Биосинтез аскорбиновой кислоты листьями ячменя в атмосфере азота

Г.Н. Чупахина, Н.Ф. Теплицкая (Калининградский государственный университет)

Увеличение содержания аскорбиновой кислота (АК) в растениях на свету связывается некоторыми исследователями с процессом фотосинтеза [1, 2]. По мнению других авторов [3, 4, 5], эта связь косвенная и АК не относится к числу прямых продуктов фотосинтеза. Так, Шопфер [6] указывает, что повышение содержания АК на свету обусловлено системой фитохрома и участие фотосинтеза в этом процессе не обнаружено. Непосредственное действие света в процессе биосинтеза АК подчеркивается в целом ряде работ [7, 8, 9].

С целью решения вопроса о наличии связи биосинтеза АК с процессом фотосинтеза нами исследовалась возможность образования двух форм АК - восстановленной и окисленной листьями проростков ячменя на свету в атмосфере азота, то есть в условиях, исключающих протекание фотосинтеза.

Объект и методы

Объектом исследования служили 7-8-дневные проростки ячменя (Hordeum vulgare L.) сорта "Майя". Листья опытных растений помещались на растворы в камеры из органического стекла, которые заполнялись азотом, очищенным от примесей других газов. Система очистки состояла из раскаленных медных стружек, щелочного раствора пирогаллола, сухих гранул калийной щелочи и концентрированной серной кислоты, последняя использовалась для улавливания паров влаги. Во время опыта циркуляция азота через камеры осуществлялась с помощью микрокомпрессора МК-2. Растения освещались светом ламп ЛДЦ-40 интенсивностью 17 тыс. эрг/см2с. Количественное содержание восстановленной и окисленной форм аскорбиновой кислоты определялось путем титрования растительных вытяжек 2,6-дихлорфенолиндофенолом до и после восстановления дегидроаскорбиновой кислоты сероводородом. Окисленная форма АК определялась по разнице этих титрований [10, с.88-91]. Полученные данные обработаны статистически.

Результаты и обсуждение

В опытах использовались проростки ячменя, предварительно выдержанные в темноте около 40 часов. Это снижало уровень АК, а в дальнейшем после перенесения проростков на свет способствовало более активному ее биосинтезу. Поскольку в этих условиях возобновляется процесс фотосинтеза, можно было предположить, что существует прямая связь между фотосинтезом и биосинтезом АК. Однако в наших опытах отмечено активное накопление восстановленной формы АК в освещенных листьях ячменя, находящихся на экзогенных субстратах в атмосфере азота, то есть в среде, исключающей протекание фотосинтеза. Так, за 8 часов опыта (табл. 1) количество восстановленной АК в листьях, находящихся на 0,005 М растворе глюкозы в атмосфере азота, увеличилось на 193% по сравнению с исходным ее содержанием. За это же время в освещенных проростках, находящихся на растворе глюкозы на воздухе, содержание АК увеличилось только на 136%.

Таблица 1

Биосинтез восстановленной АК в атмосфере азота 7-8-дневными проростками ячменя, плавающими на 0,005 М растворе глюкозы на свету (экспозиция 8 час.; интенсивность света 17 тыс.эрг/см2с)

Вариант опыта	Содержание восстановленной АК в мкг/г свежих листьев
	М	%	t
	n=11		tтабл = 2,23
Исходное содержание	70,9	100
Листья, плавающие на 0,005М р-ре глюкозы:
в атмосфере азота (а)	207,9	293
на воздухе (б)	167,0	236	tа/б = 4,58

Аналогичная закономерность отмечена и в серии опытов (табл. 2), где исследовалось накопление АК проростками ячменя, помещенными на 0,005 М раствор щавелевой кислоты, возможность использования которой в биосинтезе АК была показана нами ранее [11]. В листьях, плавающих на растворе щавелевой кислоты на свету в атмосфере азота, содержание АК увеличилось на 142%, а на воздухе - на 99%.

Таблица 2

Биосинтез восстановленной АК в атмосфере азота 7-8-дневными проростками ячменя, плавающими на 0,005 М растворе щавелевой кислоты на свету (экспозиция 8 час.; интенсивность света 17 тыс.эрг/см2с)

Вариант опыта	Содержание восстановленной АК в мкг/г свежих листьев
	М	%	t
	n=11		tтабл = 2,36
Исходное содержание	57	100
Листья, плавающие на 0,005М р-ре глюкозы:
в атмосфере азота (а)	138,2	242
на воздухе (б)	113,6	199	tа/б = 5,88

Таким образом, отсутствие в среде углекислого газа, необходимого для фотосинтеза, не только не препятствует процессу биосинтеза восстановленной формы АК из экзогенных субстратов, но даже способствует несколько большему ее накоплению по сравнению с нормальными условиями.

Факт большего накопления восстановленной АК в листьях, находящихся в атмосфере азота, можно объяснить тем, что восстановленная АК в этих условиях не отвлекается на процессы дыхания и фотосинтеза, в которых она принимает непосредственное участие в качестве донора электронов [12, 13]. С другой стороны, [7] в анаэробных условиях на свету происходит фотовосстановление предшественника АК, что также может приводить к увеличению количества восстановленной формы АК в листьях, находящихся в атмосфере азота. Этому может способствовать и свойство свободного радикала аскорбата акцептировать электроны [14].

В следующих опытах наряду с восстановленной формой АК определялась и ее дегидроформа (табл. 3). Исследование накопления двух форм АК в проростках ячменя, находящихся на свету на воде и 0,005 М растворе глюкозы в атмосфере азота и воздуха, показало, что отсутствие углекислого газа не препятствовало биосинтезу восстановленной формы АК. Окисленная форма АК преобладала в листьях, находящихся в аэробных условиях, где восстановленная форма АК вовлекается в процессы фотосинтеза и дыхания с образованием дегидроформы. К тому же в атмосфере азота в растениях преобладающее значение имеют реакции фотовосстановления АК, а реакции фотоокисления менее выражены [15].

Таблица 3

Содержание восстановленной и окисленной форм АК в 7-8-дневных проростках ячменя, находящихся на свету в атмосфере азота в течение 8 часов (интенсивность света 17 тыс.эрг/см2с)

Вариант	Содержание АК в мкг/г свежих листьев
опыта	Восстановленной			Окисленной			Суммы
	М	%	t	М	%	t	М	%
	n=6		tтабл = 2,57	n=6		tтабл = 2,57	n=6
Исходное содержание	93,3	100		16,8	100		110,8	100
Листья, плавающие на воде:
азот (а)	175,5	186		4,9	29		180,0	162
воздух (б)	177,7	189	tб/г=4,58	14,8	88	tа/б=1,12	192,5	174
Листья, плавающие на 0,005М р-ре глюкозы:
азот (в)	218,2	232		6,5	39		224,8	203
воздух (г)	203,0	216	tв/г=4,42	15,1	90	tв/г=2,78	218,1	197

Нужно отметить, что абсолютное содержание восстановленной формы АК и суммы двух форм АК (восстановленная + окисленная) было несколько выше в листьях, находящихся на 0,005 М растворе глюкозы по сравнению с вариантами, где экзогенный субстрат не вводился. В последнем случае не отмечено большего накопления восстановленной АК в проростках, находящихся в анаэробной среде по сравнению с нормальными условиями, что отмечается во всех вариантах с использованием экзогенных субстратов. Вероятно, за 8 часов опыта уже проявляет себя недостаток субстрата, который необходим для биосинтеза АК и образование которого связано с фотосинтезом.

Таким образом, способность проростков ячменя синтезировать АК в атмосфере азота на свету дает основание говорить об отсутствии прямой связи между процессом фотосинтеза и биосинтезом АК. В связи с тем, что процесс образования АК светозависимый, можно предположить, что он включает в себя специфические фотобиохимические реакции, прямо не связанные с фотосинтезом. Спектры действия реакций фотовосстановления и фотоокисления АК указывают на включение в эти реакции хлорофилла [12], а в бесхлорофильных органах в атмосфере азота [16, 17] новообразование АК не происходит. Поскольку на свету в атмосфере азота нами отмечено изменение содержания не только АК, но и ее окисленной формы, то говорить об участии фитохрома в процессе светозависимого накопления АК проблематично, так как известно [6], что фитохром не оказывает влияния на соотношение АК и ДАК.

Список литературы

1. Землянухин А.А. О содержании дегидроаскорбиновой кислоты в некоторых растениях // Бюл. общества естествоиспытателей при Воронежском у-те. 1955. Вып. 9. С.19-22.

2. Asselbergs E.A.M. Studies on the formation of ascorbic acid in detached apple leaves // Plant physiology. 1957. Vol. 32. N 4. P.326-329.

3. Franke W. Uber die Biosynthese des Vitamin C. II. Sur Biochemie i und Physiologie der Vitamin C-Synthese // Planta. 1955. Bd. 45. N 2. S.166-197.

4. Franke W. Uber die Biosynthese des Vitamin C. III. Mitt. Nachweis der Unabhдngigkeit der Vitamin C-Bildung von der Photosynthese (bei Vicia faba minor) // Planta. 1955. Bd. 53. N 6. S.551-564.

5. Mehner H., Franke W. Uber die Wirkung einer Begasung mit verschiedenen gasgemischen wдhrend der keimung auf die Vitamin C-Bildung in Getreide - keimlingen // Planta. 1960. Bd. 54. N 6. S.604-610.

6. Schopfer Peter. Der Einfluss von Phytochrom auf die stationдren Konzentrationen von Ascorbinsдure und Dehydroascorbin-saure beim Senfkeimling (Sinapis alba L.) // Planta. 1966. Bd. 69. N 2. S.158-177.

7. Mitsui Akira, Ohta Takahisa. Photooxidative consumption and photoreductive formation of ascorbic acid in green leaves // Plant and Cell Physiol. 1961. Vol. 2. N 1. P.31-34.

8. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. Несовпадение спектров действия биосинтеза АК и фотосинтеза // Информ. бюл. СО АН СССР. Иркутск, 1968. Вып. 3. С.97-98.

9. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н. Роль света в биосинтезе АК в листьях ячменя // Биол. науки. 1970. № 7. С.88-94.

10. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Смирнова–Иконникова М.М., Ярош Н.П., Луковникова Г.А. Методы биохимического исследования растений. Л., 1972. 455 с.

11. Окунцов М.М., Чупахина Г.Н., Старченко Г.Ф., Теплицая Е.Ф. Действие некоторых органических кислот на синтез АК в проростках ячменя // Биол. науки. 1974. № 5. С.81-86.

12. Mapson L.W. The ascorbic acid system in leaves: further observations on photooxidation and photoreduction // Phytochemistry. 1964. N 3. P.429-445.

13. Аристархов А.И., Никандров В.В., Красновский А.А Аскорбат и глютатион - возможные эндогенные доноры при фотовосстановлении ферредоксина и НАДФ хлоропластами // II Съезд Всесоюз. об-ва физиологов раст.: Тез. докл. 4.2. Минск, 1990. М., 1992. С. 15.

14. Horemans N., Asard H., Caubergs R.J. The role of ascorbic Free Radical as an Electron Acceptor to Cytochrome b–Mediated Trans–Plasma Membrane Electron Transport in Higher Plants // Plant Physiol. 1994. Vol.104. P.1455-1458.

15. Mapson L.W. Photo-oxidation of ascorbic acid in leaves // Biochem. J. 1962. Vol. 85. N 2. P.360-369.

16. Franke W. Uber die Biosynthese des Vitamins C. I. Mitteilung. Die Beziehungen zwischen Vitamin C und der Atmung // Planta. 1954. Bd. 44. N 5. S.437-458.

17. Чиркова Т.В. О роли листьев в снабжении корней АК и в ее биосинтезе // Учен. зап. Тартуского ун-та. 1966. Вып. 135. С.290-294.

Для подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://elib.albertina.ru