Сталкерный механизм предусматривает, что в зоне точечного контакта присутствуют ассиметричные молекулы липидов, участки нестабильности. При контакте эти молекулы хаотически двигаются до тех, пока не образуется триламинарная структура. Адгезионный механизм предусматривает образование в зоне контакта обратных мицелл, сходных гексагональной фазе, в зоне контакта нарушается устойчивость плоской упаковки монослоев, последние преобразуются на обратные мицеллы.
В нормальных условиях слипание и слияние клеток происходит сравнительно редко (в зависимости от функционального состояния клеток). По-видимому, мембранные компоненты различных гранул ответственны за селективную дегрануляцию.
В то время как в нейтрофилах механизмы экзоцитоза не ясны, в нейрональных и дрожжевых клетках механизмы и белковый аппарат секреции изучены довольно детально. Модели слияния мембран, получившей название SNARE гипотеза. Эта гипотеза, впервые предложенная для экзоцитоза синаптических пузырьков, по-видимому ,носит универсальный характер и справедлива как для конститутивного, так и регулируемого слияния мембран.
SNARE гипотеза основана на взаимодействии цитозольных белков NSF (N – ethylmaleimide-sensitive factor) и SNAP (soluble NSF attachment protein) с их рецепторами, названными SNARE (от сочетания английских слов SNAP RECEPTOR). Под термином SNARE традиционно объединяют три группы белков: синтаксисы, синаптобровины/ VAMP (vesicle – associated membrane protein) и SNAP-25 (synaptosome – associated protein of 25 кДа) [45]. Ниже представлена характеристика SNAP, NSF и SNARE, после чего рассмотрен механизм слияния мембран с участием этих белков.

2. Характеристика основных белковых компонентов модели
2.1. VAMP/ синаптобревин
Семейство VAMP/ синаптобревинов объединяет интегральные мембранные белки с молекулярной массой порядка 18 кДа. Два представителя этого семейства VAMP-1 (синаптобревин 1) и VAMP-2 (синаптобревин 2) впервые были обнаружены и охарактеризованы в везикулах нейтральных клеток [9]. Белки представляют собой продукты двух отдельных генов, экспрессия которых различным образом регулируется в нейронах [30]. В настоящее время ненейрональные гомологи VAMP-1 и VAMP-2 идентифицированы в самых разных эукариотических клетках [13]. Одна из изоформ VAMP, а именно VAMP-3/ селлюбревин, характерна только для ненейрональных клеток [35].
В молекулярной структуре белков этого семейства можно выделить NН₂ – концевой район, обогащенный остатками промена (аспарагина), гидрофильный центральный участок – «кор»-протяженностью в 70 аминокислотных остатков и СООН – концевой мембранный домен. В некоторых белках, в частности VAMP из Aplysia Californica и Drosophila melanogaster, на С-конце молекулы присутствует небольшой домен, обращенный в полость везикулы [20]. Гидрофильный «кор» является довольно консервативным и незначительно меняется при переходе от одной изоформы к другой. Напротив, в пределах N-концевого района сконцентрированы аминокислотные домены, отличающие белки этого семейства.
VAMP/ синаптобревинам свойственна мембранная топология и ассоциация с мембранами секреторных везикул. В этой связи белки были названы V-SNARE (от английского слова vesicle – везикула). Для некоторых новых изоформ VAMP обнаружен необычный образец внутриклеточной локализации белка. Так, в частности, VAMP-5 связан с плазматической мембраной миобластов, VAMP-1А идентифицирован в плазмалемме, а VAMP-1В в митохондриях клеток эндотелия [28].
Во многих клетках, способных как конститутивной, так и регулируемой секреции, обнаружены белки, гомологичные VAMP.
Комбинация методов субклеточного фракционирования и иммуноцитохимических методов позволила установить наличие VAMP-иммунореакцивных белков в гранулах различных клеток с регулируемым типом секреции. Так, в частности, эти белки идентифицированы в адипоцитах [19], зимогеновых гранулах ацинарных клеток поджелудочной железы крысы [17], инсулин-содержащих гранулах b-клеток островков Лангерланса поджелудочной железы крысы, специфических гранулах нейтрофилов человека [16], тубувезикулах пристеночных клеток желудка [18], акросомальных везикулах сперматозоидов и кортикальных гранулах яйцеклеток [21] морского ежа. Для гомологов VAMP-2 прослеживается более широкий образец распространения в указанных клетках, чем для другой белковой изоформы – VAMP-1.
VAMP-3/ селлюбревин был обнаружен во всех исследованных клетках и тканях крысы, что указывает на вовлечение этого белка в процессы конститутивного транспорта везикул [35]. Эксперименты по определению внутриклеточной локализации селлюбревина показали, что белок находится преимущественно в структурах эндосомного происхождения.
Результаты трех независимых экспериментальных подходов указывают на участие белков семейства VAMP/ синаптобревинов в секреции. Во-первых, эти белки взаимодействуют с цитозольными белками NSF, а также a- и g-SNAP, которые являются необходимыми факторами слияния мембран [47].
Во-вторых, VAMP/ синаптобревины являются мишенями для протеолитической деградации клостридиальными нейротоксинами – тетанусным токсином и ботулиническим токсином серотипов В, D, F, G [39], которые блокируют высвобождение нейротрансмиттера в синапсах.
В-третьих, важная роль VAMP/ синаптобревинов в процессах секреции подтверждается результатами генетических экспериментов на дрожжах Saccharomyces cerevisial. Так, мутации в дрожжах по генам, кодирующим гомологи VAMP, приводят к значительным нарушениям конститутивной секреции [24]. При этом мутации по разным изоформам блокируют различные этапы секреторного процесса: транспорт везикул и эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи, из аппарата Гольджи к плазматической мембране и из аппарата Гольджи к вакуолям [42]. Мутации в этих генах приводят к нарушению секреции, которое выражается в накоплении везикул, не способных сливаться с плазмолеммой.
2.2. Синтаксины
Синтаксины представляют мультигенное семейство интегральных мембранных белков с молекулярной массой » 35 кДа. Первый представитель этого семейства, синтаксин 1А/1В, был идентифицирован в нейронах крысы в морфологически детерминированном участке плазматической мембраны, формирующем зону синаптического контакта [11]. Белок демонстрировал способность к взаимодействию с мембранным белком синаптической везикулы, синаптотагмином (р65), и кальциевым каналом N-типа, который, вовлечен в регуляцию высвобождения нейротрансмиттера. Базируясь на этих наблюдениях, авторы предложили участие синтаксина в слипании/ слиянии мембраны синаптического пузырька с пресинаптической мембраной.
Множественные ненейрональные гомологи синтаксина 1А/1В были найдены в самых разных организмах: от дрожжей до человека [12]. При этом наблюдается избирательный характер распространения отдельных представителей в специфических клеточных фетотипах. Так, синтаксин 1А/1В присутствует исключительно в нейрональных и нейроэндокринных клетках. Синтаксины 2, 4 и 5 довольно широко распространены в разных клетках и тканях млекопитающих. В нейтрофилах человека также был идентифицирован представитель семейства синтаксинов, синтаксин 4 [16].
Синтаксины являются достаточно консервативными белками. Сравнение аминокислотных последовательности шести различных изоформ, присутствующих в тканях крысы, показывает 30-90 %-ную степень гомологии между отдельными белками [12]. При этом степень гомологии между синтаксинами 1А и 1В составляет 90 %, между синтаксинами 2-4 и синтаксинами 1А/1В варьирует от 46 до 64 %, а между синтаксином 5 и остальными белками составляет лишь 23-26 %. Синтаксинам свойственны общие черты структурной организации белковых молекул. Молекулы этих белков протяженностью в 288-301 аминокислотных остатков содержат на карбоксильном конце транс-мембранный домен. Этот домен играет важную роль в «заякоривании» белка в мембране, а также, и в детерминировании внутриклеточной локализации белка [34]. Каждый член семейства синтаксинов содержат несколько доменов, способных к образованию различных спиральных a-спиралей, структур, которые участвуют в межмолекулярных белок-белковых взаимодействиях. Следует отметить, что синтаксинам присуще огромное разнообразие белок-белковых взаимодействий. Установлено, что синтаксин взаимодействует с синколлином, белком зимогеновых гранул поджелудочной железы [22], томосином, тубулином, киназой 5 и некоторыми другими белками. Функциональное значение этих взаимодействий в настоящее время выясняется.
Для синтаксинов характерна ассоциация с акцепторной мембраной, являющейся мишенью для транспортной везикулы. Поэтому синтаксины относят к t-SNARE (от английского слова target – мишень).
В клетках, способных к регулируемому экзоцитозу, синтаксины, главным образом, ассоциированы с плазматической мембраной. Однако недавно в литературе появились сообщения о существовании пула синтаксинов в мембранах секреторных везикул. Так, иммуно-электронной микроскопией установлено присутствие синтаксина 1А в мембранах синаптических пузырьков [33], а в зимогеновых гранулах поджелудочной железы обнаружен синтаксин 3. Эти данные противоречат традиционной точке зрения о синтаксинах, как и белках, функционирующих по типу t-SNARE. При этом не ясно, является ли везикулярный пул синтаксинов функционально значимым.
Как и в случае VAMP/ синаптобревинов, роль белков семейства синтаксинов в процессах секреции подверждается тремя линиями доказательств. 1) Гомологи синтаксина в дрожжах (белки Sso1, Sso2, Pep12, Sed5, T1g1p, T1g2p) необходимы для транспорта внутриклеточных везикул [24]. Белки Sso1 и Sso2 наиболее родственны нейрональным синтаксинам. 2) Ботулинический токсин серотипа С1, разщепляющий молекулы синтаксина, ингибирует высвобождение нейротрансмиттера. 3) Синтаксин взаимодействует с NSF и SNAP, белками, необходимыми для транспорта везикул через мембраны аппарата Гольджи [12].
2.3. SNAP-25
SNAP-25 принадлежит к семейству эволюционно консервативных белков, члены которого абсолютно необходимы для экзоцитоза. SNAP-25 был исходно обнаружен в синаптосомах. Белок локализуется в пресинаптической мембране, в связи с чем его, как и синтаксин, относят к t-SNARE.
В отличие от синаптобревина и синтаксина SNAP-25 не является интегральным мембранным белком. Молекулы SNAP-25 ассоциированы с мембраной, за счет жирнокислотных групп, модифицирующих остатки цистеина в центральной части молекулы [27]. В ходе альтернативного сплайсинга РИК образуются две нейронспецифичные изоформы SNAP-25, А и В, которые содержат аминокислотные замены в участке молекулы, вовлеченном в ассоциацию с плазматической мембраной. Эти изоформы имеют различные количественные и анатомические образцы экспрессии в нейронах при развитии мора, что указывает на возможность их участия в разных секреторных процессах.
Как и для описанных выше SNARE, на роль SNAP-25 в секреции указывают данные по осаждению этого белка на NSF/ SNAP аффинных сорбентах и деградации нейротоксинами [39].
До недавнего времени считалось, что SNAP-25 экспрессируется исключительно в нервной системе и нейроэндокринных клетках, таких как островки Лангерганса поджелудочной железы, хромаффинные клетки надпочечников, энтерхромаффинные клетки желудка. Однако экспрессия белка обнаружена также, хотя и в крайне малых количествах, в ограниченном наборе ненейрональных клеток, в частности скелетных мышцах и клетках жировой ткани [31]. Интересно, что оба указанных объекта содержат инсулин-зависимый транспортер глюкозы, GLUT 4. Транспортер находится во внутриклеточных везикулах, а при стимуляции клеток инсулином претерпевает транслокацию к плазматической мембране. SNAP-25 участвует в транслокации GLUT 4 по типу регулируемого экзоцитоза. Совсем недавно SNAP-25 обнаружен в ряде ненейрональных объектах, сперматозоидах морского ежа, где он принимает участие в акросомной реакции, и яйцеклетках мыши [28].
Если SNAP-25 действительно играет ключевую роль в процессах секреции, этот белок или его гомологи должны присутствовать во всех клетках, способных как к конститутивной секреции, так и к регулируемому экзоцитозу. Равичандран с сотрудниками клонировании новую изоформу SNAP-25, названную SNAP-23, которая демонстрирует 72 %-ную гомологию по аминокислотной последовательности со SNAP-25В. Изоформа была найдена во всех исследованных тканях крысы, в том числе мозге. В нейтрофилах человека также недавно было обнаружена экспрессия SNAP-23; причем белок, по-видимому, присутствует в этих клетках в двух изоформах, обозначенных SNAP-23А и SNAP-23В [37].
Распространение SNAP-23 в клетках и тканях указывает на возможность участия этого белка в конститутивной секреции, в то время как SNAP-25, по-видимому, требуется для регулируемой секреции.
2.4. NSF
NSF представляет цитозольный белок с молекулярной массой 76 кДа, обладающий АТФазной активностью. Молекула белка содержит в своем составе два АТФ-связывающих домена, которые необходимы для обеспечения процесса слияния мембран. Мутантные формы белка содержащие отдельные аминокислотные замены в АТФ-связывающих доменах, не способны катализировать гидролиз АТФ, что приводит к нарушениям в секреции [48]. АТФазная активность NSF индуцируется комплексом SNAP-синтаксин [9]. NSF выполняет универсальную функцию во всех клетках и требуется для слияния транспортной везикулы с самыми разными акцепторными мембранами как в ходе конститутивной, так и регулируемой секреции.
2.5. SNAP
Белки семейства SNAP являются цитозольными белками с молекулярной массой порядка 35-40 кДа, которые обеспечивают связывание NSF с мембранами, претерпевающими слипание/ слияние [48]. SNAP существует в тех изоформах, названных a-, b- и g-SNAP. Два из этих белков, a и g найдены в самых разных клетках и тканях, в то время как b-SNAP обнаруживается исключительно в мозге. a и g изоформы действуют совместно в процессах транспорта везикул между мембранами аппарата Гольджи, и оба эти белка требуются для оптимального связывания NSF с мембранами [45]. Однако следует отметить, что хотя оба белка прямо взаимодействуют с NSF, только a-SNAP, контактирует с мембранным рецептором (SNARE) [44].
Роль a и g изоформ универсальна, в то время как b-SNAP, выполняет какую-то специализированную функцию. Интересно при этом отметить, что синаптотагмин I, нейрон-специфичный белок, взаимодействует с b-SNAP, но не способен связываться с двумя другими изофорамами SNAP [45]. Вполне возможно, что это белок – белковое взаимодействие необходимо для осуществления нейросекреции.
2.6. Механизм слипания/ слияния мембран
Молекулярный механизм слипания/слияния мембран, SNARE гипотеза, предложенный исходно для слияния мембраны синаптической везикулы с пресинаптической мембраной [47], представлен на рис.2.1. Гипотеза носит универсальный характер.
Исходно, перед сборкой функционального белкового комплекса синтаксин связан с белком цитозоля n-sec1, а VAMP с мембранным белком везикулы, синаптофизином. Белки n-sec1 и синаптофизин предотвращают синтаксин и VAMP от ассоциации в другими SNARE и являются негативными регуляторами секреции. В ходе состыковки и слипания мембран n-sec1 ассоциирует от синтаксина, а синаптофизин от VAMP, что приводит к образованию SNARE комплекса (коэффициент седиментации 7s), состоящего из синтаксиса, SNAP-25, VAMP и синаптотагнина.
Синаптотагмин представляет собой обязательный компонент SNARE комплекса только в нейронах и некоторых клетках, способных к регулируемой секреции. SNARE комплекс является высокоаффиным рецептором для цитозольных белков NSF и a-SNAP. Присоединение к комплексу a-SNAP приводит к одновременному высвобождению из него синоптотагмина. NSF, обладающий АТФазной активностью, гидролизует АТФ.
Существование белковых комплексов, постулированных SNARE гипотезой, было продемонстрировано экспериментально, в частности, иммунопреципитацией из экстракта мозга [15]. SNARE комплексы, содержащие гомологи синтаксина, VAMP и SNAP-25 были обнаружены и выделены из дрожжей [47], хромаффинных клеток надпочечников [36], адипоцитов мыши [44].
Недавно были получены данные по взаимодействию in vivo – в аксонах и нейромышечных синапсах – синтаксина, SNAP-25 и VAMP [46].
Эксперименты по связыванию белков in vitro продемонстрировали существование бинарных комплексов с микромолярной аффинностью между VAMP и синтаксином, VAMP и SNAP-25, синтаксином и SNAP-25 [17].Некоторые из этих белок-белковых взаимодействий обнаруживают определенную селективность в отношении различных изоформ SNARE. Так, например, VAMP-1 связывается с синтаксинами 1 и 4, но не присоединяется к синтаксинам 2 и 3 [19]. Вполне возможно, что пативных клетках VAMP-1 посредством связывания с определенной изоформой синтаксина участвует в разных секреторных процессах. Не исключена и вероятность того, что указанные взаимодействия VAMP с синтаксином вообще не реализуются in vivo по причине крайне низкой аффинности белков. Добавление же в бесклеточную систему SNAP-25 значительно повышает сродство синтаксина к VAMP и приводит к созданию высокоаффинного комплекса [23]. Структурные изменения в молекулах SNARE были продемонстрированы in vitro при сборке и разборке тримерного комплекса [17].
В молекуле SNAP-25 синтаксин – связывющий домен занимает N-концевую половину молекулы. Синаптобревин – связывающий домен SNAP-25 расположен в С-концевой части молекулы.
Совсем недавно в литературе появились данные двух независимых лабораторий об обнаружении минимального «корового» комплекса SNARE, устойчивого к протеолизу, и идентификации фрагментов белковых молекул, достаточных для сборки функционального тримерного комплекса. Минимальный «кор» включает цитоплазматический домен VAMP/ синаптобревина, С-концевой фрагмент молекулы синтаксина, а также N- и С- концевые участки молекулы SNAP-25. N- и С-концевые фрагменты SNAP-25 могут функционировать как независимые домены и по отдельности связываться с VAMP и синтаксином с образованием стабильного комплекса [41].
SNARE гипотеза постулирует, что обязательным условием эффективного слияния мембран является наличие v- и t-SNARE на разных мембранах.
Согласно SNARE гипотезе, транспортная везикула узнает соответствующую акцепторную мембрану за счет специфического связывания мембранных белков везикулы (v-SNARE) с их строго определенными партнерами на акцепторной мембране (t-SNARE). NSF и SNAP, повсеместно распротраненные цитозольные белки, не являются факторами, определяющими специфичность слияния.
Специфичность, постулируемая SNARE гипотезой, позволяет объяснить присутствие в одной и той же клетке нескольких различных изоформ SNARE. Во-первых, изоформы могут участвовать в разных секреторных процессах. Например, отдельные гомологи синтаксина требуются для миграции транспортной везикулы из эндоплазматического ретикулума в аппарат Голджи, из Гольджи в плазматическую мембрану к вакуолям [15]. Во-вторых, одна и та же изоформа может функционировать в составе разных SNARE комплексов при объединении с разными белками и участвовать в разных секреторных событиях.
Вопрос о том, на какой стадии слияния мембран функционируют SNARE, представляется крайне важным для формирования целостного представления о механизмах секреции и факторах ее реализующих. Известно, что процесс Са²⁺-регулируемой секреции состоит из четырех основных стадий: 1) «рекрутирование» везикул, 2) «заякоривание»/ слипание везикул с плазматической мембраной, 3) «праймирование»/ подготовка везикул к слиянию с плазматической мембраной и, наконец, 4) Са²⁺-тримерное слияние мембран [2].
Ранее предполагалось, что SNARE комплекс образуется на стадии заякоривания и необходим для осуществления процесса слипания мембраны везикулы и плазмалеммой.
Эти исследования свидетельствуют о важной роли SNAP-25, VAMP и синтаксина в поздних стадиях экзоцитоза. Некоторые из SNARE идентифицированы в нейтрофилах человека. В настоящее время идентифицированы следующие SNARE белки: два белка семейства VAMP (VAMP-1 и VAMP-2), два белка семейства SNAP-25 (SNAP-25 и SNAP-23), и широкий набор белков семейства синтаксинов, а именно синтаксины 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 и 16. Выявлены две изоформы синтаксина 3: синтаксин 3А, идентичный ранее известному синтаксину 3, и новая изоформа, синтаксин 3В. Множественные изоформы SNARE белков идентифицированных в нейтрофилах человека, по-видимому, могли бы принимать участие в экзоцитозе разных типов гранул и, тем самым являться факторами, обеспечивающими селективный характер дегрануляции. Однако информация о взаимодействиях SNARE белков в этих клетках крайне неполная. Поэтому определенный интерес для установления молекулярных механизмов экзоцитоза представляет выяснение отдельных межбелковых SNARE-SNARE взаимодействий. Основной целью данной работы является выяснение взаимодействия синтаксина 6 с другими SNARE.

3. Методы
3.1. Объекты исследования
В настоящей работе объектом исследования являлись нейтрофилы периферической крови человека. В качестве контроля использовали экстракт мозга крысы, где присутствуют все нейтрон-специфичные SNARE.
3.2. Выделение нейтрофилов человека
Выделение нейтрофилов человека осуществляли по методу Моллинедо (Mollinedo F. et al., 1989). Клетки выделяли из 20 мл крови, взятой у здоровых доноров. Оставляли на 1-2 часа при комнатной температуре для седиментации эритроцитов. Верхний светлый слой суспензии отбирали и подвергали центрифугированию при 1200 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок, обогашенный лейкоцитами, ресуспендировали в 3 мл РВS, после чего суспензию наслаивали на 3 мл Ficoll/ Hypaque и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 40 мин. PBS содержит натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный в концентрации 0,02 моль/л, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный в концентрации 0,02 моль/л и натрий хлористый в концентрации 0,1 моль/л. Получали верхний слой (PBS), промежуточный слой (лимфоциты, моноциты, тромбоциты), нижний слой (Ficoll/ Hypaque) и осадок. Осадок, обогащенный нейтрофилами, суспендировали в 2 мл PBS, переносили в предварительно взвешенную центрифужную пробирку, добавляли 6 мл воды и инкубировали в течение 2 мин. При этом примесные эритроциты, присутствующие в осадке, будут разрушены в указанных условиях гипотонического лизиса, а нейтрофилы сохраняют свою целостность. По истечение времени инкубации осматическое давление восстанавливали добавлением 2 мл 3,6 % раствора NaCl, после чего нейтрофилы осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок взвешивали и определяли количество выделенных нейтрофилов из расчета, что 10⁶ клетки имеют вес 1,22 мг.
3.3. Электрофорез белков
Белковый состав препаратов оценивали при помощи диск-электрофореза в присутствии ДДС-Na по методу Леммли с модификациями. Использовали прибор для вертикального электрофореза (ячейка для электрофореза Mini-PROTEAN, BIO-RAD, Швеция). Разделение белков приводили в мини-гелях. В зависимости от молярной массы интересующего белка в качестве разделяющего геля использовали 12 % полиакриламидный гель, а в качестве концентрирующего – 6 % полиакриламидный гель. Растворы для гелей готовили согласно таблице:
Таблица 3.1.
Конечная концентрация веществ для приготовления гелей.
Разделяющий гель полимеризовали в течение 1 часа при комнатной температуре. О завершении полимеризации судили по появлению резкой границы между гелем и дистиллированной водой, которую наслаивали на разделяющий гель. По окончании полимеризации акриламида воду удаляли. В состав электродного буфера входили 0,025 М трис – HCl, рН 8,3; 0,191 М глицин, 0,1 % ДДС-Na. При приготовлении проб белка для электрофореза смешивали 3 объема раствора белка с 1 объемом 4-кратного буфера для приготовления проб. Буфер для приготовления проб содержит 62,5 мМ трис – HCl, рН 7,4, 2,5 % ДДС-Na, 12 % сахарозу, 1 % ДТТ. Перед электрофорезом пробу белка кипятили на водяной ванне 5 минут. Количество белка, наносимого на лунку, варьировали в зависимости от целей эксперимента. В качестве стандартов использовали окрашенные белки – маркеры LMW фирмы LKW (Швеция). Белки – маркеры: a-Лактальбумин – 14,4 кДа, Карбоангидраза – 30 кДа, Ингибитор Трипсина из сои – 20,1 кДа, Овалбумин – 43 кДа, Бычий сывороточный альбумин – 67 кДа, Фосфорилаза b – 94 кДа.
Электрофорез проводили в режиме: 10 мин при 25 В для вхождения белков в гель, а затем 1–1,5 ч при 120 В до начала выхода бромфенолового синего из геля.
После электрофореза гели либо окрашивали Кумасси R-250, либо подвергали иммуноблоттингу. В первом случае гели фиксировали в смеси метанол : уксусная кислота : вода (50:10:50), окрашивали 0,125 %-ным раствором Кумасси ярко голубого R-250 в смеси этанол : уксусная кислота : вода (50:10:40), удаляли фон в растворе этанол : уксусная кислота : вода (15:7,5:77,5) и хранили в 7 %-ной уксусной кислоте.
3.4. Иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг выполняли в три основных этапа: 1) фракционирование образца (см.3.3.), 2) перенос фракций на фильтр (собственно блоттинг), 3) иммунное выявление антигенов на фильтре.
3.4.1. Перенос фракций из геля на фильтр
Белки переносили из геля на фильтр электрофоретическим пометоду Тоубина с модификациями. Использовали нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Перенос осуществляли в приборе для переноса (BIO-RAD, Швеция) (рис.3.1), следуя протоколу фирмы.

Прибор для переноса белков (BIO-RAD, Швеция).
Рис.3.1.
В состав буфера для переноса входили 0,025 М трис – HCl, рН 8,3, 0,192 М глицин, 20 % метанол. Готовили «сэндвич», состоящий из последовательно уложенных друг на друга 1 листа фильтрованной бумаги, нитроцеллюлозы, гель и 1 листа фильтрованной бумаги. Такой «сэндвич» плотно зажимали между двумя губчатыми прокладками и помещали в камеру для переноса. Перенос проводили при комнатной температуре в режиме стабилизации по напряжению (100 В) в течение 1,5-2 часов.
По окончании переноса фильтр подвергали иммунному окрашиванию.
3.4.2. Иммунное выявление антигенов на фильтре
Иммунное выявление антигенов на фильтре выполняли по методу Тоубина с модификациями. По окончании электропереноса фильтр промывали в РВS (50 мМ трис HCl, рН 7,5, содержащий 150 мМ NaCl) в течение 5 мин, а затем инкубировали в РВS, содержащем 0,05 % Твина – 20 и 2 % сухого обезжиренного молока в течение 1 часа. Эта стадия необходима для блокирования свободных участков мембраны и предотвращения последующей неспецефической сорбции антител на эти участки. Фильтр отмывали 5 минут в Т-РВS (РВS, содержащий 0,05 % Твина – 20), а затем инкубировали с первичными антителами, взятыми в соответствующих разведениях в Т-РВS (1:1000), в течение ночи при 4 °С. Затем фильтр отмывали Т-РВS (3 раза по 10 минут) и инкубировали с биотинилированными антимышинными либо антикроличьими JgG, взятыми в разведении 1:1000 в Т-РВS, в течение 1 часа. От несвязавшихся иммуноглобулинов фильтр отмывали 3 раза по 10 минут в Т-РВS, а затем инкубировали с конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена, взятым в разведении 1:1000 в Т-РВS, в течение 1 часа. По окончании инкубации фильтр отмывали в Т-РВS 5 раз (первые две отмывки были по 15 минут, а три последние по 5 минут).
Мониторинг иммобилизованных антигенов проводили с помощью окрашивания в 10 % растворе диаминобензидина в 0,1% Т-РВS, содержащим 3% Н₂О₂.
3.4.3. Активация нейтрофилов
Выделенные нейтрофилы ресуспендировали в Hepes/ глюкозном буфере (10 мМ HEPES, рН 7,5, содержащий 150 мМ NaCl, 5 мМ КОН, 1,2 мМ MgCl₂, 1,3 мМ CaCl₂, 5,5 мМ глюкозы) до концентрации 1-3´10⁷ клеток/мл. Клеточную суспензию делили на аликвоты по 500 мкл., которые либо помещали в ледяную баню (для исследования антигенов в покоящихся клетках) либо подвергали воздействию агента, стимулирующего секрецию. В последнем случае клетки преинкубировали в 4b-форбол 12-миристат 13-ацетатом, взятым в концентрации 20 мг/мл при 37 °С в течение 10 мин., затем активированные и покоящиеся нейтрофилы подвергали процедуре иммунопреципитации.
3.4.4. Иммунопреципитация
В экспериментах по иммунопреципитации покоящиеся и активированные нейтрофилы (»10⁷ клеток) лизировали в 500 мкл лизисного буфера (20 мМ Т рис – НСl, рН 7,2, 100 мМ КСl, 0,9 % Тритон Х-100, 10% глицерол, 2 мМ ФМСФ). Лизаты подвергали центрифугированию при 18000 д (20 мин; 4°С) и отбирали супернатанты. Супернатанты (в составе которых имеются различные SNARE комплексы) подвергали иммунопреципитации. Антитела против VAMP-1, SNAP-25, SNAP-23 сорбировали на протеин А-агарозе (10-20 мкг антител на 100 мкл 20-%-ой протеин А-агарозы) 2 часа при 4 °С. Полученный афинный сорбент отмывали от несвязавшихся антител лизисным буфером, после чего инкубировали с лизатом нейтрофилов в течение носи при 4°С. По окончании инкубации агарозу осаждали и 3 раза промывали лизисным буфером, после чего добавляли 30 мкл буфера для приготовления образцов для электрофореза (62,5 мМ Т рис -–НСl, рН 6,8, 100 мМ дитиотрейтол, 2% SDS, 10% глицерол и 0,1 %, бромфеноловый синий) [5] и иммуноблотингу с использованием антител против синтаксина 6, а также VAMP-1, SNAP-25 и SNAP-23 (для контроля связывания АТ носителя с соответствующими компонентами SNARE комплексов).

4. Полученные результаты и их обсуждение
Задача настоящего исследования заключалась в исследовании особенностей функционирования белка синтаксина 6 в экзоцитозе внутриклеточных гранул нейтрофилов человека. К настоящему времени белок синтаксин 6 идентифицирован в нейтрофилах. Установлено, что синтаксин 6 присутствует в плазматической мембране клеток. Так в покоящихся нейтрофилах белок равномерно распределен по всей поверхности клетки, в то время как в нейтрофилах, подвергнутых стимуляции, происходит перераспределение синтаксина 6 и накопление белка в зонах интенсивной дегрануляции. Синтаксин 6 взаимодействует с другими SNARE in vitro. Ранее Равинчандраном с соавторами было обнаружено, что синтаксин 6 способен к взаимодействию с двумя изоформами SNAP-23 (SNAP-23A и SNAP-23B) [43]. Совокупность этих данных позволила заключить, что синтаксин 6, вероятно участвует в экзоцитозе гранул в качестве t-SNARE. Известно, что нейтрофилы человека содержат четыре типа гранул: азурофильные, специфические, секреторные и желатиназные гранулы, которые в разной степени способны претерпевать экзоцитоз. В настоящее время в нейтрофилах человека выявлены множественные изоформы ключевых белков SNARE комплекса: два белка семейства VAMP (VAMP-1 и VAMP-2), два белка семейства SNAP-25 (SNAP-25 и SNAP-23), и широкий набор белков семейства синтаксионов, а именно синтаксины 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9,11 и 16. Следовательно, вполне возможно, что множественные изоформы v- и t-SNARE требуются для обеспечения необходимой селективности при слиянии мембран в нейтрофилах. Таким образом, мы предположили, что в клетке при активации экзоцитоза определенного типа гранул формируются строго определенные SNARE комплексы. Мы попытались выявить и охарактеризовать синтаксин 6 – содержащие SNARE комплексы. Для решения этой задачи был использован экспериментальный подход, основанный на выделении из нейтрофилов человека SNARE комплексов при помощи иммунопреципитации на моноспецифических антителах, присоединенных к протеин А-агарозе и последующем иммунохимическом анализе белкового состава этих комплексов. Выделение SNARE комплексов осуществляли из покоящихся и активированных клеток. Выделение нейтрофилов проводили из свежей периферической крови человека при помощи седиментации эритроцитов, центрифугирования на Ficol/Hipaque и последующего гипотетического лизиса примесных эритроцитов. Выделенные клетки активировали с целью экзоцитоза внутриклеточных гранул. Известно, что нейтрофилы могут находиться как в покоящемся так и в активированном состоянии [8]. При активации резко увеличиваются основные функции нейтрофилов: защитные и воспалительные, за счет дегрануляции внутриклеточных гранул [1], а значит и способность к образованию SNARE комплексов [45]. Нейтрофилы активировали к экзоцитозу при помощи 4b-форбол 12-миристат 13-ацетата (ФМА) в концентрации 20 мг/мл. Из литературных источников известно о существовании большого количества активаторов нейтрофилов, в том числе и активаторов секреции. Так, в частности, секрецию можно индуцировать путем воздействия на клетку форболовых эфиров, хемотаксических пептидов (типа формил-метионил-лейцил-фенилаланина, FMLP), иммунных комплексов антиген/антитело и т.д. Причем, среди этих соединений выявляются индукторы способные вызывать экзоцитоз гранул только определенного типа. Так, например, (FMLP) хемотаксический пептид в концентрации 10^-7 М, при которой индуцируется экзоцитоз гранул. Известно, что активация нейтрофилов хемоаттрактантами сопровождается хемотаксином и изменениями формы клеток; клетки при этом становятся асимметричными вытянутыми, приобретают отростки, а лидирующий край клетки формирует зону, вовлеченную в дегрануляцию [5]. В данной работе мы использовали форболмиристатацетат (ФМА), так как он является индуктором экзоцитоза желатиназных и специфических гранул. А так как известно, что VAMP-1; VAMP-2 и SNAP-25, SNAP-23 локализованы в мембранах желатиназных/специфических гранул [8], поэтому был применен именно ФМА. Активацию проводили 10 минут при 37 °С при конечной концентрации индуктора 20 мг/мл, т.к. в этих условиях экзоцитоз происходит полностью. В качестве контроля браликлеточную суспензию, выдержанную в покое при +4°С, 10 мин. Затем активированные и покоящиеся нейтрофилы подвергали процедуре иммунопреципитации. При помощи иммунопреципитации, мы исследовали взаимодействия белков синтаксина 6 с VAMP-1, SNAP-25, SNAP-23. Для изучения взаимодействия синтаксина 6 с белком VAMP-1 было осуществлено осаждение на моноспецифических поликлональных, кроличьих антителах против VAMP-1 (Synaptyc Systems, Германия). Эти тела обладают высокой специфичностью а распознавании VAMP-1. Затем VAMP-1 иммуноприципитаты подвергали электрофорезу в присутствии ДДС-Na для разделения белков в полиакриламидном геле по их молекулярной массе и последующему иммуноблоттингу с применением моноспецифических моноклональных антител, против синтаксина 6. Результаты Иммуноблотинга показаны на рис.4.1. Видно, что в VAMP-1-иммунопреципитатах выявляется синтаксин 6. Таким образом, мы заключили что синтаксин 6 (белок плазматической мембраны, t-SNARE), способен in vivo к связыванию с мембранным белком секреторных гранул VAMP-1, v-SNARE. Сравнительный анализ иммунопреципитатов из покоящихся и активированных форболмиристатацетатом клеток показал, что содержание синтаксина 6 в иммунопреципитатах из активированных клеток значительно выше, чем из покоящихся нейтрофилов. Таким образом, бинарные взаимодействия синтаксина 6/VAMP-1, по-видимому, реализуются при экзоцитозе популяции желатиназных и специфических гранул нейтрофилов человека. Следуя схеме стратегии мы исследовали взаимодействие синтаксина 6 со SNAP-25 и SNAP-23 белками секреторных гранул нейтрофилов. Для этого мы использовали мноспецифические, моноклональные антитела против белка SNAP-23 (SMI 81, Sternberger Monoclonals Inc., США) и поликлональные антитела против SNAP-23. Из литературных данных известно, что в нейтрофилах человека, где присутствует две изоформы SNAP-23 (SNAP-23A и SNAP-23B), синтаксин 6 взаимодействует с обеими изоформами [43] in vitro. При помощи иммуноприципитации на моноспецифических антителах присоединенных к протеин А-агарозе, мы исследовали взаимодействия белков синтаксина 6 со SNAP-23 и SNAP-25. Затем иммуноприципитанты подвергали электрофорезу. Результаты электрофореза показаны на рис.4.2 и рис.4.3. Наши данные свидетельствуют, что взаимодействия синтаксина 6 с белками семейства SNAP-25 происходят и in vivo, т.е. интактных клетках.