или другого источника ростовых веществ, мела и пеногасителя. Однако в связи с дефицитностью мелассы и кукурузного экстракта в настоящее время проводится поиск новых дешевых компонентов для их частичной или полной замены, обеспечивающих сбалансированность питательной среды для действующих лизиновых заводов.
В качестве заменителей кукурузного экстракта используют ферментативный гидролизат БВК, при этом ферментолизат БВК, внесенный в питательную среду вместо кукурузного экстракта, должен обеспечить концентрацию аминного азота 0,06 %. В этих условиях уровень биосинтеза лизина культурой Вгеvibacterium 22ЛД (промышленный штамм) на 60 % выше, чем с кукурузным экстрактом (при содержании мелассы по РВ 10 %).
Установлено также, что замена кукурузного экстракта в питательной среде нативной молочной сывороткой (рН 4, РВ 2,5 %, СВ б, NH2 0,05 %) в количестве 0,04 % по аминному азоту обеспечивает выход на 10 % больше, чем регламентная среда. Использование выпаренной молочной сыворотки (рН 3,9, РВ 10,8 %, СВ 25, NH2 0,23 %) в количестве 0,05 % по аминному азоту вместо кукурузного экстракта способствует повышению накопления лизина на 67 %, при этом сокращается расход мелассы за счет молочного сахара, содержащегося в сыворотке.
В качестве стимулятора роста культур - продуцентов лизина возможно использование водорослей Fucus vusiculosus, в которых содержатся ростовые вещества группы В по классификации Н. Вильсона и В. Гартелиуса. Выход лизина при введении в питательную среду экстракта высушенных и размолотых водорослей увеличивается на 40-50 %.
В нашей стране разработана новая комплексная технологическая схема производства ферментного препарата глюкоамилазы при глубинном культивировании гриба Asp. awamori F-122, отходы производства которого используются в качестве питательной среды для производства L-лизина: ультрафильтрат (источник углерода, азота и неорганических солей) и мицелий Asp. awamori F-122 (источник органического азота). Ультрафильтрат после концентрирования ферментного раствора в количестве 964 л на 1 м3 раствора, поступающего на концентрирование, ранее сливался в канализацию, а биомасса (мицелий) направлялась на отвал. Состав ультрафильтрата следующий (в %): СВ 5,5-6, РВ 4-4,5, общий азот 0,18-0,2, аминный азот 0,03-0,04. Содержание сырого протеина 11 г/л. В биомассе, которая образуется в количестве 200-250 кг на 1 м3 культуральной жидкости (при влажности 70 %), содержится до 5 % белка, 0,4-0,5 углеводов, 0,15-0,25 % аминокислот в большом ассортименте. Культивирование продуцентов лизина Согуn. glutamicum Т-3 и Brevibacterium sp. 22L проводят на питательных средах, приготовленных на основе стерильного ультрафильтрата с рН 7-7,4, содержанием cахаров 8-12 %, аминного азота 0,08-0,1, общего азота 0,4-0,6 %. Туда же добавляют 2-3 % (по сухой массе) экстракта мицелия Asp. awamori F-122. Выход лизина через 48-50 ч культивирования на такой среде 40-45 г/л.
Обычно питательную среду готовят и стерилизуют в две стадии с учетом свойств компонентов, входящих в ее состав. Стадия подготовки и стерилизации среды состоит из смешивания компонентов питательной среды в определенной пропорции с помощью специальных дозаторов в реакторе, растворения солей при перемешивании, нагрева до температуры стерилизации, выдержки при этой температуре и охлаждения до температуры, при которой проводится культивирование продуцента лизина.
В производстве лизина используют мелассу, содержащую термолабильный компонент - сахарозу. Поэтому ее стерилизуют отдельно. В реактор, снабженный мешалкой, подают мелассу, нагревают при постоянном перемешивании до температуры 80 °С, разбавляют водой согласно имеющейся рецептуре, затем быстро разогревают глухим паром до температуры 120-122 °С в специальном аппарате и выдерживают при этой температуре определенное время, необходимое для полной гибели микрофлоры. Остальные компоненты среды смешивают также в реакторе с мешалкой и растворяют в воде с подогревом, нагревают в специальном аппарате до температуры стерилизации, выдерживают при этой температуре и охлаждают. Длительность, стерилизации при этом значительно меньше, но температура выше.
Пеногаситель часто стерилизуют отдельно, особенно в том случае, когда им является масло или жир. Режимы стерилизации (температура и длительность) при обработке пеногасителя более жесткие, чем это принято для стерилизации любых питательных сред.
Процесс получения лизина требует строгих асептических условий, и поэтому особое внимание уделяют стерилизации не только среды, но а всех реакторов, коммуникаций, подаваемого воздуха. Режимы стерилизации зависят главным образом от материала, из которого изготовлена аппаратура. Наиболее эффективна обработка аппаратуры и коммуникаций острым паром под давлением при температуре 135—140 °С. Но отдельные блоки аппаратов, в том числе датчики измерительных приборов, не выдерживают таких условий стерилизации, и для их обработки применяют "холодные" способы стерилизации. Для такой обработки могут быть использованы бактерицидные газы (этилен) и растворы химических реагентов (формалина, смеси цитилпиридинового бромида и этанолмеркурихлорида в соотношении 2:1, различные производные фенола и их смеси, аммонийные соли первичных в вторичных алкилсульфатов, хлорсодержащие соединения, β-пропиоллактон и т. д.). После холодной стерилизации остатки химических реагентов должны быть удалены промывкой стерильной водой.
Степень стерильности среды, оборудования и коммуникаций проверяют следующим образом. Простерилизованную среду или смывы, произведенные стерильной водой с внутренних поверхностей аппаратов и трубопроводов, высевают на агаризованные или жидкие питательные среды и инкубируют в термостате в течение суток. Если среды остаются стерильными, значит, стерилизация проведена правильно. Такой анализ проводят при пуске завода, в случае появления инфекции и периодически в профилактических целях.
Культивирование продуцента лизина в промышленных ферментаторах
Выращивание производственной культуры продуцента лизина осуществляется, как правило, периодическим способом в ферментаторах. В отличие от аппаратов, используемых при производстве кормовых дрожжей, ферментаторы имеют меньшие габаритные размеры и рассчитаны на 50, 63 и 100 м3. Все они предназначены для выращивания культуры в асептических условиях со строгим соблюдением герметизации процесса. Ферментаторы снабжают необходимыми коммуникациями, системой подачи стерильного пеногасителя, охлаждающими теплообменными устройствами и устройствами для перемешивания и введения в питательную среду стерильного воздуха, дополнительных питательных ингредиентов, а также растворов кислот или щелочей для поддержания рН среды на заданном уровне. На рис. 2 представлен общий вид ферментатора для выращивания продуцента в асептических условиях
.
Рис. 2. Ферментатор вместимостью 50 м3:
1 — теплообменник; 2 — электродвигатель; 3 — привод мешалки; 4 — соединительная муфта вела; 5 — гильза для термометра; 6 — барботер; 7 — корпус аппарата; 8 — растяжка для центровки вале; 9 — лопасти мешалки; 10 — мешалка; 11 — опора аппарата
Стерильную среду в ферментатор вводят при температуре, близкой к температуре выращивания продуцента (32-35 °С), или около 80 °С. Во втором случае для окончательного охлаждения аппарата и среды используют теплообменные устройства самого ферментатора.
При достижении оптимальной температуры среды из посевного ферментатора подают посевной материал и тут же начинают аэрацию содержимого ферментатора. Коэффициент заполнения аппарата 0,65-0,75 в зависимости от степени ценообразования в данных условиях культивирования.
В ферментаторе устанавливают определенный режим культивирования в зависимости от особенностей продуцента. Для продуцентов лизина длительность ферментации составляет 58-72 ч.
В первые сутки микроорганизмы ассимилируют приблизительно 25 % общего азота среды, углеводов и почти все аминокислоты. За это время накапливается почти вся биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким замедлением накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза лизина. Питательная среда сильно истощается, изменяется рН. На этой стадии целесообразно проводить подтитровывание среды 25 %-ным раствором аммиака или 15 %-ным раствором NaОН с целью стабилизации рН и дополнительно вводить питательные вещества (подпитка). Последняя стадия выращивания продуцента лизина характеризуется некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости накопления лизина.
Как отмечалось выше, на биосинтез лизина существенное влияние оказывают аэрация и перемешивание. Поэтому на всех стадиях процесса все параметры культивирования строго регламентируются и контролируются (температура, рН, изменение основных компонентов среды, накопление лизина, аэрация, перемешивание и т. д.).
Для реализации процесса получения продукта микробиологического синтеза определяют время начала подачи подпитки, а также изменения расходов растворов питательных ростовых веществ и стерильной воды, обеспечивающие максимизацию производительности аппарата. Например, после рассмотрения физиологической активности культуры Вгеvibacterium 22ЛД в периодическом процессе на питательной среде с ферментолизатом БВК при культивировании в ферментаторе объемом 100 м3 на Шебекинском биохимическом заводе для введения подпитки (40 %-ный раствор мелассы и 1,4 %-ный раствор солей) был выбран период с 12-го по 15-й ч культивирования, который характеризуется наибольшей скоростью лизинообразования. Подачей мелассной подпитки в питательную среду вводили 5-6 % сахаров. За 65 ч культивирования синтезировалось 47 г/л лизина. Выход лизина составлял 31 % по массе введенного сахара.
Готовая культуральная жидкость помимо лизина содержит биомассу продуцента, остатки непотребленных питательных веществ среды, продукты обмена веществ.
Выделение целевого продукта (
L
-лизина)
В зависимости от последующего назначения препарата можно на основе культуральной жидкости получить технические препараты в виде жидкого концентрата лизина (ЖКЛ) и сухого кормового концентрата лизина (KKJI), а также кристаллический лизин. Для каждого из этих продуктов существует своя технология.
Для кормовых целей целесообразнее получать технические препараты ЖКЛ и ККЛ, так как они содержат помимо лизина значительное количество других важных для организма животного соединений, в частности витамины: рибофлавин, пантотеновую, фолиевую и никотиновую кислоты и др.
Технические препараты лизина получают на основе всей суммы веществ, присутствующих в культуральной жидкости, включая биомассу продуцента и твердые нерастворимые частицы среды. Поскольку культуральная жидкость имеет сравнительно низкое содержание сухих веществ (10-13 %) и не обладает стабильностью при хранении, концентрацию сухих веществ увеличивают методом выпаривания или высушивания. Готовая культуральная жидкость перед концентрированием должна содержать минимальное количество редуцирующих сахаров, так как в процессе концентрирования они могут образовывать при участии ε-аминогруппы лизина соединения, не усваиваемые животными, т. е. происходит безвозвратная потеря целевого продукта.
Для стабилизации лизина культуральную жидкость подкисляют соляной кислотой до pH 5 и добавляют 25 %-ный раствор метабисульфита натрия в количестве 0,4 %. Далее стабилизированную культуральную жидкость выпаривают в вакуум-выпарной установке до концентрации сухих веществ 35-40 %. Потери лизина на этой операции составляют от 5 до 15 %. Вязкость ЖКЛ 0,648 . 10-3 кг/(м . с), температура замерзания – 18 °С, удельная масса 1,150-1,300, pH 4,5-6.
Жидкий концентрат лизина хорошо сохраняется в течение 3-4 месяца. Считается, что он обладает большей биологической ценностью, чем сухой ККЛ. Для получения сухого ККЛ жидкий концентрат высушивают на распылительных сушилках до влажности 5-6 %. Полученный ККЛ содержит до 15-20 % лизина в виде монохлоргидрата, около 15-17 % белка, до 14 % других аминокислот, 10-13 % бетаина и около 20-25 % зольных веществ. Но сухой ККЛ, получаемый высушиванием стабилизированной и сконцентрированной культуральной жидкости, имеет недостаток - он очень гигроскопичен (его гигроскопическая точка при 20 °С равна 20-22 % относительной влажности воздуха) и при хранении слеживается. Образующиеся при этом крупные комки затрудняют его дальнейшее продуктивное использование как при приготовлении комбикормов, так и непосредственно на животноводческих фермах.
Имеется несколько способов ликвидации этого недостатка. По-видимому, большая гигроскопичность сухого препарата связана с высоким содержанием сахаров и органических кислот, которое можно снизить введением в культуральную жидкость наполнителей (костной муки, оксида кальция, бентонита, пшеничных отрубей) и последующей сушкой. В результате получается сыпучий менее гигроскопичный продукт.
Известен метод выращивания на готовой культуральной жидкости, содержащей лизин, специальных видов дрожжей, усваивающих углеводы и органические кислоты. Из культуральной жидкости исчезают нежелательные компоненты (сахара и органические кислоты), и она дополнительно обогащается кормовым белком (дрожжи).
При такой технологии ККЛ получается менее гигроскопичным и более сыпучим. Жидкий и сухой концентраты лизина приблизительно одинаковы по своему составу, если приготовлены без наполнителей. Если же вводят наполнители, к сумме сухих веществ культуральной жидкости прибавляют еще и их сухие вещества.
На основе готовой культуральной жидкости можно получать кристаллические препараты лизина. Первым этапом в этой технологии является освобождение от твердой взвеси центрифугированием и получение фильтрата культуральной жидкости, из которой лизин извлекают с помощью ионообменной смолы КБ-4П-2 или КУ-2. Сорбция лизина осуществляется на катионит в аммонийной форме
Лизин + 2 (NН4+) • Катионит → (2 NН4 +) + (Лизин+2) • Катионит.
Затем колонки тщательно промывают до бесцветной промывной воды и осуществляют элюцию лизина с катионита 0,5-5 %-ным раствором аммиака до отсутствия следов лизина в последних порциях стекающего элюата и получают 1-2 %-ный раствор лизина. В элюат переходит 80-90 % сорбированного лизина. Десорбция лизина протекает по следующей схеме
(Лизин +2) • Катионит + (2 NН4 +) → Лизин+2 + 2 (2 NН4 +) • Катионит.
Помимо лизина элюат содержит значительное количество аммиака, который удаляют при нагревании, а освобожденный от аммиака элюат подкисляют соляной кислотой до рН 4,9-5 и выпаривают в вакуум-выпарном аппарате при температуре 60 °С до концентрации лизина 30-50 %. При взаимодействии лизина с соляной кислотой образуется монохлоргидрат лизина, который выпадает при охлаждения до температуры 10-12 °С из концентрата в виде желтоватых кристаллов. Последние отделяют от маточного раствора и, если предполагается использовать лизин для кормовых целей, высушивают и фасуют, маточный же раствор отправляют на повторное концентрирование для утилизации оставшегося в нем лизина. Если предполагается получение высокоочищенных препаратов лизина, кристаллы первой ступени выделения подвергают многостадийной очистке от красящих веществ и других примесей. Перекристаллизацию лизина проводят из раствора в этиловом спирте. Очищенный лизин используют для пищевых, медицинских и других целей. Товарный продукт содержит не менее 97 % основного вещества - L-лизина дигидромонохлоргидрата. Влажность продукта не выше 0,5 %, зольность до 0,3. Выпускают его в виде малогигроскопичного порошка белого или бледно-кремового цвета, без запаха, горько-соленого вкуса.
Потери лизина в процессе выделения кристаллического препарата составляют около 30 %.
Завершается процесс производства лизина любой степени чистоты фасовкой, упаковкой и складированием готового продукта. Фасуют препараты в полиэтиленовые мешки, которые герметизируют и дополнительно упаковывают в крафт-мешки или в случае кристаллического препарата - в картонные коробки.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Биотехнология: Учеб. Пособие для вузов. В 8 кн./Под Б 63 ред. Н. С. Егорова. В. Д. Самуилова. Кн. 6: Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов/Быков В. А., Крылов И. А., Манаков М. Н. и др. – М.: Высш. шк., 1987. – 143 с.: ил.
2. Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П. Биотехнология, М., ВО Агропромиздат. 1990.
3. Биотехнология // Под ред. А. А. Баева. – М.: Наука, 1984. С. 311
