В местах нахождения ламп на известняке образовались сизые пятна грибов, растущих по стенам, размеры пятен достигают полуметра, особенно сильно они развиваются если лампы установлены в нишах, за выступами породы, где плохая вентиляция. Грибы определены как представители рода Penicillium. Также под лампами обнаруживается так называемая "ламповая флора", в состав которой входят сине-зеленые, диатомовые водоросли и даже мхи.
В условиях карстового ландшафта существуют потоки вещества и энергии между наземными элементами ландшафта и глубинным карстом. Несмотря на это, пещерные местообитания характеризуются рядом специфических условий, существование которых должно приводить к изменениям характеристик экологической целесообразности жизнедеятельности организмов.
Прежде чем приступить к анализу экологических условий пещерных местообитаний, мы задали себе вопрос о путях возможной эволюции в пещерах. С одной стороны, это может быть "эволюция смерти", когда происходит выживание организмов, обладающих максимальной резистентностью, а структура сообществ при этом деградирует. С другой стороны, это может быть "эволюция жизни", когда происходят последовательные изменения, приводящие к формированию адаптированных видов, не похожих на наземные аналоги.
В первом случае таксономический набор пещерных видов не будет сильно отличаться от характерной зональной флоры и фауны. Второй случай реализуется, если под землей содержатся нетривиальные источники энергии, или экстремальные местообитания, или, если карст прошел длительную эволюцию, на последних стадиях которой связи с дневной поверхностью были ослаблены. Все три варианта имеют место, например, в реликтовых полостях на большой глубине в аридных регионах.
Переходя теперь конкретно к пещерам Пинеги, попробуем сформулировать: какие же именно факторы составляют специфичность пещерных местообитаний.
Во-первых, следует рассмотреть степень олиготрофности. Мы полагаем, что, несмотря на кажущуюся обедненность органическим веществом, пещеры Пинеги нельзя считать экстремально олиготрофными ландшафтами. Неглубокое залегание, сопровождающееся инфильтрацией, и ежегодное промывание паводками, говорит о том, что в пещеру постоянно попадают не только растворенные органические вещества, но целые фрагменты почвенных подстилок, а водотоки и паводки приносят живые организмы. То есть даже намытые паводковые глины содержат растворенную органику достаточную для поддержания микробных сообществ, сходных с сообществами минеральных горизонтов некоторых почв на поверхности. Что касается постоянного приноса высших организмов, то: в сифоне, соединяющем пещеры Китеж (Г-140) и Голубинский провал в зимнее время мы обнаруживали бокоплавов, характерных для большинства озер Беломорско-Кулойского плато, а в ручье пещеры Голубинский провал, опять же в зимнее время, были пойманы две лягушки.
Следующий фактор - гипсовая минерализация растворов. Было бы логично предположить, что она в первую очередь должна влиять на бактерий, так как клеточная мембрана при отсутствии ригидной клеточной стенки должна наиболее чувствительно реагировать на изменение осмотического давления. Однако, специальные эксперименты по выращиванию штаммов бактерий на среде с концентрацией сульфата близкой к предельному насыщению продемонстрировали, что гипс не оказывает существенного влияния на большинство компонентов микробного комплекса. Несколько снижается доля миксобактерий и скользящих бактерий, за счет которых увеличивается доля корне-подобных бактерий и актиномицет. При этом кардинальной перестройки сообщества не наблюдается. Позволим себе сделать предположение, что гипс ингибирует бактерий, образующих внеклеточную слизь, таких как миксобактерии и цитофаги.
Еще один возможный фактор, который, к сожалению, пока не поддается нашей оценке, - цикличность природных событий. Речь идет о многообразии циклов, происходящих на поверхности, таких как суточные, сезонные и годовые изменения. Безусловно, косвенным образом это отражается и на пещерах. Например, ежегодный весенний паводок играет роль "листопада" в пещерах, принося новые порции органического вещества, а зимой температура снижается на несколько градусов из-за того, что теплый воздух поднимается вверх, а холодный заходит через нижние входы. Однако, весьма вероятно, что непременным атрибутом функционирования наземных сообществ является ежегодное зимнее промерзание, во время которого реализуются фазы инициации следующего цикла живых организмов. Кроме того, не совсем ясно влияние проникающей солнечной радиации. Есть мнение, что это именно тот фактор, который влияет на синхронизацию многих далеких друг от друга биологических процессов. Очевидно, что в пещерах влияние солнечной активности сказывается в меньшей степени и преимущественно косвенным путем.
И, наконец, фактор, который мы признаем наиболее важным с точки зрения экологии пещерных местообитаний в районе Пинеги, - это температура. Все, без исключения, полученные нами данные говорят о том, что температура - лимитирующий фактор для биологических процессов в пещерах. Рассмотрим это на нескольких характерных примерах.
Пример первый - сульфатредуцирующие бактерии. Эти бактерии весьма распространены во всех озерах и болотах с гипсовой минерализацией. Доминирующим видом для Пинежского района мы считаем вид - Desulfotomaculum acetooxidans, выделенный из черных илов озера Ераськино и болот в районе пещеры Г-1. С того момента, как мы начали изучение пещерной микрофлоры, нам было не совсем понятно, почему в пещерных водоемах, где есть избыток сульфата и достаточное количество растворенной органики, необходимой для жизнедеятельности этих бактерий, бактериальной сульфатредукции не наблюдается. Однако посещение пещеры Пехоровский Провал в 1996 и 1997 годах позволило разрешить эту загадку. Следует отметить, что микроклимат ряда пещер Пинеги зависит от количества поступающей в них воды. По словам Е.В.Шавриной пещеры Пинеги - с "водяным отоплением". То есть во влажный год, когда под землю поступает большое количество теплой воды с поверхности, температура под землей на несколько градусов выше, чем в сухой год. Именно такую картину мы и наблюдали в пещере Пехоровский провал. Во влажном 1996 году температура воздуха в пещере колебалась между 7 и 10 ⁰С, а температура воды была около 12 ⁰С. Когда в июле мы спустились в пещеру, и прошли вдоль магистрального ручья, то почувствовали явственный запах сероводорода. Раскопав в нескольких местах глину на дне ручья, мы обнаружили характерные черные илы. Когда же мы посетили пещеру в более сухой 1997 год, то ни малейших следов сульфатредукции не обнаружили. При этом температура воздуха в пещере оказалось в районе 5-6 ⁰С, а температура воды 6-7 ⁰С. Впоследствии мы наблюдали за началом процессов сульфатредукции в начале мая в болоте на поверхности, и пришли к выводу о существовании лимитирующей температуры, ниже которой бактерии не развиваются. По "болотным" наблюдениям, она оказалась в районе 7⁰С, но, по-видимому, эти данные несколько занижены.
Следующий пример связан с разрушением растительных остатков сообществами грибов. Мы поставили простейший эксперимент, заключающийся в том, что бумажные фильтры помещались в чашки с образцами почвенной подстилки, из наземной почвы и из пещеры. Чашки инкубировались при разных температурах, имитирующих "теплые - наземные" и "холодные - пещерные" условия. По мере разрушения бумажных фильтров делались посевы на питательные среды для определения доминирующих видов грибов. И что же оказалось: несмотря на то, что почвенные и пещерные образцы содержат примерно одинаковый видовой состав грибов, часть грибов сохраняют жизнеспособность, но не вегетируют в холодных условиях пещер. Если в "теплых" условиях на первых стадиях сукцессии доминируют грибы Aspergilus niger и Pinicillium hirsutum, то в "холодных" условиях предпочтение получают виды Penicillium expansum и Penicillium auranthiogriseum. То есть под влиянием температуры из равных исходных условий формируются сообщества с различными преобладающими организмами. Пожалуй, наиболее "пещерным" видом грибов по данным, имеющимся у нас на настоящий момент, можно считать вид Penicillium viridicatum, который растет при достаточно низких температурах и даже формирует на глине микроколонии, похожие на выцветы гипса. Если в предсифонной части пещеры Голубинский Провал приглядеться к мелким белым пятнышкам на паводковой глине или провести по ним пальцем, а потом понюхать, то станет понятно, что эти пятнышки не что иное как микроколонии грибов. Но опять же мы называет этот вид "пещерным" не потому, что он не встречается на поверхности, а потому, что его доля в пещерных местообитаниях существенно возрастает.
Однако, в качестве специфики пещерных биоценозов нами обраружена холодовая адаптация у некоторых бактерий (акваспириллы и артробактеры). Эксперименты продемонстрировали, что популяции бактерий, набравшие биомассу при более низких относительно контроля температурах, приобретают способность вегетировать в более холодных условиях. То есть нижний предел их температурного интервала сдвигается в область более низких температур. При этом "закаливание" штаммов (то есть помещение культур в холодные условия на некоторое время) не влияет на их температурный интервал.
Пещера Яхалом была обнаружена в мае 2006 года, в зоне, предназначенной под расширение меловых карьеров. По чистой случайности на неё обратил внимание геолог, исследовавший грунтовые воды. Ничем не примечательная дырка в склоне горы, показалась ему не глубже 8 метров. Он рассказал о ней Малхаму, организации занимающейся исследованием пещер на территории Израиля. Пещера оказалась сюрпризом по своим масштабам и фауне. На сегодняшний день в ней картографировано 2.5 километра меловых ходов, найдено подземное озеро и обнаружена редчайшая микрофлора и фауна.
У Яхалома, есть две скверные особенности:
Первая - стены пещеры как снегом, покрыты белой пудрой. Пудра образуется из-за постоянной повышенной влажности и работы бактерий. В начале, её даже хотели назвать “Снежной”. Эта славная пудра проникает везде, как только ты попадаешь в пещеру.
Вторая особенность - это огромная влажность. В сочетании они образуют на теле грязевую маску. Но об этом всём удаётся забыть, когда попадаешь в главный зал и видишь прозрачную гладь подземного озера. Когда мы вышли в центральный зал, там уже работало несколько биологов. Озеро оказалось обитаемым, и в нём были обнаружены редчайшие разновидности подземных раков. Сейчас их пытаются идентифицировать и понять, являются ли они совершенно новым видом, или, возможно, это одно из трех мест в мире, где была обнаружена подобная разновидность. Раки живут в полной изоляции от внешней среды. Кормом для них служат хемотрофные бактерии. Те, в свою очередь, живут благодаря химическому синтезу диоксида углерода. Бактерии образуют тонкие пластинки на поверхности воды. По этим пластинкам можно судить об уровне подземных вод в последние десятилетия. Чрезмерное использование грунтовых вод сильно понизило уровень воды в пещере. Чётко виден уровень богатого осадками 91 года, когда вода была на 6 метров выше сегодняшнего. Ещё одна интересная особенность озера - это его высокая температура, видимо, озеро подпитывается из горячего источника.
 Обследование состояния Каповой пещеры и ее рисунков. Поверхностный геоморфологический маршрут и осмотр пещеры "Ташкелят": сбор информации о периферической зоне спелеосистемы. Гидрологические исследования: выявление сдвигов в гидрологическом режиме с 1983 г. Определение содержания тяжелых металлов в воде Голубого грота Каповой Микробиологические исследования: рекогносцировочная оценка антропогенного микробиологического загрязнения пещеры.
Материал и методы. Анализ проб воды Голубого грота Каповой пещеры проводился в лаборатории ВСЕГЕИ на содержание кадмия, цинка, свинца, меди. Микробиологические исследования образцов грунта, древесных остатков, минеральных натеков и воды: обсемененность образцов сапрофитными гетеротрофными микроорганизмами, растущими на богатой питательной среде, микрофлорой, выявляемой в обедненной среде Горбенко и среде на основе экстрактов исследуемого субстрата. Определялась обсемененность бактериями, растущими на среде Эндо, применяемой для энтеробактерий. Для выявления плесневых грибов, дрожжей и актиномицетов использовались соответствующие селективные питательные среды.
Результаты. Проведен микробиологический анализ 6 образцов грунта, 2 - древесных остатков, 1 - минеральных натеков и 1 - воды. Выявлена обсемененность грунта сапрофитными гетеротрофами. Микрофлора, не выявляемая на традиционной питательной среде, специфическая, по-видимому, истинно аутохтонная. Энтеробактерии отсутствовали во всех образцах, кроме грунта из "Зала Рисунков", что свидетельствует об отсутствии заметного антропогенного загрязнения. В трех пробах обнаружены микромицеты, плесневые грибы. Дрожжеподобные грибы выделены из образцов древесных остатков из "Зала Хаоса". Микробиологический мониторинг спелеосистемы необходим в силу лабильности ее экологического равновесия, которое может быть нарушено в случае массового проникновения посторонней микрофлоры, биогенных элементов и других экологически активных антропогенных факторов.
1.3 Факторы уязвимости пещер
Особенностью пещер является длительное время их образования (от тысяч до миллионов лет); они имеют разное происхождение, неодинаковую морфологию и характеризуются относительно стабильным режимом климатических параметров, устойчивостью происходящих в них процессов. В тоже время многие компоненты пещер отличаются повышенной ранимостью, у них почти полностью отсутствует способность восстанавливаться после интенсивного антропогенного воздействия (нагрузок). К сожалению, пещеры, в силу своей таинственности, необычности и слабой изученности являются местом постоянного паломничества разных слоев населения (чаще молодёжи). Повышает интерес к пещерам и широкая реклама наиболее посещаемых экскурсионных пещер. Неуправляемый поток посетителей и "исследователей", не вооруженных знаниями об особенностях и ценности пещер, не владеющих методами их научного изучения, способен вызвать гораздо большие изменения климата пещер, строения её элементов, изменение состава флоры и фауны, чем значительные природные катаклизмы на поверхности земли (такие, например, как четвертичное оледенение). При нерегулируемом посещении это воздействие особенно усугубляется в связи с ограниченными объемами пещер, как правило, однозначными маршрутами движения групп, постоянными местами отдыха, навески снаряжения, разбивки подземных бивуаков, приготовления пищи, складирования отбросов, отправления естественных надобностей. Результатом таких посещений является неизбежное нарушение эстетического состояния пещер и подземных ландшафтов, скопления отбросов и нечистот, закопчённые стены и потолки, задымление галерей, скопление экологически вредных веществ из оставленных сухих электрических элементов, отработанного карбида кальция (используется для заправки ацетиленовых фонарей), продуктов сгорания топлива и нефтепродуктов, затаптывание и захватывание натечных и кристаллических образований, выламывание их, т.е. совокупное биологическое, вещественное, химическое, эстетическое и климатическое загрязнение полостей. Следует особо подчеркнуть, что микрофлора и бактерии в пещерах развиты незначительно (по сравнению с внешними условиями) и приспособлены к практически стабильному климатическому режиму в мало изменяющихся фоновых гидрологических и гидрохимических условиях. Вследствие этого они не способны быстро видоизменяться и приспосабливаться к резкому изменению условий, не в состоянии перерабатывать большое количество привнесенной извне органики и минеральных веществ (часто для них непривычных), не имеют развитых защитных функций и потому не могут очищать окружающую среду пещер при загрязнении воды и отложений и выживать при конкурирующем размножении на отбросах поверхностных видов микроорганизмов. В результате, они вымирают при энергичном размножении поверхностных микроорганизмов и грибов. Пещеры имеют относительно стабильный режим протекающих в них процессов и кажутся хорошо изолированными от внешних воздействий. Тем не менее они достаточно хорошо связаны с поверхностью посредством множества трещин, пронизывающих карстовый массив, и узких ходов и каналов, функции которых (проводники воды, воздуха, снега и др.) из-за меняющихся условий на поверхности (вырубка леса, распашка территории, выпас скота, откачка воды из скважин, строительство плотин на внешних водотоках, разработка карьеров и др.) могут нарушаться. Это неизбежно приводит к изменению ранее установившихся равновесных условий в пещерах. Изменяются условия протекания различных процессов, режим обводнённости полостей, климат, условия обитания фауны и флоры, роста минеральных агрегатов, заполнения пещер отложениями и т.д. Потому в общем случае охранная зона пещер должна включать не только входное отверстие полости, но также по меньшей мере всю ту территорию над пещерой, которая оконтуривается сглаженной охватывающей линией с учетом всех выступающих частей на плане пещеры (или группы пещер). При оконтуривании пещер с подземными водотоками необходимо в охраняемую часть включать области питания этих водотоков (что, к сожалению, далеко не всегда возможно). Охраняемая зона является индивидуальной для разных видов и типов пещер и разрабатывается специалистами для каждого конкретного случая.
Кроме высокой чувствительности к изменению внешней среды, а также легкой ранимости и уязвимости пещер при вмешательстве человека в их внутреннюю среду отмечается и слабая способность пещер к адаптации к человеческому влиянию. Оно выражается в незначительной емкости (способность объекта переносить воздействия не разрушаясь) по отношению к человеку многих элементов пещерного ландшафта. Это выражается и в слабой способности к восстановлению нарушенных пещерных и карстовых ландшафтов.
Любая деятельность человека, приложенная к пещерам непосредственно или опосредованно, всегда негативно сказывается на состоянии их внутренней среды (человек чуждый элемент в среде и экосистеме пещер). Сама геологическая среда пещер (порода) достаточно устойчива к человеческому присутствию и в большинстве случаев (при некоторых ограничениях) может эксплуатироваться в довольно широких пределах (в данном случае под эксплуатацией понимаются в основном широкомасштабные посещения). По иному обстоит дело с климатом, гидрологией и экосистемами пещер.
Экосистемы формировались в течение весьма продолжительного времени, причем все изменения в пещерах происходили постепенно и в очень смягченной форме, чему способствовала существенная изолированность внутренних частей пещер от внешнего мира. Это позволяло организмам, населяющим пещеры, приспосабливаться к внешним изменениям среды, либо менять среду обитания. Изменения, происходящие в настоящее время, с геологической точки зрения, происходят мгновенно и никакие организмы не в состоянии приспособиться к ним, тем более такие консервативные как пещерные.
Посещение пещер изменяет многие их климатические параметры. Это особенно заметно при низких фоновых температурах в полостях. Факел тепла, выделяемый каждым человеком, изменяет температуру и влажность воздуха в непосредственной близости от него. Чем больше группа, тем больше влияние она оказывает на климат полости. Во многих случаях это не страшно. Но в пещерах с ажурными ледяными кристаллами и рисунками древнего человека влияние группы людей может оказаться существенным, а иногда и чрезвычайно сильным.
Пагубное влияние больших групп сказывается и на натечном и минеральном убранстве полостей. Чем больше группа, тем труднее ей управлять и тем большая вероятность того, что кто-нибудь сойдет с маркированной тропы и по незнанию растопчет что-нибудь на полу, потрогает или отломит сталактит или другой натек.
Водные объекты чувствительны к разного рода загрязнениям: бытовыми отходами и продуктами жизнедеятельности (особенно озера), отработанными батарейками и карбидом кальция. Это ведет не только ухудшению качества воды, но и губит жизнь населяющих их организмов.
Пещеры являются сложными природными системами с исторически сложившимися внутренними связями, которые служат не только цепями передачи внешних воздействий внутрь пещер, но и в обратном направлении. Системная взаимосвязь компонентов внутренней среды пещер в ответ на появление отдельных воздействий вызывает взаимосогласованные реакции всех элементов системы, различающиеся по своим масштабам. Это приводят к сдвигу ранее установившегося равновесия, которое может быть обратимым или нет. В последнем случае передача воздействия по цепи внутренних связей может сопровождаться различными явлениями: 1) цепной реакцией эффектов различного характера и интенсивности (например, обрушенный в ручей камень может запрудить поток; это может вызвать изменение направления его течения, промыву нового хода, что может нарушить сложившийся характер циркуляции воздуха); 2) аккумуляцией эффекта последовательных воздействий кратковременного характера (каждая группа оставляет немного отходов в каком-то месте пещеры, в результате через несколько лет зловонная свалка разрастается до неимоверных размеров); 3) кумулятивным эффектом (прокопанный ход в глыбовом завале приводит к возникновению новой системы циркуляции воздуха в пещере, что приводит к необратимым изменениям, например таянию всего многолетнего льда).
Мерой специфической уязвимости пещеры по отношению к определенному воздействию может служить её емкость, определяемая интенсивностью реакции системы (изменением компонента внутренней среды) в расчете на единицу (массы, энергии, силы и т.д.) приложенного воздействия. Допустимыми воздействиями на внутреннюю среду пещер являются такие, которые не выходят за пределы размаха естественных колебаний компонентов природной среды, так как вызываемый ими эффект обратим. Критическими по отношению к внутренней среде являются воздействия, превышающие допустимые и приводящие к необратимому сдвигу сложившегося равновесия и, в пределе, к разрушению цепей внутренних взаимосвязей системы (например, вытеснение и гибель фауны при внедрении в пещеру инородных химических веществ или биологических агентов).
Часто идет обсуждение вопроса об охране пещер без ясного представления о том, что и в каком случае подлежит охране. Полезным критерием для разных типов пещер является их энергетический уровень. Высокоэнергетические пещеры затапливаются по меньшей мере ежегодно и часто имеют значительный меженный сток. В таких пещерах русловые отложения хорошо сортированы, часто меняют форму и размеры; натеки редки, так как быстро повреждаются потоками. Ущерб в таких пещерах не накапливается. Среднеэнергетические пещеры проводят меньше воды и часто содержат материал поверхностного происхождения, привнесенный животными, ветром, гравитационными процессами. Вторичные образования - массивные натеки, отражающие избыточное насыщение водами, но условия еще слишком активны для роста тонких кристаллических образований. Эти пещеры накапливают ущерб, но он может маскироваться случайными паводками и переотложением осадков. Низкоэнергетические пещеры - чрезвычайно спокойные. Падение капли воды - важное событие. Вторичные образования очень деликатны, растут целиком за счет кристаллизационных сил. Эти пещеры высокочувствительны к ущербу и не обладают способностью к самовосстановлению. Все три типа энергетичности могут быть встречены в одной пещере.
Уязвимость и ранимость пещер заставляют по особому относиться к их охране. Причём индивидуальность пещер, т.е. специфические черты их строения, особенности процессов, происходящих в них, а также возможности необычных находок в них в будущем требуют индивидуального подхода к охране каждой конкретной полости. Это, в свою очередь, заставляет говорить о необходимости их всестороннего изучения.
1.4 Микрофлора почвы
Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов в природе, которые принимают активное участие в процессах формирования и самоочищения почвы, а также в круговороте веществ в природе (азота, углерода, серы, железа и других соединений). Почва формируется из горных пород, разрушающихся под действием ветра, воды, живых организмов, и из органических соединений, образующихся в результате гибели растений и животных. Разнообразные микроорганизмы почвы обитают в водных и коллоидных пленках, которые как бы обволакивают почвенные частицы. Широко осуществляется передвижение и расселение почвенных подвижных бактерий по гифам грибов, вокруг которых так же обнаруживаются микроскопические тонкие пленки.
Качественный состав микрофлоры почвы очень разнообразен: множество видов бактерий (преимущественно спорообразующих), актиномицет, спирохет, архебактерий, простейших, сине – зеленых водорослей, микоплазм, грибов, вирусов. Состав и соотношение между различными группами микроорганизмов изменяются в зависимости от вида почвы, способ ее обработки, содержание органического вещества, влаги, от климатических условий и многих других причин. Так, в песчаных почвах, хорошо аэрирующихся, преобладают аэробные микроорганизмы, а в глинистых, влагоемких, в которых проникновение кислорода затруднено, живут в основном анаэробы.
Микроорганизмы находятся в сложном биоценозе, характеризующимся антагонистическими и симбиотическими взаимоотношениями, как между собой, так и с растениями. В самой почве идет непрерывная борьба за существование, конкуренция за питание, кислород и т. Д. Нередко жизнедеятельность одних групп бактерий подавляется действием антибиотических веществ и бактериоцинов, выделяемых другими группами.
Живая масса микроорганизмов в почве на 1 га в среднем составляет около 1000 кг. Численность микроорганизмов подвержена сезонным колебаниям: весной число особей увеличивается, достигая максимума к лету, в разгар лета уменьшается, по-видимому, в результате наиболее активного воздействия солнечных лучей, осенью опять увеличивается и снижается зимой.
Распределение микробов в почве неравномерно. На поверхности и в слое толщиной 1–2 мм относительно мало микробов, несмотря на постоянное обсеменение почвы, что объясняется губительным действием ультрафиолетовых лучей солнца и высушиванием. Наиболее обильна микрофлора на глубине 10–20 см. В этом слое протекают основные биохимические процессы превращения органического вещества, обусловленные жизнедеятельность разнообразных микроорганизмов, последовательно сменяющих друг друга. В более глубоких почвенных слоях флора становится скудной и на глубине 4–5 м микроорганизмы обнаруживаются очень в малых числах. В составе микрофлоры почвы принято выделять так называемые физиологические группы микроорганизмов, которые участвуют в различных процессах и на разных этапах постепенного разложения органических веществ(Кочемасов, Ефремова, 1987).
1. Бактерии – аммонификаторы, являющиеся гнилостными микроорганизмами, вызывают гниение остатков растений. Трупов животных, разложение мочевины – B.suptilis, B. Mezentericus, Serratia marcescens бактерии рода Proteus; грибы рода Aspergillus, Мucor, Рenicillium; анаэробы - C. Sporogenes, C. putrificum ; уробактерии - Urobacillus pasteuri Sarcina urea, расщепляющие мочевину.
2. Нитрифицирующие бактерии: Nitrosomonas и Nitrobacter. Nitrosomonas обладают способность окислять аммиак (образующий как результат жизнедеятельности аммонифицирующих бактерий) до азотистой кислоты, образуя нитраты. При деятельности Nitrobacter азотистая кислота окисляется до азотной и превращается в нитраты.
3. Азотфиксирующие бактерии. Клубеньковые и свободноживущие азотфиксирующие бактерии обладают исключительной способностью усваивать из воздуха атмосферный азот и в процессе жизнедеятельности образуют из молекулярного азота белки и другие органические соединения азота, которые используются растениями.
4. Бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды брожения, наблюдаемые при разложении микробами органических соединений углерода (молочнокислое, спиртовое, маслянокислое, уксусное, пропионовокислое, ацетонобутиловое и др.).
5. Бактерии, учавстывующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов – серобактерии, железобактерии и т. д., разнообразные виды которых осуществляют окисление и восстановление этих соединений в природе.
Следует помнить, что микроорганизмы могут выполнять различные физиологические функции, поэтому такое выделение групп условно, к тому же процессы, протекающие в почве, всегда взаимосвязаны, последовательность, направление, темпы их развития зависит от условий окружающей среды (Кочемасов, Ефремова, 1987).

1.5 Санитарно-микробиологический анализ пещер
Санитарная микробиология изучает микрофлору окружающей среды (воды, воздуха, почвы, продуктов и предметов обихода) и ее влияние на здоровье человека.
Эта наука представляет собой смежную с эпидемиологией и гигиеной области медицинской микробиологии. Основные санитарно – микробиологические методы включают в себя как оригинальные методики, так и методы общей и медицинской микробиологии, направлены на определение общей микробной обсемененности (общее микробное число); обнаружение и титрование санитарно – показательных микробов (СПМ); выявление патогенных микроорганизмов и их метаболитов; определение степени недоброкачественности изучаемых объектов, обусловленной наличием микроорганизмов(Кочемасов, Ефремова, 1987).
1.5.1 Санитарно – микробиологическое исследование почвы (грунта)
Попавшие в почву представители нормальной микрофлоры человека и животных, а также патогенные микроорганизмы обычно длительно не выживают. Однако многие представители нормальной микрофлоры человека способны включать способны включаться в состав биоценоза почвы, а отдельные виды остаются постоянными обитателями. На сроки выживания патогенных бактерий в почве влияют состав и тип почвы, температура, влажность, атмосферные осадки, степень загрязненности, а также ее характер (органическое, микробное или химическое загрязнение). Патогенные микроорганизмы, обнаруженные в почве, разделяют на три группы:
1. Патогенные микроорганизмы постоянно обитающие в почве (например Clostridium botulinum, возбудители подкожных микозов, виды Acinomyces, некоторые возбудители микотоксикозов).
2. Спорообразующие патогенные микроорганизмы. Бактерии попадают в почву с выделениями человека и животных, а также с трупами погибших животных. При благоприятных условиях они могут размножаться и сохранятся в виде спор длительное время.
3. Патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с выделением человека и животных и сохраняющиеся сравнительно недолго (в течение нескольких недель или месяцев). Это различные неспоровые бактерии (Salmonella, Shigella, Vibrio, Brucella, Fracisella, Mycobacterium, Leptospira, Pseudomonas, энтеровирусы, вирус ящура).
Оценку санитарного состояния почв проводят с учетом комплекса показателей: подсчитывают общее количество сапрофитных микроорганизмов и определяют наличие санитарно – показательных микроорганизмов. Высокая численность сапрофитной микрофлоры свидетельствует об органическом загрязнении, при микробной контаминации преобладают санитарно – показательные микроорганизмы. При необходимости также исследуют состав нитрифицирующих и аммонифицирующих бактерий, актиномицетов, грибов, целлюлозолитических микроорганизмов и др. (Нетрусов , 2005).
1.5.2 Сапрофиты как показатели органического загрязнения грунта пещеры
Сапрофиты гетеротрофные организмы, которые непосредственно от других организмов не зависят, но нуждаются в готовых органических соединениях. Они используют продукты жизнедеятельности других организмов или разлагающиеся растительные или животные ткани. К сапрофитам относится большая часть бактерий. Степень требовательности к субстрату у сапрофитов весьма различна. В эту группу входят организмы, которые могут расти только на достаточно сложных субстратах (молоко, трупы животных, гниющие растительные остатки), т.е. им нужны в качестве обязательных элементов питания углеводы, органические формы азота в виде набора аминокислот, пептидов, белков, все или часть витаминов, нуклеотидов или готовые компоненты, необходимые для синтеза последних (азотистые основания, пятиуглеродные сахара.) Чтобы удовлетворить потребности этих гетеротрофов в элементах питания, их обычно культивируют на средах, содержащих мясные гидролизаты, автолизаты дрожжей, растительные экстракты, молочную сыворотку.
Существуют гетеротрофы, нуждающиеся только в одном источнике углерода. Им может быть какой либо сахар, спирт кислота или другое углеродсодержащее соединение. Описаны бактерии из рода pseudomonas, способные использовать в качестве единственного источника углерода и энергии любое из 200 различных органических соединений, и бактерии, для которых источником углерода и энергии может служить узкий круг довольно экзотических органических веществ. Например bacillus fastidiosus может использовать только мочевую кислоту и продукты ее деградации, а некоторые представители рода Clostridium растут только в среде, содержащей пурины. Использовать другие органические субстраты для роста они не могут. Биосинтетические способности этих организмов развиты в такой степени, что они сами могут синтезировать все необходимые им углеродные соединения.
Особую группу гетеротрофов, обитающих в водоемах, составляют олиготрофные бактерии, способные расти при низких концентрациях в среде органических соединений. Организмы, предпочитающие высокие концентрации питательных веществ, относят к копиотрофам. Если у типичных копиотрофов оптимальные условия для роста создаются при содержание в среде питательных веществ в количестве примерно 10 г/л, тот для олиготрофных организмов – в пределах 1 – 15 мг углерода/л. В средах с более высоким содержанием органических веществ такие бактерии, как правило, расти не могут и погибают.
Различия между гетеротрофами с высокими потребностями в готовых органических и теми, потребности которых минимальны и сводятся, как правило, одному какому – нибудь органическому источнику углерода, заключаются таким образом, в степени развития их биосинтетических способностей (Кочемасов, Ефремова, 1987).

Глава 2 Объекты и методы исследования
2.1 Объекты исследования
Объектом исследования являлась пещера Баскунчакская.
Пещера представляет собой горизонтальный двух-, трехъярусный лабиринт по характеру морфологии условно делимый на три части: Основную Галерею - северо-восточную, самую крупную от входа №1,Вертикальный Шкуродер – узкий меандр от входа № 3 и Лабиринт, соединяющий первые две части. Обвальные залы и галереи шириной в несколько метров с четко выраженной на стенах ярусностью местами имеют высоту до 10 м. В целом сухая, пещера имеет два сифона: один – в лабиринтовой части, вбирающий временный водоток из тальвега, второй – в виде озера диаметром около 4 м, из которого периодически появляется водоток в Основную Галерею. Это озеро-сифон единственным доступным источником питьевой воды (проведен химический анализ) как в пещере, так и на несколько километров в окрестности. Пещера Баскунчакская является наиболее крупной подземной карстовой формой Прикаспийской низменности. Начало формирования пещеры относится к концу позднехвалынского времени, то есть примерно 6 тысяч лет назад. На протяжении этого времени в полости четыре раза существовал достаточно мощный водный поток, что на фоне вертикальных движений, обусловленных солянокупольной тектоникой, привело к формированию нескольких уровней и отразилось в морфологии поперечных профилей ходов в некоторых частях пещеры. В Баскунчакской пещере можно наблюдать разнообразные карстовые формы: желобковые и лунковые кары, закарстованные трещины, гипсовые ножи. Турбулентные потоки, некогда имевшие здесь место, создали на некоторых участках пещеры своеобразные останцовые формы, морфологически сходные со сталагнатами. В зимнее время в определенных местах пещеры образуются ледяные сталагмиты (Белононич, Цой , 1998).
Первая проба была отобрана возле горизонтального шкуродера на глубине 20-25 см.
Вторая проба была отобрана в галерее входа №2 на глубине 10-15 см.
Третья проба в галерее входа №3 на глубине 10-15 см.
Четвертая проба была отобрана в главной Галереи на глубине 10 – 15 см.
Пятая проба была отобрана в начале вертикального шкуродера.
Шестая проба была отобрана в лабиринтовой части пещеры.
Седьмая проба отобрана в галерее входа №2.
Восьмая проба отобрана в грязевом сифоне.
Девятая проба отобрана в районе горизонтального шкуродера.
2.2 Методы исследования
2.2.1 Методы отбора проб
Почвенный образец берут стерильным буром, стерильной лопаткой и стерильным ножом в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную банку, закручивающуюся пробкой, обернутой стерильной ватой, либо в стерильные полиэтиленовые или пергаментные мешки. На пакеты, банки наклеивают этикетки с указанием места взятия проб, горизонта и других сведений. Бур, лопату и нож перед взятием образца тщательно очищают, затем обжигают горящим спиртом (Теппер ,1987).
Почвенные образцы анализируют в первые сутки. В случае необходимости допускается хранение их в холодном помещении (в холодильнике) в течение двух дней. Для большей однородности среднего образца, соблюдая все правила асептики, его тщательно перемешивают, вынимают корни растений, различные включения (Теппер ,1987).
Для дальнейшего исследования отобранных проб, предварительно необходимо произвести стерилизацию микробиологической посуды и сред, используемых в последующей работе.
2.2.2 Методы стерилизации
Стерилизация или обеспложивание (от лат. sterilis - бесплодный), это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и пр.
Известно несколько методов стерилизации. Чаще всего применяют стерилизацию нагреванием.
1. Фламбирование, или прокаливание.
Прокаливать можно непосредственно перед употреблением платиновые петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, ланцеты, пинцеты), а также стеклянные палочки, предметные, покровные стекла и т.д.
 2. Стерилизация сухим жаром
Ее применяют для обработки посуды и сухих материалов. При этом стерилизуемый объем выдерживают при170◦C в течение 2 часов в печи Пастера или в электросушильных шкафах. Перед стерилизацией стеклянную посуду закрывают ватными пробками и обертывают бумагой. Чашки, пробирки, пипетки, заворачивают в бумагу или помещают в особые футляры и пеналы, в которых посуда может хранится после стерилизации (Теппер,1987).
3. Стерилизация текучим паром.
Текучим паром (100◦C) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (среды с углеводами, МПЖ, молоко), Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха по 30 мин. в течение 3 суток ежедневно. Такая стерилизация называется дробной.
4.Стерилизация насыщенным паром под давлением.
Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые ссоры. С его помощью стерилизуют большинство питательных сред, посуду.
Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающимся толстостенном котле – автоклаве. (Теппер,1987).
2.2.3 Приготовление почвенной суспензии и посев. Приготовление разведений
Численность популяций микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физрастворе. В ходе опыта целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10, что уменьшает вероятность ошибки.
Для приготовления разведений стерильную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды - это 1-е разведение, 10ˉ№. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1мл полученной суспензии и переносят во 2-ю пробирку - получают 2–е разведение. Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведений зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов; соответственно она тем больше, чем больше плотность популяции.
Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата (Методические указания по количественному учету микроорганизмов, 2004).
 Техника посева. В чашки Петри посевы могут быть произведены двумя способами: глубинным посевом или рассевом по поверхности питательной среды. При первом методе в стерильную чашку Петри вносят или исследуемую воду, или разведение грунта, или разведения культуры и заливают расплавленным и охлажденным до 40-45◦C агаром. Как при внесении посевного материала, так и при заливании его агаром крышка чашки Петри приподнимается как можно меньше (Родина ,1965).
2.2.4 Учет микроорганизмов на плотных средах
После инкубации засеянные среды вынимают из термостата и в них подсчитывают число колоний.
При подсчете колоний на богатых плотных питательных средах (МПА, МПА+сусло-агар, КАА, сусло-агар, среда Чапека, Среда Эшби и т.д.) закрытые чашки Петри просматривают в проходящем свете и с внешней стороны их колонии отмечают маркером. Если на чашке больше 200 колоний, то их можно подсчитывать с помощью камеры Вольфюгеля. Учет микроорганизмов на МПА делают визуально на четвертый день после посева, проводя микроскопирования и подсчитывая ОМЧ (Теппер,1987).
2.2.5 Приготовление окрашенных препаратов
Обработка предметного стекла. Прежде чем приступить к приготовлению микроскопических препаратов необходимо предметные и покровные стекла, Они должны быть чистыми и обезжиренными. Доказательства хорошего обезжиривания является равномерное распределение капли воды на их поверхности (Асонов 1989).
Приготовление мазка. Мазок готовят на предметном стекле при помощи микробиологической петли или пастеровской пипетки. Мазки готовят из культур микробов, выращенных на плотных или жидких питательных средах. Петлю нагревают до покраснения. Над пламенем горелки открывают пробирку, внутрь ее вводят петлю. Охлаждают, после чего петлей соприкасаются с культурой, которую затем тонким слоем наносят на поверхность предметного стекла. При изготовлении мазков из плотных субстратов или агаровых культур на поверхность стекла вначале наносят каплю стерильной воды. Мазок фиксируют над пламенем горелки (Асонов 1989).
2.2.6 Техника окраски по Граму
На хорошо обезжиренное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 мин метилвиолетом. Сливают краситель и, не промывая препарат водой, наносят на него раствор Люголя на 1 мин (до полного почернения мазка). Препарат, на промывая водой, обрабатывают,96%-ным спиртом в течение 15-20 с. Время обесцвечивания очень существенно, при превышении указанного срока обесцвечивается и грамположительные клетки, при недостаточным сроке обработки препарат окажется перекрашенным. Промыв препарат водой, его окрашивают фуксином в течение 1 мин (Теппер 1987).
После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные имеют только цвет дополнительной окраски (фуксина).
Результаты окраски по Граму зависят от возраста культуры: в старых культурах клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры (Теппер 1987).
Определение бактерий группы кишечных палочек
При исследовании почв на присутствие БГКП рекомендуется применение титрационного метода при предполагаемой невысокой степени фекального загрязнения, метод мембранных фильтров используется при анализе малозагрязненных почв. При высокой степени фекального загрязнения рекомендуется делать прямой посев почвенной суспензии (1: 10) на среду Эндо.
Титрационный метод. Из приготовленных разведений почвенной суспензии делают посевы во флаконы и пробирки с жидкой питательной средой Кесслера – 10 мл (из разведения 1:10) – в 50 мл среды, по 1 мл из последующих разведений – в 9 мл среды. Посевы инкубируются в течение 48 ч при температуре 37⁰С. При отсутствии во флаконах и пробирках роста, характеризующегося газообразованием и помутнением, дается отрицательный ответ об отсутствии БГКП.
Если в засеянных сосудах обнаруживается рост в виде помутнения среды или помутнения и газообразования, следует сделать высев в чашки Петри со средой Эндо или в пробирки с розолововым агаром, инкубировать 24 ч при температуре 37 ⁰С . Дальнейшей идентификацией (аналогично определению БГКП в воде) подвергаются типичные для эшерихий красные или розовые с металлическим блеском колонии на среде Эндо, а также желтые или оранжевые колонии на розоловой среде. Результат выражается в коли – индексе, т. Е. количество БГКП, обнаруженных в 1 г почвы.

Глава 3 Результаты исследования
В ходе работы было проведено микробиологическое исследование образцов грунта пещеры Баскунчакская. Для выделения бактерий, дрожжей и грибов, представляющих естественную микрофлору пещеры, использовались среда МПА, Чапека и Сабуро. Учет численности проводился через 48 часов на МПА и через неделю на Чапеке и Сабуро. Для учета санитарно – показательных микроорганизмов (бактерий группы кишечная палочка) использовался бродильный метод. Посев осуществлялся со среды Кесслера на среду Эндо, учет результатов проводился через 2 суток культивирования при температуре + 37 ⁰С. Учитывались окрашенные в красный цвет колонии, состоящие из грамотрицательных, оксидазоотрицательных палочек.
Таблица №1
Численность сапротрофной микрофлоры в пещере Баскунчакская.

Проба		численность	Культуральные признаки колонии	Морфологические признаки		Предполагаемое название рода
Горизонтальный шкуродер		7,5∙107	Форма колонии амебовидная, профиль колонии: бугристый, край волнистый, поверхность: шероховатая. Размер колонии средний, оптические свойства: не прозрачная. Цвет: белый, структура колонии: однородная, консистенция: сухая	Споровые палочки Г «+»		Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии: бугристый, край волнистый, поверхность: шероховатая. Размер колонии средний, оптические свойства: не прозрачная. Цвет: белый, структура колонии: однородная, консистенция: сухая	Споровые палочки Г «+»		Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии: бугристый, край волнистый, поверхность: шероховатая. Размер колонии средний, оптические свойства: не прозрачная. Цвет: белый, структура колонии: однородная, консистенция: сухая		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии бугристый, край колонии волнистый, поверхность гладкая. Размер крупный, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная Консистенция слизистая.		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии бугристый, край колонии волнистый, поверхность гладкая. Размер крупный, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная Консистенция слизистая.		Споровые Палочки  Г «+»,	Bacillus
Галерея входа № 2		9,1∙106	Форма колонии круглая с валиком, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая. Размер средний, оптические свойства не прозрачная. Цвет белый, структура колонии однородная, консистенция сухая.		Споровые палочки, Г «+»	Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер средний, оптические свойства не прозрачная. Цвет серый, структура колонии однородная, консистенция сухая		Споровые Палочки  Г «+»,	Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии: бугристый, край волнистый, поверхность: шероховатая. Размер колонии средний, оптические свойства: не прозрачная. Цвет: белый, структура колонии: однородная, консистенция: сухая		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
Проба	численность		Культуральные признаки колонии		Морфологические признаки	Предполагаемое название рода
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет грязно белый, структура колонии однородная, консистенция сухая		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
			Форма колонии не правильная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность гладкая, размер средний, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция слизистая.		Палочки со спорами Г «+»	Bacillus
Галерея входа № 3	7,05 ∙106		Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер средний, оптические свойства не прозрачная. Цвет серый, структура колонии однородная, консистенция сухая		Споровые палочки  Г «+», споры	Bacillus
			Форма колонии сложная, профиль колонии бугристый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая. Размер средний, оптические свойства не прозрачная. Цвет оранжевый, структура колонии однородная, консистенция сухая.		Споровые  палочки Г «+»	Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии бугристый, край колонии волнистый, поверхность гладкая. Размер крупный, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция слизистая.		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет грязно белый, структура колонии однородная, консистенция сухая		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
Главная Галерея	5,2 ∙106		Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер крупная, оптические свойства матовая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция сухая		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
Вертикальный шкуро-дер	1,7 ∙106		Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность шероховатая, размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет грязно белый, структура колонии однородная, консистенция слизистая.		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность: гладкая, размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет белая, структура колонии однородная, консистенция сухая.		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
Лабиринт	1,05 ∙106		Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность гладкая, размер крупная, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция слизистая.		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
			Форма колонии круглая, профиль колонии выпуклый, край колонии: гладкий, поверхность гладкая. Размер средний, оптические свойства блестящая. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция слизистая.		Споровые палочки Г «+»	Bacillus
			Форма колонии амебовидная, профиль колонии изогнутый, край колонии волнистый, поверхность гладкая. Размер крупная, оптические свойства не прозрачная. Цвет бежевый, структура колонии однородная, консистенция сухая.		Споровые палочки Г «+»	Bacillus