Лекция на тему Репликация различных ДНК ее регуляция и репарация
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2014-12-17Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
Лекция 3. Репликация различных ДНК и ее регуляция и репарация
Уотсон и Крик предположили, что для удвоения ДНК должны произойти разрыв водородных связей, удерживающих вместе спиральный дуплекс, и расхождение цепей. Они также высказали мысль, что каждая цепь дуплекса служит матрицей при синтезе комплиментарной цепи и в результате образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской. Уотсон и Крик предполагали, что репликация ДНК осуществляется спонтанно, без участия ферментов, но это оказалось неверно. Тем не менее идея о том, что удвоение ДНК происходит путем последовательного соединения нуклеотидов в соответствии с правилом комплиментарности, заданным каждой цепью спирали, разрешила концептуальную проблему точного воспроизведения генов.
С того времени как было высказано это предположение, матричная природа механизма репликации была подтверждена многочисленными данными, полученными как in vitro так и in vivo для различных организмов. Согласно модели репликация всех двуцепочечных ДНК полуконсервативна. Доказательство полуконсервативного механизма было получено в1958 г . учеными Мезельсоном и Сталь(ем). Сначала они выращивали бактерий длительное время на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (15N), который включался в ДНК, а затем переносили их на среду, содержащую обычный легкий изотоп азота (14N). После репликации дочернюю ДНК первого поколения фракционировали по плотности. Оказалось, что вся дочерняя ДНК однородна и имеет плотность, промежуточную между плотностью тяжелой и легкой ДНК. Следовательно, одна цепь молекулы дочерней ДНК содержала 15N, а другая 14N, что отвечает полуконсервативному механизму. Существуют ли в природе альтернативные способы репликации двуцепочечной ДНК (консервативный и дисперсный) – неизвестно. Итак, после одно раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних ДНК является родительской, т.е. консервативной, а другая – синтезированной заново.
Репликация одноцепочечной ДНК у вирусов. Если геном представлен одноцепочечной ДНК (как у некоторых вирусов), то эта единственная цепь служит матрицей для образования комплиментарной цепи, с которой она образует дуплекс, а затем на этом дуплексе синтезируются либо дочерние дуплексы, либо одноцепочечные копии одной их матричных цепей. Репликация генетического материала вируса осуществляет обычно с участием ферментов клетки-хозяина. На некоторых молекулах вирусной ДНК синтезируются также ее ДНК-копии – с помощью либо клеточной, либо кодируемой вирусом ДНК-полимеразы. Эти ДНК-копии используются в последствии при сборке вирусных частиц. Репликация ДНК вирусов происходит либо в ядре клетки-хозяина (вирус герпеса), либо в цитоплазме (поксвирусы).
Репликация у прокариот. Редупликацию ДНК (процесс, при котором информация, закодированная в последовательности оснований молекулы родительской ДНК, передается с максимальной точностью дочерней ДНК) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-углеродом дезоксирибозы. Следовательно, к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении 5'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.
Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.
Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-полимераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 кДа, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.
Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизомеразы». (прозрачка 6) в точке начала репликации – ori (origin – начало репликации).
Структура точек начала репликации. Фрагменты ДНК, несущие точку начала репликации выделены из E.coli и некоторых плазмид, а также из дрожжей и ряда эукариотических вирусов. В некоторых случаях место начала репликации имеет такую нуклеотидную последовательность, что дуплекс принимает необычную конфигурацию, колторую распознают белки, участвующие в инициации. Природа взаимодействия между точкой начала репликации и белками и механизм инициации в целом исследованы мало.
Итак, топоизомераза продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимераза, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)
Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-полимераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему («танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).
Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».
Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...
Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК тандем геликаза-ДНК-связывающие белки — ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топоизомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а геликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» — по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место — ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией — около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).
Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5'-концу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3'— 5', считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).
Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», — ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные» дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед.
Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5'—3' экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.
рибонуклеаза Н
ДНК-полимеразаII
Рис. 28
Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений.
Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме (см. ниже).
Более сложная модель движения репликативной вилки предполагает формирование реплисомы – мультиферментного комплекса более высокого уровня организации. Этот комплекс состоит из функционального праймосомо-праймазного комплекса, геликазы, полимеразы III, и, возможно, гиразы. Такой комплекс может обеспечивать удлинение лидирующей цепи и одновременно инициацию праймерной РНК, а также достраивание ДНК при синтезе отстающей цепи. Две реплисомы, работающие согласованно в двух вилках репликации, которые движутся в противоположных направлениях вдоль кольцевой хромосомы, сделали бы эту модель еще более изящной.
Репликация кольцевых дуплексов. Репликация инициируется также в точке начала репликации (ori).
Растущие цепи образуют репликативные вилки, пересещающиеся либо в двух (вверху), либо в одном (внизу) направлении в зависимости от природы точки начала репликации.
В некоторых кольцевых геномах в каждой цепи имеется своя точка начала репликации (например, в митохондриальной ДНК животных ). Синтез одной цепи начинается в точке oriR. Когда новая цепь доходит до точки oriD, начинается синтез другой цепи. Синтез инициируется путем образования праймерной РНК.
Некоторые двуцепочечные кольцевые хромосомы реплицируются альтернативным способом, называемым репликацией по типу катящегося кольца. В этом случае двуцепочечная кольцевая ДНК надрезается специфическим ферментом в уникальном сайте одной цепи (точке начала катящегося кольца), и к образовавшемуся в результате надреза 3΄ - гидроксильному кольцу с помощью полимеразы III присоединяются нуклеотиды; при этом матрицей служит интактная замкнутая цепь. Таким образом в вилке синтезируется только лидирующая нить. По мере синтезалидирующей цепи происходит вытеснение 5΄-конца надрезанного кольца как одиночной цепи. В результате длина лидирующей цепи может превышать длину матрицы в 2-5 раз. Такой способ репликации используют фаги М13 или фX174 (их зрелые геномы одноцепочечные кольцевые ДНК)на поздних стадиях инфекционного процесса, после того как инфицирующая ДНК превращается в двуцепочечную кольцевую форму. Постоянно отделяющиеся одиночные цепи ДНК, образуемые при репликации по типу катящегося кольца, надрезаются в каждой точке начала репликации и замыкаются с образованием зрелых форм, упаковываемых в вирусные частицы. Фаг λ использует такой способ репликации при образовании двуцепочечной линейной вирусной ДНК. Субстратной матрицей в этом случае является двуцепочечная кольцевая ДНК, которая была реплицирована после превращения на ранних этапах инфекции линейной вирусной ДНК в кольцевую репликативную форму.
Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: α, β, γ, δ, и ε. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза δ. ДНК-полимераза α отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза β — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза γ ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы ε пока неизвестна.
Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек. Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы δ служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований. После инициации репликация продолжается в двух направлениях от каждой точки до тех пор пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются. Полноразмерные ДНК каждой дочерней хромосомы получаются путем соединения более коротких независимо инициированных новосинтезированных цепей.
Теломеры и центромеры. Центомеры и теломеры – наиболее четко выраженные морфологические структуры хромосом (прозрачка 12). Долгое время считалось, что их строение и функции связаны с какими-то особенными последовательностями ДНК. Однако удалось выявить лишь одну такую особенность на молекулярном уровне: присутствие в области центромер и теломер сателлитной ДНК. Сателлитная ДНК – это длинные тандемные повторы, расположенные в области центромер и теломер.
Строение центромер. У млекопитающих центромеры имеют сложную дискообразную структуру, называемую кинетохором. С каждой стороны хромосомы располагается по одному кинетохорному диску. Во время митоза микротрубочки фибрилл веретена деления прикрепляются непосредственно к плотному наружнему слою кинетохора, связанному с петлями хроматина. Кинетохор у дрожжей образуют CEN-области (короткие сегменты ДНК) вместе с ДНК-связывающими белками (прозрачка 13). Последовательности, расположенные с одной или с обеих сторон от CEN-областей, могут блокировать прохождение репликационной вилки до появления специфического сигнала, разрешающего окончание репликации в анафазе.в таком случае число хромосом не будет превышать одной на дочернюю клетку.
Последовательности в области теломер. Теломеры –концы эукариотической хромосомы, являются также и концами линейного дуплекса ДНК. Именно с теломерами связана одна из проблем репликации: как достраиваются 5΄-концы хромосомного дуплекса, если ДНК-полимеразы не инициируют синтез новых цепей? Возможно, этот вопрос решается также как при репликации линейного дуплекса аденовирусов, или с помощью альтернативных механизмов? Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что концевые области эукариотических хромосом – теломеры – реплицируются с помощью особого механизма. Концы хромосом дрожжей, беспозвоночных, растений и позвоночных имеют сходное строение: они содержат шпилькообразные структуры, в которых 3΄- и 5΄-концы дуплекса ДНК оказываются рядом, и много тандемных повторов. Около петли в одной из цепей в области повторов имеются множественные одноцепочечные разрывы. Недавно из Tetrahymena был выделен фермент – теломераза – терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, которая присоединяет повтор 5΄-TTGGGG-3΄, последовательно по одному нуклеотиду, к 3΄-концам специфических олигонуклеотидных праймеров (TTGGGG)n (Tetrahymena) и (TGTGTGGG)n (дрожжи). Таким образом, теломераза может строить теломеры при этом родительская ДНК не используется в качестве матрицы (ппрозрачка 20). Теломераза – это крупный рибонуклеопротеиновый комплекс, а для проявления ферментативной активности требуется как РНК так и белки. Гипотетически схема образования теломеры представлена на рисунке. В верхней части рисунка представлено образование петли на конце цепи, содержащей последовательность 5΄-(TTGGGG)n-3΄, и одноцепочечных разрывов на противоположной цепи, содержащей последовательность 5΄-(CCCCAA)n-3΄. К 3΄-концу нижней цепи с помощью телоизомеразы присоединяются последовательно, по одному нуклеотиду, единицы 5΄- TTGGGG -3΄. Праймаза и ДНК-полимераза копируют 5΄- (TTGGGG)n -3΄-цепь с образование новых 5΄-(CCCCAA)n-3΄-единиц. В результате неполного лигирования в С-богатой цепи остаются одноцепочечные разрывы. На 3΄-конце 5΄-(TTGGGG)n-3΄-цепи вновь образуется петля, стабилизируемая взаимодействиями между остатками гуанозина.
Терминация репликации.
Терминация и расхождение в кольцевых геномах. Замкнутость структуры многих геномных ДНК упрощает процесс завершения репликации всей нуклеотидной последовательности. Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепи вдоль кольцевой матрицы неизбежно приводит к совмещению 3΄-гидрокси- и 5΄-фосфорильного концов одной цепи либо в точке начала репликации, либо – при двунаправленной репликации – в середине кольца (прозрачка 14). Кольца в этих местах встречи соединяются ДНК-лигазой, при этом они обычно оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем должно произойти их разъединение на отдельные геномы. Это происходит с помощью топоизомеразы типа II (прозрачка 15).
Терминация и расхождение в линейных ДНК. За исключением аденовирусной ДНК, где синтезновых цепей ДНК инициируется белковым праймером и матричная цепь копируется полностью (прозрачка 16), во всех других случаях для репликации необходим РНК-праймер, что создает особые проблемы при завершении репликации линейной дуплексной ДНК (прозрачка 17). Дело в том, что после инициации синтеза новой цепи и последующего удаления РНК-праймера новосинтезированная цепь содержит пробел на 5΄-конце. Поскольку никаких способов удлинения 5΄-концов цепей ДНК ене существует, необходимы какие-то иные методы завершения репликации. Были предложены два способа.
Первый: предполагает, что существуют цепи ДНК с прямыми повторами на концах (прозрачка 18). После репликации два комплиментарных конца обоих незавершенных дуплексов могут спарится и образовать линейные конкатемеры с одноцепочечными разрывами.остающиеся пробелы могут быть заполнены путем удлинения цепей в направлении 3΄ →5΄ с последующим соединением их ДНК-лигазой либо путем прямого соединения стыкующихся концов с помощью ДНК-лигазы с образование конкатемеров. После надрезания конкатемера специфической эндонуклеазой образуются выступающие 5΄-концы, и ДНК-полимераза может наращивать более короткие цепи с 3΄-конца.
Второй. Предполагает наличие на конце каждой цепи ДНК коротких инвертированных повторов, благодаря которым образуются небольшие петли (прозрачка 19). 3΄-конец петли служит праймером для копирования нереплицированного участка. Благодаря специфическому разрыву в начале инвертированного повтора получается структура, которую можно достроить с 3΄-конца до восстановления исходной двуцепочечной концевой последовательности.
Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований.
Репарация ДНК
ДНК – это единственная макромолекула клетки, которая способна устранять (репарировать) повреждения, возникающие в ее структуре. Более того, в ней закодирована информация о механизмах самых разнообразных репарационных процессов. Комплиментарное спаривание лежит в основе не только репликации ДНК, но процесса восстановления исходной структуры ДНК при репарации повреждений, затрагивающих остов молекулы, модификаций того или иного основания или ошибочного спаривания при рекомбинации (см. ниже). Одновременное повреждение обеих цепей в одном месте и двуцепочечные разрывы часто оказываются летальными для ДНК, поскольку такие дефекты репарируются лишь в редких случаях.
Наиболее часто происходит разрыв гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой N (депуринизация) при повышении температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10000 актов депуринизации -–это ведет к нарушению репликации и экспрессии генов. Кроме того, остатки Ц и А могут подвергаться спонтанному дезаминированию с образование соответственно остатков У и гипоксантина; частота таких событий примерно 100 на геном – это ведет к появлению мутаций.
Многие изменения в структуре ДНК происходят под действием химических веществ, присутствующих в окружающей среде. Это алкилирующие агенты (азотистые соединения, алкилсульфонаты, нитрозомочевина), которые модифицируют предпочтительно Г-остатки, соединения, встраивающиеся между соседними парами оснований и приводящие к появлению вставок и делеций во время репликации; бифункциональные агенты, способные образовывать ковалентные сшивки между двумя цепями ДНК и блокировать их расхождение при репликации. Не менее разрушительны физические воздействия – поглощение Т или Ц УФ-света приводит к образованию циклобутановых димеров между соседними пиримидинами; ионизирующая радиация (космические лучи) способствует образованию высокореакционоспособных свободных радикалов, оказывающих на ДНКсамые разнообразные воздействия; рентгеновские лучи – вызывают в ДНК одно-и-двуцепочечные разрывы, а также другие повреждения, характерные для воздействия свободных радикалов.
Известны два основных способа репарационных процессов:
непосредственное исправление модификаций или неправильных спариваний, не требующее репликации для восстановления исходной структуры;
удаление нуклеотидов, окружающих ошибочно спаренные или измененные пары оснований, и ресинтез этого участка путем репликации.
репарация путем прямого восстановления исходной структуры.
Если под воздействием алкилирующих агентов – N-метил –N-нитрозомочевины или N1, N-диметилнитрозогуанидина, в ДНК образовался О6- метил- или О6-алкилзамещенные гуаниновые остатки, то деалкилирование таких остатков идет при участии ферментов – О6-метилгуанин-ДНК-алкилтрансферазы, которая катализирует перенос алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента, при этом акцепторный белок инактивируется. Это у бактерий и млекопитающих.
Если при облучении ДНК УФ-светом образовались циклобутановые димеры между соседними парами пиримидиновых оснований, то осуществляется ферментативное (фотолиазы –нет у млекопитающих) превращение их в мономеры при освещении раствора видимым светом в диапазоне длин волн 300-600 нм. Фермент образует стабильный комплекс с пиримидиновым димером и используя энергию поглощенног им света разрушает димер без разрыва цепей ДНК.
Репарация путем замены модифицированных остатков.
Замена модифицированного нуклеотида обычно проходит в четыре этапа:
1 этап. Фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Выщепление сайтов, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация осуществляется ферментами АР (апуриновые, апиримидиновые)-эндонуклеазы. В репарации N-алкилированных пуринов и других модифицированных оснований ключевую роль играют ферменты – N-гликозилазы, расщепляющие гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоскирибозой (прозрачка 25)
2 этап. Экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или соседние нуклеотиды, оставляя небольшую брешь.
3 этап. Удаленный участок синтезируется заново с 3΄-ОН-конца с использованием в качестве матрицы противоположной цепи.
4 этап. Концы разрыва, образовавшиеся в результате репарации, соединяются с восстановлением ковалентной целостности репарированной цепи (прозрачка 26)
Значение репарации ДНК.
Устранение ошибок репликации важно, так как большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные если их не устранить, сохраняться в геноме потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Люди, страдающие, например, пигментной ксеродермой, очень чувствительны к УФ-свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию в RAD-генах, проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутауцией в одном из по крайней мере девяти генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры, у человека.как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.
Уотсон и Крик предположили, что для удвоения ДНК должны произойти разрыв водородных связей, удерживающих вместе спиральный дуплекс, и расхождение цепей. Они также высказали мысль, что каждая цепь дуплекса служит матрицей при синтезе комплиментарной цепи и в результате образуются две пары цепей, в каждой из которых только одна является родительской. Уотсон и Крик предполагали, что репликация ДНК осуществляется спонтанно, без участия ферментов, но это оказалось неверно. Тем не менее идея о том, что удвоение ДНК происходит путем последовательного соединения нуклеотидов в соответствии с правилом комплиментарности, заданным каждой цепью спирали, разрешила концептуальную проблему точного воспроизведения генов.
С того времени как было высказано это предположение, матричная природа механизма репликации была подтверждена многочисленными данными, полученными как in vitro так и in vivo для различных организмов. Согласно модели репликация всех двуцепочечных ДНК полуконсервативна. Доказательство полуконсервативного механизма было получено в
Репликация одноцепочечной ДНК у вирусов. Если геном представлен одноцепочечной ДНК (как у некоторых вирусов), то эта единственная цепь служит матрицей для образования комплиментарной цепи, с которой она образует дуплекс, а затем на этом дуплексе синтезируются либо дочерние дуплексы, либо одноцепочечные копии одной их матричных цепей. Репликация генетического материала вируса осуществляет обычно с участием ферментов клетки-хозяина. На некоторых молекулах вирусной ДНК синтезируются также ее ДНК-копии – с помощью либо клеточной, либо кодируемой вирусом ДНК-полимеразы. Эти ДНК-копии используются в последствии при сборке вирусных частиц. Репликация ДНК вирусов происходит либо в ядре клетки-хозяина (вирус герпеса), либо в цитоплазме (поксвирусы).
Репликация у прокариот. Редупликацию ДНК (процесс, при котором информация, закодированная в последовательности оснований молекулы родительской ДНК, передается с максимальной точностью дочерней ДНК) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-углеродом дезоксирибозы. Следовательно, к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении 5'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.
Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.
Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-полимераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 кДа, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.
Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизомеразы». (прозрачка 6) в точке начала репликации – ori (origin – начало репликации).
Структура точек начала репликации. Фрагменты ДНК, несущие точку начала репликации выделены из E.coli и некоторых плазмид, а также из дрожжей и ряда эукариотических вирусов. В некоторых случаях место начала репликации имеет такую нуклеотидную последовательность, что дуплекс принимает необычную конфигурацию, колторую распознают белки, участвующие в инициации. Природа взаимодействия между точкой начала репликации и белками и механизм инициации в целом исследованы мало.
Итак, топоизомераза продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимераза, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)
Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-полимераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему («танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).
Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».
Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...
Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК тандем геликаза-ДНК-связывающие белки — ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топоизомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а геликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» — по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место — ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией — около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).
Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5'-концу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3'— 5', считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).
Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», — ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные» дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед.
Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5'—3' экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.
| Д |
| |
рибонуклеаза Н ДНК-полимеразаII
Рис. 28
Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений.
Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме (см. ниже).
Более сложная модель движения репликативной вилки предполагает формирование реплисомы – мультиферментного комплекса более высокого уровня организации. Этот комплекс состоит из функционального праймосомо-праймазного комплекса, геликазы, полимеразы III, и, возможно, гиразы. Такой комплекс может обеспечивать удлинение лидирующей цепи и одновременно инициацию праймерной РНК, а также достраивание ДНК при синтезе отстающей цепи. Две реплисомы, работающие согласованно в двух вилках репликации, которые движутся в противоположных направлениях вдоль кольцевой хромосомы, сделали бы эту модель еще более изящной.
Репликация кольцевых дуплексов. Репликация инициируется также в точке начала репликации (ori).
Растущие цепи образуют репликативные вилки, пересещающиеся либо в двух (вверху), либо в одном (внизу) направлении в зависимости от природы точки начала репликации.
В некоторых кольцевых геномах в каждой цепи имеется своя точка начала репликации (например, в митохондриальной ДНК животных ). Синтез одной цепи начинается в точке oriR. Когда новая цепь доходит до точки oriD, начинается синтез другой цепи. Синтез инициируется путем образования праймерной РНК.
Некоторые двуцепочечные кольцевые хромосомы реплицируются альтернативным способом, называемым репликацией по типу катящегося кольца. В этом случае двуцепочечная кольцевая ДНК надрезается специфическим ферментом в уникальном сайте одной цепи (точке начала катящегося кольца), и к образовавшемуся в результате надреза 3΄ - гидроксильному кольцу с помощью полимеразы III присоединяются нуклеотиды; при этом матрицей служит интактная замкнутая цепь. Таким образом в вилке синтезируется только лидирующая нить. По мере синтезалидирующей цепи происходит вытеснение 5΄-конца надрезанного кольца как одиночной цепи. В результате длина лидирующей цепи может превышать длину матрицы в 2-5 раз. Такой способ репликации используют фаги М13 или фX174 (их зрелые геномы одноцепочечные кольцевые ДНК)на поздних стадиях инфекционного процесса, после того как инфицирующая ДНК превращается в двуцепочечную кольцевую форму. Постоянно отделяющиеся одиночные цепи ДНК, образуемые при репликации по типу катящегося кольца, надрезаются в каждой точке начала репликации и замыкаются с образованием зрелых форм, упаковываемых в вирусные частицы. Фаг λ использует такой способ репликации при образовании двуцепочечной линейной вирусной ДНК. Субстратной матрицей в этом случае является двуцепочечная кольцевая ДНК, которая была реплицирована после превращения на ранних этапах инфекции линейной вирусной ДНК в кольцевую репликативную форму.
Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: α, β, γ, δ, и ε. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза δ. ДНК-полимераза α отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза β — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза γ ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы ε пока неизвестна.
Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек. Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы δ служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований. После инициации репликация продолжается в двух направлениях от каждой точки до тех пор пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются. Полноразмерные ДНК каждой дочерней хромосомы получаются путем соединения более коротких независимо инициированных новосинтезированных цепей.
Теломеры и центромеры. Центомеры и теломеры – наиболее четко выраженные морфологические структуры хромосом (прозрачка 12). Долгое время считалось, что их строение и функции связаны с какими-то особенными последовательностями ДНК. Однако удалось выявить лишь одну такую особенность на молекулярном уровне: присутствие в области центромер и теломер сателлитной ДНК. Сателлитная ДНК – это длинные тандемные повторы, расположенные в области центромер и теломер.
Строение центромер. У млекопитающих центромеры имеют сложную дискообразную структуру, называемую кинетохором. С каждой стороны хромосомы располагается по одному кинетохорному диску. Во время митоза микротрубочки фибрилл веретена деления прикрепляются непосредственно к плотному наружнему слою кинетохора, связанному с петлями хроматина. Кинетохор у дрожжей образуют CEN-области (короткие сегменты ДНК) вместе с ДНК-связывающими белками (прозрачка 13). Последовательности, расположенные с одной или с обеих сторон от CEN-областей, могут блокировать прохождение репликационной вилки до появления специфического сигнала, разрешающего окончание репликации в анафазе.в таком случае число хромосом не будет превышать одной на дочернюю клетку.
Последовательности в области теломер. Теломеры –концы эукариотической хромосомы, являются также и концами линейного дуплекса ДНК. Именно с теломерами связана одна из проблем репликации: как достраиваются 5΄-концы хромосомного дуплекса, если ДНК-полимеразы не инициируют синтез новых цепей? Возможно, этот вопрос решается также как при репликации линейного дуплекса аденовирусов, или с помощью альтернативных механизмов? Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что концевые области эукариотических хромосом – теломеры – реплицируются с помощью особого механизма. Концы хромосом дрожжей, беспозвоночных, растений и позвоночных имеют сходное строение: они содержат шпилькообразные структуры, в которых 3΄- и 5΄-концы дуплекса ДНК оказываются рядом, и много тандемных повторов. Около петли в одной из цепей в области повторов имеются множественные одноцепочечные разрывы. Недавно из Tetrahymena был выделен фермент – теломераза – терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, которая присоединяет повтор 5΄-TTGGGG-3΄, последовательно по одному нуклеотиду, к 3΄-концам специфических олигонуклеотидных праймеров (TTGGGG)n (Tetrahymena) и (TGTGTGGG)n (дрожжи). Таким образом, теломераза может строить теломеры при этом родительская ДНК не используется в качестве матрицы (ппрозрачка 20). Теломераза – это крупный рибонуклеопротеиновый комплекс, а для проявления ферментативной активности требуется как РНК так и белки. Гипотетически схема образования теломеры представлена на рисунке. В верхней части рисунка представлено образование петли на конце цепи, содержащей последовательность 5΄-(TTGGGG)n-3΄, и одноцепочечных разрывов на противоположной цепи, содержащей последовательность 5΄-(CCCCAA)n-3΄. К 3΄-концу нижней цепи с помощью телоизомеразы присоединяются последовательно, по одному нуклеотиду, единицы 5΄- TTGGGG -3΄. Праймаза и ДНК-полимераза копируют 5΄- (TTGGGG)n -3΄-цепь с образование новых 5΄-(CCCCAA)n-3΄-единиц. В результате неполного лигирования в С-богатой цепи остаются одноцепочечные разрывы. На 3΄-конце 5΄-(TTGGGG)n-3΄-цепи вновь образуется петля, стабилизируемая взаимодействиями между остатками гуанозина.
Терминация репликации.
Терминация и расхождение в кольцевых геномах. Замкнутость структуры многих геномных ДНК упрощает процесс завершения репликации всей нуклеотидной последовательности. Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепи вдоль кольцевой матрицы неизбежно приводит к совмещению 3΄-гидрокси- и 5΄-фосфорильного концов одной цепи либо в точке начала репликации, либо – при двунаправленной репликации – в середине кольца (прозрачка 14). Кольца в этих местах встречи соединяются ДНК-лигазой, при этом они обычно оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем должно произойти их разъединение на отдельные геномы. Это происходит с помощью топоизомеразы типа II (прозрачка 15).
Терминация и расхождение в линейных ДНК. За исключением аденовирусной ДНК, где синтезновых цепей ДНК инициируется белковым праймером и матричная цепь копируется полностью (прозрачка 16), во всех других случаях для репликации необходим РНК-праймер, что создает особые проблемы при завершении репликации линейной дуплексной ДНК (прозрачка 17). Дело в том, что после инициации синтеза новой цепи и последующего удаления РНК-праймера новосинтезированная цепь содержит пробел на 5΄-конце. Поскольку никаких способов удлинения 5΄-концов цепей ДНК ене существует, необходимы какие-то иные методы завершения репликации. Были предложены два способа.
Первый: предполагает, что существуют цепи ДНК с прямыми повторами на концах (прозрачка 18). После репликации два комплиментарных конца обоих незавершенных дуплексов могут спарится и образовать линейные конкатемеры с одноцепочечными разрывами.остающиеся пробелы могут быть заполнены путем удлинения цепей в направлении 3΄ →5΄ с последующим соединением их ДНК-лигазой либо путем прямого соединения стыкующихся концов с помощью ДНК-лигазы с образование конкатемеров. После надрезания конкатемера специфической эндонуклеазой образуются выступающие 5΄-концы, и ДНК-полимераза может наращивать более короткие цепи с 3΄-конца.
Второй. Предполагает наличие на конце каждой цепи ДНК коротких инвертированных повторов, благодаря которым образуются небольшие петли (прозрачка 19). 3΄-конец петли служит праймером для копирования нереплицированного участка. Благодаря специфическому разрыву в начале инвертированного повтора получается структура, которую можно достроить с 3΄-конца до восстановления исходной двуцепочечной концевой последовательности.
Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований.
Репарация ДНК
ДНК – это единственная макромолекула клетки, которая способна устранять (репарировать) повреждения, возникающие в ее структуре. Более того, в ней закодирована информация о механизмах самых разнообразных репарационных процессов. Комплиментарное спаривание лежит в основе не только репликации ДНК, но процесса восстановления исходной структуры ДНК при репарации повреждений, затрагивающих остов молекулы, модификаций того или иного основания или ошибочного спаривания при рекомбинации (см. ниже). Одновременное повреждение обеих цепей в одном месте и двуцепочечные разрывы часто оказываются летальными для ДНК, поскольку такие дефекты репарируются лишь в редких случаях.
Наиболее часто происходит разрыв гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой N (депуринизация) при повышении температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10000 актов депуринизации -–это ведет к нарушению репликации и экспрессии генов. Кроме того, остатки Ц и А могут подвергаться спонтанному дезаминированию с образование соответственно остатков У и гипоксантина; частота таких событий примерно 100 на геном – это ведет к появлению мутаций.
Многие изменения в структуре ДНК происходят под действием химических веществ, присутствующих в окружающей среде. Это алкилирующие агенты (азотистые соединения, алкилсульфонаты, нитрозомочевина), которые модифицируют предпочтительно Г-остатки, соединения, встраивающиеся между соседними парами оснований и приводящие к появлению вставок и делеций во время репликации; бифункциональные агенты, способные образовывать ковалентные сшивки между двумя цепями ДНК и блокировать их расхождение при репликации. Не менее разрушительны физические воздействия – поглощение Т или Ц УФ-света приводит к образованию циклобутановых димеров между соседними пиримидинами; ионизирующая радиация (космические лучи) способствует образованию высокореакционоспособных свободных радикалов, оказывающих на ДНКсамые разнообразные воздействия; рентгеновские лучи – вызывают в ДНК одно-и-двуцепочечные разрывы, а также другие повреждения, характерные для воздействия свободных радикалов.
Известны два основных способа репарационных процессов:
непосредственное исправление модификаций или неправильных спариваний, не требующее репликации для восстановления исходной структуры;
удаление нуклеотидов, окружающих ошибочно спаренные или измененные пары оснований, и ресинтез этого участка путем репликации.
репарация путем прямого восстановления исходной структуры.
Если под воздействием алкилирующих агентов – N-метил –N-нитрозомочевины или N1, N-диметилнитрозогуанидина, в ДНК образовался О6- метил- или О6-алкилзамещенные гуаниновые остатки, то деалкилирование таких остатков идет при участии ферментов – О6-метилгуанин-ДНК-алкилтрансферазы, которая катализирует перенос алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента, при этом акцепторный белок инактивируется. Это у бактерий и млекопитающих.
Если при облучении ДНК УФ-светом образовались циклобутановые димеры между соседними парами пиримидиновых оснований, то осуществляется ферментативное (фотолиазы –нет у млекопитающих) превращение их в мономеры при освещении раствора видимым светом в диапазоне длин волн 300-600 нм. Фермент образует стабильный комплекс с пиримидиновым димером и используя энергию поглощенног им света разрушает димер без разрыва цепей ДНК.
Репарация путем замены модифицированных остатков.
Замена модифицированного нуклеотида обычно проходит в четыре этапа:
1 этап. Фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Выщепление сайтов, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация осуществляется ферментами АР (апуриновые, апиримидиновые)-эндонуклеазы. В репарации N-алкилированных пуринов и других модифицированных оснований ключевую роль играют ферменты – N-гликозилазы, расщепляющие гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоскирибозой (прозрачка 25)
2 этап. Экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или соседние нуклеотиды, оставляя небольшую брешь.
3 этап. Удаленный участок синтезируется заново с 3΄-ОН-конца с использованием в качестве матрицы противоположной цепи.
4 этап. Концы разрыва, образовавшиеся в результате репарации, соединяются с восстановлением ковалентной целостности репарированной цепи (прозрачка 26)
Значение репарации ДНК.
Устранение ошибок репликации важно, так как большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные если их не устранить, сохраняться в геноме потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Люди, страдающие, например, пигментной ксеродермой, очень чувствительны к УФ-свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию в RAD-генах, проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутауцией в одном из по крайней мере девяти генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры, у человека.как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.
