Реферат на тему Значение белков теплового шока при вич-инфекции
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2015-06-29Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
На правах рукописи
НАЧАРОВ Петр Васильевич
ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
14.00.10—инфекционные болезни
АВТОРЕФЕPAT диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
1997
Работа выполнена в Военно-медицинской академии.
Научный руководитель:
доктор медицинских наук Е. И. Змушко.
Научный консультант:
доктор медицинских наук профессор Ю. В. Лобзин.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук профессор В. В. Иванова, доктор медицинских наук профессор А. Г. Рахманова.
Ведущее учреждение—Российский научно-методический центр но профилактике и борьбе со СПИДом.
Защита диссертации состоится "" ............... 1997 г.
в .... часов на заседании специализированного совета Д 106.03.05
при Военно-медицинской академии (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии.
Автореферат разослан
1997 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Ю. И. Ляшенко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В России вопросы стратегии и тактики борьбы с ВИЧ-инфекцией определены работами В.И.Покровского (1988: 1989; 1993). В.И.Покровский (1987) предсказал грядущий размах распространения ВИЧ-инфекции в стране и внедрил в практическое здравоохранение структуру, предназначенную для борьбы со СПИДом. В настоящее время ВИЧ-инфекция охватила все страны мира. К середине 1996 года общее количество инфицированных вирусом иммунодефицита во всем мире достигло 27,9 миллионов человек (Рахманова А.Г., 1996). Несмотря на то, что выполнен беспрецедентно большой объем научных исследований по. проблеме ВИЧ-инфекции, предложены методы лекарственной терапии, позволяющие добиваться временного улучшения состояния больных СПИДом. до настоящего времени не известен ни один достоверный случай выздоровления, поэтому СПИД считают болезнью с летальностью 100%. Проблема ВИЧ-инфекции усугубляется еще и тем фактом, что с начала девяностых годов ВИЧ все более и более завоевывает основную популяцию населения, в то время как в течение первых десяти лет распространение шло преимущественно среди определенных групп населения, так называемых "групп риска" - наркоманы, гомосексуалисты. проститутки, больные гемофилией (Лобзин Ю.В., Казанцев А.П.. 1996). Актуальность проблемы определяет неуправляемое интенсивное возрастание случаев инфицированности, болезненности и смертности во всех странах мира (Шувалова Е.П., 1995). Выявление ВИЧ-инфицированных лиц не приводит к прекращению передачи ВИЧ от них, несмотря на уведомление их об уголовной ответственности за заражение (Покровский В.В. с соавт., 1996). Не решенными остаются основные проблемы СПИДа (Белозеров Е.С. с соавт., 1995): - отсутствие методов ранней диагностики: - полная неуправляемость патологических процессов у заболевшего: - отсутствие надежных клинических и лабораторных показателей перехода инфекционного процесса из латентной стадии в манифестную. При СПИДе и ВИЧ-инфекции достаточно хорошо изучены основные лабораторные диагностические показатели, свидетельствующие об инфицированности (Змушко Е.И. с соавт., 1996). Однако вопросы прогнозирования клинического течения ВИЧ-инфекции требуют дальнейшего изучения. Наибольшее клиническое значение имеет прогноз перехода от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ), а также от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний, который важен для своевременного назначения этиотропных и патогенетических средств (Рахманова А.Г.. Чайка Н.А., 1989). При поиске новых тестов, которые давали бы представление о состоянии иммунокомпетентных клеток крови при ВИЧ-инфекции, обратила на себя внимание группа сравнительно недавно открытых внутриклеточных белков, получивших название "белки теплового шока" (БТШ) или "стрессовые белки". Эти белки недостаточно изучены, но уже имеющиеся данные говорят, что они высоко консервативны в процессе филогенеза (Lindqulst S., 1986), необычно полифункциональны - играют важную роль во многих внутриклеточных иммунобиохимических процессах как в экстремальных, так и в нормальных условиях (Polla B.S., 1988), что позволяет предположить об участии белков теплового шока в формировании патобиохимических внутриклеточных связей при ВИЧ-инфекции. В ответ на воздействие неблагоприятных факторов, в том числе и вирусной инфекции, формируется неспецифическая клеточная реакция, которая сопровождается усилением процессов свободнорадикального окисления (Иванова В.В. с соавт., 1992: 1996), синтезом белков теплового шока (Kaufman S.H.E.. 1990) и является одним из механизмов дестабилизации генома клеток-мишеней. В этих условиях немаловажной представляется роль фермента ксантиноксидазы, которая служит генератором свободных радикалов при ряде патологических состояний клетки и является наиболее значимой среди прооксидантных систем, характерных для лимфоидной клетки (Кожемякин Л.А. с соавт.. 1992). Отсутствие в литературе данных по комплексной оценке процессов дестабилизации генома, сопряженных с активностью свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в иммунокомпетентных клетках крови в динамике развития ВИЧ-инфекции не позволяет определить значимость названных показателей для прогноза клинического течения болезни. Цель исследования: дать оценку возможности использования показателей белков теплового шока семейства БТШ-70 и комплекса биохимических изменений в мононуклеарах периферической крови в прогнозировании клинического течения ВИЧ-инфекции. Для достижения указанной цели необходимо было решить следуюие задачи: 1. Изучить динамику традиционных показателей иммунного стату-а у ВИЧ-инфицированных и определить их прогностическую значимость при переходе клинического течения болезни из одной стадии в другую. 2. Изучить изменения активности ксантиноксидазы, интенсивности процессов свободнорадикального окисления и показателей нестабильности генома мононуклеаров периферической крови при ВИЧ-инфекции и оценить их прогностическую значимость. 3. Разработать методические подходы к созданию иммунологического метода для количественного и качественного анализа белков семейства БТШ-70. 4. Изучить показатели белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови на разных фазах ВИЧ-инфекции. 5. Определить взаимосвязь изменений белков семейства БТШ-70 и комплекса биохимических показателей дестабилизации генома. свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови у больных в динамике заболевания и оценить их значимость для прогноза клинико-манифестных форм ВИЧ-инфекции. Научная новизна: 1. Впервые установлено, что нарастание накопления конститутивной изоформы белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных пропорционально степени выраженности клинических проявлений болезни. 2. Показана связь изменения показателей белков семейства БТШ-70 с уровнем нестабильности генома, активностью процессов свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией в процессе развития клинической картины заболевания. 3. Установлено, что изменение состояния белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови адекватно отражает вероятность перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии и от персистирующей генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний. 4. Установлено, что ВИЧ-инфекция вызывает нарушение реакции белков теплового шока (БТШ-70) мононуклеаров периферической крови в ответ на повреждающие воздействия (гипертермия. ультрафиолетовое облучение). Практическая значимость работы. Комплекс показателей, отражающих состояние системы белков теплового шока, системы ксантиноксидазы, процессов свободнорадикального и нестабильности генома мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными иммунологическими показателями может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу ПГЛ и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. Изучение показателей белков теплового шока мононуклеаров периферической крови человека как защитного механизма неспецифического действия может может быть применено для оценки эффективности лекарственных средств с иммуномодулирующими свойствами, а также для разработки новых диагностических подходов к прогнозированию иммунодефицитных состояний различной этиологии. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Переход клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний характеризуется увеличением содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови. 2. Изменения содержания белков семейства БТШ-70 в процессе ВИЧ-инфекции происходят на фоне увеличения показателей нестабильности генома, интенсификации процессов свободнорадикального окисления и повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови. 3. Показатели белков семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови в совокупности с традиционными иммунологическими показателями возможно использовать для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. Апробация работы. Результаты исследований доложены на XI-й и XII-й научных конференциях молодых ученых академии (ВМедА, Ленинград, 1990; ВМедА, Санкт-Петербург, 1992), на VI-м Всесоюзном биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1992), на Первой международной региональной конференции по ВИЧ-инфекции "Социальные и медицинские проблемы СПИДа" (Санкт-Петербург, 1994). на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества инфекционистов (Санкт-Петербург, 1996), на IV международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург. 1996), на III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург. 1996). Материалы диссертации использованы в отчетах по теме НИР N 50-93-В12 "Биохимические механизмы формирования иммунодефицитов под влиянием ВИЧ и иммунодиагностика иммунодефицитных состояний больных СПИДом" и по теме НИР N 60-95-П4 "Исследование роли системы белков теплового шока в патогенезе ВИЧ-инфекции". Реализация результатов работы. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Результаты работы используются в практике учебного процесса и научно-исследовательской работе кафедры инфекционных болезней, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, в работе НИЛ СПИДа и инфекционных заболеваний в ВС РФ Военно-медицинской академии, кафедры инфекционных болезней Семипалатинского государственного медицинского института, кафедры ЛОР-болезней с курсом аллергологии и иммунологии Чимкентского государственного медицинского института, кафедры инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований. обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 61 отечественный и 140 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 17 таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Общая характеристика больных и методов исследования В процессе работы были обследованы 34 инфицированных и больных ВИЧ-инфекцией, среди которых преобладали лица мужского пола в возрастной категории от 20 до 39 лет. Клиническое наблюдение и обследование больных проводили в больнице N 30 имени С.П. Боткина г.Санкт-Петербурга, Республиканской клинической инфекционной больнице г. Усть-Ижоры Ленинградской области, в Центре по борьбе и профилактике СПИДа г.Санкт-Петербурга. Больные были распределены по группам в соответствии с клинической классификацией В.И.Покровского (1989). Вич-инфицированных в стадии инкубации и больных в терминальной стадии не обследовали. Контрольную группу составили 25 практически здоровых мужчин (доноров крови) в возрасте от 20 до 39 лет - военнослужащие. Иммунологические и биохимические исследования проводили в Военно-медицинской академии, определение белков теплового шока - на базе института цитологии Академии наук. Диагноз ВИЧ-инфекции верифицировали серологически - по наличию в крови специфических антител к ВИЧ с помощью тест-систем для гетерогенного иммуноферментного анализа методом двойных антител (производства фирм СП"ДиаПЛЮС". Россия-Швейцария, СП"Авиценна", Россия-Сирия). Результаты иммуноферментного анализа подтверждали с помощью иммуноблотинга ("Du Pont", США). Для оценки иммунного статуса у обследованных пациентов изучали следующие показатели: количество лейкоцитов, лимфоцитов; субпопуляции Т-лимфоцитов с помощью проточного цитофлюориметра "EPICS-C" (Coulter elektronics. США-Франция) с применением моноклональных антител фирмы "Ortho Diagnostic Systems"(США): РТМЛ с КонА определяли по методу M.George. J.H.Vaughan (1962); количество В-лимфоцитов, несущих Ig M, G, А, определяли методом иммунофлюоресценции с использованием моноспецифических сывороток к иммуноглобулинам человека; концентрации Ig M. G, А, определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Mancini С. et al.. 1963); содержание циркулирующих иммунных комплексов по методу Ю.А.Гриневича. А.Н.Алферова (1981). Для исследования системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных была получена панель поликлональных антител. При иммунизации животных и аффинной очистки антител применяли препарат белков БТШ-70. Для получения препарата БТШ-70 использовали белковый экстракт, полученный из мышечной ткани крупного рогатого скота и клеток культуры HeLa. Выделяли препарат методами ионообменной (с DEAE-сефарозой; и аффинной(с АТФ-агарозой) хроматографии. Чистоту полученных белков БТШ-70 проверяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Препарат БТШ-70 имел чистоту около 98% и содержал смесь конститутивной (hsc-70) и индуцибельной (hsp-70) изоформ семейства БТШ-70. Из иммунной сыворотки кроликов выделяли антитела к БТШ-70 методами высаливания и аффинной хроматографии на колонках со смесью белков hsc-70 и hsp-70. Каждая серия антител подвергалась проверке на специфичность двумя методами - иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Для определения эпитопов БТШ-70, с которыми реагировали полученные антитела, использовали "сэндвич"-метод иммуноферментного анализа и реакция иммунопреципитации с предварительным мечением белков [35S]-метионином. Иммунопреципитаты были подвергнуты одно- и двумерному электрофорезу (Laemli U.K., 1970; O'Farrel P.H.. 1978). Поликлональные антитела использовали в конструкции иммуноблотинга с последующей денситометрией проявленных зон белков, что позволяло полуколичественно оценивать содержание изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови больных. Для проверки функционального состояния системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови служили нагрузочные тесты In vitro - тепловой шок (прогрев клеток при 43±0.3° С в водяном термостате) и ультрафиолетовое облучение с использованием прибора МД-73 "Изольда". Определение активности ксантиноксидазы и ее формы в мононуклеарной фракции крови проводили по методу У.Прайор (1979). Уровень процессов свободнорадикального окисления тотально в мононуклеарах периферической крови и отдельно в их ядрах оценивали по содержанию продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, которые определяли по методу M.Uchlyama, M.Michara (1978). В качестве интегральных биохимических показателей нестабильности генома клеток были избраны относительная доля продуктов деградации хроматина - полидезоксинуклеопротеидов, которые являются фрагментами ДНК, (Parks D.A., Granger D.N., 1986) и интенсивность образования однонитевых разрывов ДНК (Birnboim H.C.. Jewcac J.J.. 1981). Статистическая обработка цифровых данных осуществляли методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия (t) Стьюдента. В случае малых выборок использовали непараметрические статистические критерии. Расчеты производили с использованием программы STATGRAF (Statistical Graphics System), версия 2.1. 2. Результаты собственных исследований Гуморальный и клеточный иммунитет на разных стадиях болезни Исследование изменений в иммунной системе при развитии ВИЧ-инфекции имело целью выявить показатели, достоверно изменяющиеся при переходе от одной клинической стадии (фазы) к другой. Анализ изменений иммунологических параметров больных позволяет заключить, что в динамике ВИЧ-инфекции, в первую очередь, происходит прогрессирующее снижение функциональной состоятельности иммунной системы по мере развития клинической картины заболевания. Выявленная дефектность иммунного статуса касается, прежде всего. Т-системы иммунитета. Однако далеко не все исследованные традиционные иммунодиагностические параметры в своей динамике достоверно отражают начало перехода от бессимптомной фазы заболевания к манифестным стадиям. Достоверное различие между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдалось у следующих показателей: - при переходе от бессимптомной фазы (IIБ) к ПГЛ (IIB) - увеличение относительного содержания лимфоцитов от 39,00±2,13 до 45,92±1.96% (р<0,05), уменьшение содержания СD8+-лимфоцитов (супрессоров) ОТ 36,90±2.90 до 27,83±1,80% (p<0,01); - при переходе от ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) - увеличение содержания В (IgA+) -лимфоцитов от 0,06±0,01 до 0,10±0,01xlO9/л (p<0,01), увеличение концентрации IgG от 11,74±0.89 до 13.77±0.66 г/л (р<0.05), увеличение содержания циркулирующих иммунных комплексов - уменьшение пропускания светового потока от 92,1±1,2 до 84.3±1.6% (р<0,01). Как показал анализ, процентные (относительные) показатели во многих случаях нельзя использовать без оценки абсолютных значений. абсолютное содержание В(IgA+)-лимфоцитов, остается неизменным на стадии IIIA по сравнению с бессимптомной фазой, изменение концентрации иммуноглобулинов IgG происходят в диапазоне нормальных значений (9-15 г/л), что снижает прогностическую информативность указанных показателей. Важен и тот факт, что нет единого иммунологического показателя, который бы достоверно характеризовал оба перехода ВИЧ-инфекции - от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний. Содержание продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, в мононуклеарах периферической крови Уже в бессимптомной фазе у ВИЧ-инфицированных отмечается увеличение средних значений содержания ТБК-связывающих соединений в мононуклеарах периферической крови на 56%, а в их ядрах - на 90%. По мере развития заболевания уровень названных продуктов свободно-радикального окисления возрастает, достигая максимума у больных в стадии IIIB. При этом средние значения в группе больных в стадии IIIB превышали контрольные в 3.2 раза в мононуклеарах и в 4,6 раза в ядрах мононуклеаров. Однако достоверный рост показателей свободнорадикального окисления между группами больных ВИЧ-инфекцией отмечается в мононуклеарах. но не в ядрах, и только в одном из интересующих нас переходах клинического течения - из бессимптомной фазы (ПБ) к ПГЛ (IIB) от 2,82±0,30 до 3,61±0.37 нмоль/106 клеток (р<0,01). Активность форм ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови Отмечается прогрессивное возрастание общей ксантиноксидазной активности в мононуклеарах периферической крови пациентов по мере развития заболевания. Однако динамика состояния D- и 0-форм фермента, оказалась разнонаправленной: по мере прогрессирования заболевания происходит постепенное снижение средних значений активности D-формы ксантиноксидазы (на 12,5% в стадии IIB и на 75,5% в стадии III В) и нарастание активности 0-формы фермента (на 13,4% в стадии ПБ и в 6,5 раз в стадии IIIB). При этом достоверного уменьшения активности D-формы ксантиноксидазы в переходах клинического течения IIБ-IIB и IIB-IIIA не отмечается, а активность 0-формы достоверно возрастает только при переходе от бессимптомной фазы (ПБ) к ПГЛ (IIB) (р<0,05). Интегральные метаболические показатели дестабилизации генома мононуклеаров периферической крови У ВИЧ-инфицированных уже в бессимптомной фазе отмечается увеличение средних значений содержания полидезоксинуклеопротеидов (ПДН) в 1,3 раза, а выраженности однонитевых разрывов ДНК в 2.3 раза. Выявленные изменения прогрессируют по мере развития ВИЧ-инфекции, однако достоверных различий показателей нестабильности ге-нома между группами больных не отмечается, что не позволяет рассматривать их в качестве прогностических критериев перехода клинического течения болезни из одной стадии в другую. Характеристика поликлональных антител к белкам семейства БТШ-70 Каждый из полученных нами препаратов антител распознавал специфический профиль изоформ семейства БТШ-70, денатурированных до-децилсульфатом натрия. Антитела из сыворотки кролика N5 (антитела N5) различают две зоны молекулярной массы 68-72 кДа, которые представляют собой две изоформы семейства БТШ-70. Тепловое воздействие (43°С - 30 минут) на клетки HeLa, белковый экстракт которых использовали для приготовления иммуноблота. отражалась на результате иммуноблота усилением интенсивности зоны, соответствующей hsp70. Антитела N7 распознавали и hsp70. и р75, тогда как антитела N10 главным образом связывались только с р75. a Nil - с hsp70. Такие же примеры распознавания белков семейства БТШ-70 на иммуноблотах наблюдались, когда вместо клеток HeLa для анализа использовали мононуклеары периферической крови человека. Для того, чтобы определить компоненты семейства БТШ-70, которые реагируют в неденатурированном состоянии с представленной панелью антител, выполнено исследование иммунопреципитации. И одно-, и двумерные электрофоретические анализы иммунных комплексов не показывали различий между антигенами, преципитированными с тестируемыми антителами: иммунные комплексы содержали только одну зону. соответствующую индуцибельной форме hsp70. Иммобилизованные на твердой фазе антитела N5 и N7 также избирательно реагировали с антигеном hsp70 из белкового экстракта клеток HeLa. В итоге, по причине особых свойств полученных антител к БТШ-70. которые, как оказало-сь, распознают только один или несколько смежных сайтов на нативных молекулах БТШ-70. а также по причине свойств белков семейства БТШ-70 легко образовывать прочные соединения е другими белками клетки в обычных условиях, не представилось возможным использовать полученные поликлональные антитела для создания иммуноферментной тест-системы, предназначенной для количественного определения БТШ-70 в белковых экстрактах мононуклеаров периферической крови. Поэтому пришлось использовать указанные антитела в конструкции другого метода для определения БТШ-70 в белковых экстрактах - метода иммуноблотинга с -последующей денситометрией проявленных зон белков. Изменения состояния семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови на различных стадиях ВИЧ-инфекции Семейство БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови всех групп обследованных представлено полностью тремя изоформами: индуцибельной (hsp-70), конститутивной (hsc-70) и белком р75. Не обнаружено достоверных различий в соотношении изоформ БТШ-70 между донорами и пациентами в бессимптомной фазе ВИЧ-инфекции. Напротив, у больных в более поздних стадиях заболевания выявлено достоверное изменение анализируемых параметров по сравнению с контрольной группой. Наблюдается прогрессивное уменьшение средних значений содержания изоформ hsp-70 и р75, увеличение hsc-70 по мере развития клинической картины заболевания. Однако достоверное различие изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдали только по отношению к конститутивной изоформе (hsc-70). содержание которой увеличивается при переходе заболевания из бессимптомной фазы (ПБ) к фазе ПГЛ (IIB) от 59,3±2,5 до 66.2±2,7 у.д.е. (р<0,05) и от фазы ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) от 66,2±2.7 до 7l,l±3,0 у.д.е. (р<0,05). Исследование влияния теплового воздействия на мононуклеары периферической крови обследованных лиц позволило выявить прогрессивное достоверное уменьшение содержания индуцибельной изоформы hsp-70 при переходах ПБ к IIB от 38,9±4,3 до 30.4±3.1 у.д.е.' и IIB к IIIA от 30,4±3,1 до 22.1±3.7 у.д.е. (р<0,05). Нами предложен индекс hsp-70 Tlll/hsp-70 N. представляющий собой отношение содержания индуцибельной изоформы семейства БТШ-70 в клетке, подвергнутой тепловому шоку in vitro, к содержанию этого белка в клетке, находящейся при t=370С. Индекс hsp-70 TШ/hsp-70 N характеризует реакцию клетки на экстремальное воздействие синтезом и накоплением индуцибельной изоформы. по которому косвенно можно судить об адаптивной состоятельности исследованных клеток. Достоверное уменьшение индекса hsp-70 TlB/hsp-70 N наблюдается в обоих переходах клинических стадий: ПБ - IIB от 4,23 до 3.42 (р<0,05) и IIB - IIIA от 3,42 до 2.99 (р<0.05). что свидетельствует о прогрессивном ослаблении адаптивной функции мононуклеаров периферической крови. Воздействие ультрафиолетового облучения на нононуклеары периферической крови вызывало аналогичные сдвиги в системе белков теплового шока во всех группах больных. Представленный анализ полученных результатов выявляет значимость динамики показателей семейства белков теплового шока БТШ-70 мононуклеаров периферической крови для прогноза перехода клинического развития ВИЧ-инфекции от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. Патогенетическая связь исследованных биохимических показателей и белков теплового шока БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови при ВИЧ-инфекции Выявленная динамика показателей нестабильности генома мононуклеаров периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией сопровождалась существенным увеличением концентрации соединений, связывающих тиобарбитуровую кислоту, (продуктов свободнорадикального окисления) в клетках и их ядрах, что свидетельствует о повреждении ДНК мононуклеаров свободными радикалами. Ведущим генератором активных форм кислорода при этом. судя по полученным результатам, служит 0-форма ксантиноксидазы, образующаяся из D-формы фермента в результате ее ограниченного протеолиза. В свою очередь, протеолитическая трансформация D-формы ксантиноксидазы в 0-форму может быть прооксидантно-индуцированной. Таким образом можно предположить, что повреждение ДНК мононуклеаров вызвано свободными радикалами, генерируемыми ксантинок-сидазой. В результате атаки ДНК свободными радикалами наблюдается образование.апуриновых/апиримидиновых сайтов и однонитевых разрывов ДНК мононуклеаров периферической крови. Причем степень указанных процессов находится в зависимости от клинического течения ВИЧ-инфекции. В свою очередь, образование однонитевых разрывов является стимулирующим фактором повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах, а образующиеся олигонуклеотиды могут служить факторами активации экспрессии провирусного генома ВИЧ. интегрированного в ДНК мононуклеаров периферической крови. В результате формируется патологический круг. способствующий репликации ВИЧ (рис.1, в конце). Описанные процессы, среди которых наиболее значимым является свободнорадикальное окисление, сопровождаются характерными изменениями системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови, происходящими в тесной связи с клиническим течением ВИЧ-инфекции. Указанные изменения БТШ-70 в неинфицированных клетках могут быть опосредованы влиянием вирусного белка gplZO. взаимодействие которого с рецептором CD4 не только вызывает стрессовую реакцию. проявляющуюся рядом функциональных изменений, в том числе и усилением транскрипции с генов БТШ-70 (G.Furlini at al.. 1994).. но и приводит к программированной клеточной гибели - апоптозу зрелых СD4+-лимфоцитов или СD34+-гематопоэтических клеток-предшественников (Hofman Во, 1991; Montagnier L. et al., 1992). В инфицированных клетках экспрессия генов ВИЧ и генов, кодирующих синтез БТШ-70. осуществляется по общим механизмам с участием ядерного фактора NF-kB (Krumm A. et al.. 1993). Таким образом, и в неинфицированных, и в инфицированных ВИЧ иммунокомпетентных клетках крови больных показатели семейства БТШ-70 могут обоснованно рассматриваться в качестве индикатора активности репликативного процесса вируса, формирования вторичного иммунодефицита (вследствие дисфункции и гибели СБ4+-клеток) и развития клинического течения болезни. ВЫВОДЫ 1. Традиционные для оценки иммунного статуса лабораторные показатели (количество CD3+. CD4+. С08+-лимфоцитов. В-лимфоцитов. несущих Ig М, G. А; РТМЛ с КонА; концентрация Ig M, G. А; содержание циркулирующих иммунных комплексов) недостаточно полно отражают динамику перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. 2. Повышение активности 0-формы ксантиноксидазы и интенсивности процессов свободнорадикального окисления в мононуклеарах периферической крови прогрессируют в динамике заболевания, при этом достоверные различия (р<0,05 и р<0.01 соответственно) наблюдаются только при переходе от бессимптомной фазы к персистирувщей генерализованной лимфаденопатии. 3. При развитии ВИЧ-инфекции наблюдается увеличение относительной доли продуктов деградации хроматина (уровня полидезоксинуклеопротеидов) и интенсивности образования однонитевых разрывов ДНК в мононуклеарах периферической крови без достоверных различий в динамике болезни (р>0,05). 4. Белки теплового шока семейства БТШ-70 индуцируют образование поликлональных антител высокой специфичности и аффинности, распознающих один или несколько смежных сайтов на нативных молекулах белков, что исключает возможность использования полученных иммуноглобулинов в конструкции иммуноферментных тест-систем для количественного определения БТШ-70. но допускает их применение в методе иммуноблотинга. 5. При переходе клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний происходит достоверное увеличение содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови, характеризующее пребывание иммунокомпетентных клеток в состоянии хронического стресса (р<0.05). 6. Функциональное истощение системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови ВИЧ-инфицированных проявляется снижением интенсивности ответа (синтез индуцибельной изоформы БТШ-70) на стрессорные воздействия в виде гипертермии и ультрафиолетового облучения. 7. Динамика изменений белков теплового шока семейства БТШ-70 в совокупности с показателями свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови соответствует клиническому развитию ВИЧ-инфекции, что позволяет использовать их для прогнозирования перехода клинического течения заболевания из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Предложенный способ оценки функционального состояния системы белков теплового шока мононуклеаров периферической крови с применением стрессорных воздействий - гипертермии и ультрафиолетового излучения - целесообразно использовать в экспериментальных исследованиях, направленных на изучение патогенеза вторичных иммунодефицитных состояниях при ВИЧ-инфекции и других инфекционных заболеваниях. Комплекс показателей, отражающих состояние семейства белков теплового шока БТШ-70 (повышение содержания конститутивной изофор-мы hsc-70 более 68,9 у.д.е.) и системы ксантиноксидазы (повышение активности 0-формы более 1,03 мкмоль/мг белка-мин) мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными показателями иммунного статуса может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии. Для перехода ПГЛ в стадию вторичных заболеваний характерно повышение содержания конститутивной изоформы hsc-70 более 74,1 у.д.е. Включение указанных методов в комплексное лабораторно-диагностическое обследование больных ВИЧ-инфекцией позволяет прогнозировать клиническое течение заболевания. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Приготовление специфических поликлональных антител к белкам теплового шока // Мат. XI науч. конф. молодых ученых и специалистов академии.- Л.:ВМедА, 1990.- С.18-19. 2. The characterization and use of different antibodies against the hsp70 major heat shock protein family for the development of an Immunoassay // Electrophoresls.- 1991.-N12.-P.670- 673 (coавт. Б.А.Маргулис и др.). 3. The state of HSP-70 in lymphocytes In transition of HIV Infection to the clinical manifestation stage // Social and medical problem of AIDS.- St.-Petersburg. 1994.- P. 14 (соавт. Л.А.Кожемякин и др.). 4. HSP-70 state significance In the diagnosis and prognosis HIV-Infection // AIDS. cancer and related problems.- St.-Petersburg, 1996.- P. 130-131 (соавт. Е.И.Змушко). 5. Лабораторный контроль донорской крови в целях безопасности по ВИЧ-инфекции // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии.- СПб. 1996.- С. 67 (соавт. Е.И.Змушко и др.). 6. Диагностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Новые информационные технологии в медицине и экологии. -Гурзуф. Ялта, 1996.- С. 56 (соавт. Е.И.Змушко). 7. Прогностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Инфектология. Достижения и перспективы. -СПб: ВМедА, 1996.-С.99 (соавт. Е.И.Змушко и др.).
НАЧАРОВ Петр Васильевич
ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
14.00.10—инфекционные болезни
АВТОРЕФЕPAT диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
1997
Работа выполнена в Военно-медицинской академии.
Научный руководитель:
доктор медицинских наук Е. И. Змушко.
Научный консультант:
доктор медицинских наук профессор Ю. В. Лобзин.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук профессор В. В. Иванова, доктор медицинских наук профессор А. Г. Рахманова.
Ведущее учреждение—Российский научно-методический центр но профилактике и борьбе со СПИДом.
Защита диссертации состоится "" ............... 1997 г.
в .... часов на заседании специализированного совета Д 106.03.05
при Военно-медицинской академии (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии.
Автореферат разослан
1997 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Ю. И. Ляшенко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В России вопросы стратегии и тактики борьбы с ВИЧ-инфекцией определены работами В.И.Покровского (1988: 1989; 1993). В.И.Покровский (1987) предсказал грядущий размах распространения ВИЧ-инфекции в стране и внедрил в практическое здравоохранение структуру, предназначенную для борьбы со СПИДом. В настоящее время ВИЧ-инфекция охватила все страны мира. К середине 1996 года общее количество инфицированных вирусом иммунодефицита во всем мире достигло 27,9 миллионов человек (Рахманова А.Г., 1996). Несмотря на то, что выполнен беспрецедентно большой объем научных исследований по. проблеме ВИЧ-инфекции, предложены методы лекарственной терапии, позволяющие добиваться временного улучшения состояния больных СПИДом. до настоящего времени не известен ни один достоверный случай выздоровления, поэтому СПИД считают болезнью с летальностью 100%. Проблема ВИЧ-инфекции усугубляется еще и тем фактом, что с начала девяностых годов ВИЧ все более и более завоевывает основную популяцию населения, в то время как в течение первых десяти лет распространение шло преимущественно среди определенных групп населения, так называемых "групп риска" - наркоманы, гомосексуалисты. проститутки, больные гемофилией (Лобзин Ю.В., Казанцев А.П.. 1996). Актуальность проблемы определяет неуправляемое интенсивное возрастание случаев инфицированности, болезненности и смертности во всех странах мира (Шувалова Е.П., 1995). Выявление ВИЧ-инфицированных лиц не приводит к прекращению передачи ВИЧ от них, несмотря на уведомление их об уголовной ответственности за заражение (Покровский В.В. с соавт., 1996). Не решенными остаются основные проблемы СПИДа (Белозеров Е.С. с соавт., 1995): - отсутствие методов ранней диагностики: - полная неуправляемость патологических процессов у заболевшего: - отсутствие надежных клинических и лабораторных показателей перехода инфекционного процесса из латентной стадии в манифестную. При СПИДе и ВИЧ-инфекции достаточно хорошо изучены основные лабораторные диагностические показатели, свидетельствующие об инфицированности (Змушко Е.И. с соавт., 1996). Однако вопросы прогнозирования клинического течения ВИЧ-инфекции требуют дальнейшего изучения. Наибольшее клиническое значение имеет прогноз перехода от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ), а также от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний, который важен для своевременного назначения этиотропных и патогенетических средств (Рахманова А.Г.. Чайка Н.А., 1989). При поиске новых тестов, которые давали бы представление о состоянии иммунокомпетентных клеток крови при ВИЧ-инфекции, обратила на себя внимание группа сравнительно недавно открытых внутриклеточных белков, получивших название "белки теплового шока" (БТШ) или "стрессовые белки". Эти белки недостаточно изучены, но уже имеющиеся данные говорят, что они высоко консервативны в процессе филогенеза (Lindqulst S., 1986), необычно полифункциональны - играют важную роль во многих внутриклеточных иммунобиохимических процессах как в экстремальных, так и в нормальных условиях (Polla B.S., 1988), что позволяет предположить об участии белков теплового шока в формировании патобиохимических внутриклеточных связей при ВИЧ-инфекции. В ответ на воздействие неблагоприятных факторов, в том числе и вирусной инфекции, формируется неспецифическая клеточная реакция, которая сопровождается усилением процессов свободнорадикального окисления (Иванова В.В. с соавт., 1992: 1996), синтезом белков теплового шока (Kaufman S.H.E.. 1990) и является одним из механизмов дестабилизации генома клеток-мишеней. В этих условиях немаловажной представляется роль фермента ксантиноксидазы, которая служит генератором свободных радикалов при ряде патологических состояний клетки и является наиболее значимой среди прооксидантных систем, характерных для лимфоидной клетки (Кожемякин Л.А. с соавт.. 1992). Отсутствие в литературе данных по комплексной оценке процессов дестабилизации генома, сопряженных с активностью свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в иммунокомпетентных клетках крови в динамике развития ВИЧ-инфекции не позволяет определить значимость названных показателей для прогноза клинического течения болезни. Цель исследования: дать оценку возможности использования показателей белков теплового шока семейства БТШ-70 и комплекса биохимических изменений в мононуклеарах периферической крови в прогнозировании клинического течения ВИЧ-инфекции. Для достижения указанной цели необходимо было решить следуюие задачи: 1. Изучить динамику традиционных показателей иммунного стату-а у ВИЧ-инфицированных и определить их прогностическую значимость при переходе клинического течения болезни из одной стадии в другую. 2. Изучить изменения активности ксантиноксидазы, интенсивности процессов свободнорадикального окисления и показателей нестабильности генома мононуклеаров периферической крови при ВИЧ-инфекции и оценить их прогностическую значимость. 3. Разработать методические подходы к созданию иммунологического метода для количественного и качественного анализа белков семейства БТШ-70. 4. Изучить показатели белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови на разных фазах ВИЧ-инфекции. 5. Определить взаимосвязь изменений белков семейства БТШ-70 и комплекса биохимических показателей дестабилизации генома. свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови у больных в динамике заболевания и оценить их значимость для прогноза клинико-манифестных форм ВИЧ-инфекции. Научная новизна: 1. Впервые установлено, что нарастание накопления конститутивной изоформы белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных пропорционально степени выраженности клинических проявлений болезни. 2. Показана связь изменения показателей белков семейства БТШ-70 с уровнем нестабильности генома, активностью процессов свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией в процессе развития клинической картины заболевания. 3. Установлено, что изменение состояния белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови адекватно отражает вероятность перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии и от персистирующей генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний. 4. Установлено, что ВИЧ-инфекция вызывает нарушение реакции белков теплового шока (БТШ-70) мононуклеаров периферической крови в ответ на повреждающие воздействия (гипертермия. ультрафиолетовое облучение). Практическая значимость работы. Комплекс показателей, отражающих состояние системы белков теплового шока, системы ксантиноксидазы, процессов свободнорадикального и нестабильности генома мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными иммунологическими показателями может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу ПГЛ и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. Изучение показателей белков теплового шока мононуклеаров периферической крови человека как защитного механизма неспецифического действия может может быть применено для оценки эффективности лекарственных средств с иммуномодулирующими свойствами, а также для разработки новых диагностических подходов к прогнозированию иммунодефицитных состояний различной этиологии. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Переход клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний характеризуется увеличением содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови. 2. Изменения содержания белков семейства БТШ-70 в процессе ВИЧ-инфекции происходят на фоне увеличения показателей нестабильности генома, интенсификации процессов свободнорадикального окисления и повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови. 3. Показатели белков семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови в совокупности с традиционными иммунологическими показателями возможно использовать для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. Апробация работы. Результаты исследований доложены на XI-й и XII-й научных конференциях молодых ученых академии (ВМедА, Ленинград, 1990; ВМедА, Санкт-Петербург, 1992), на VI-м Всесоюзном биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1992), на Первой международной региональной конференции по ВИЧ-инфекции "Социальные и медицинские проблемы СПИДа" (Санкт-Петербург, 1994). на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного общества инфекционистов (Санкт-Петербург, 1996), на IV международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург. 1996), на III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург. 1996). Материалы диссертации использованы в отчетах по теме НИР N 50-93-В12 "Биохимические механизмы формирования иммунодефицитов под влиянием ВИЧ и иммунодиагностика иммунодефицитных состояний больных СПИДом" и по теме НИР N 60-95-П4 "Исследование роли системы белков теплового шока в патогенезе ВИЧ-инфекции". Реализация результатов работы. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Результаты работы используются в практике учебного процесса и научно-исследовательской работе кафедры инфекционных болезней, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, в работе НИЛ СПИДа и инфекционных заболеваний в ВС РФ Военно-медицинской академии, кафедры инфекционных болезней Семипалатинского государственного медицинского института, кафедры ЛОР-болезней с курсом аллергологии и иммунологии Чимкентского государственного медицинского института, кафедры инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований. обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 61 отечественный и 140 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 17 таблицами. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Общая характеристика больных и методов исследования В процессе работы были обследованы 34 инфицированных и больных ВИЧ-инфекцией, среди которых преобладали лица мужского пола в возрастной категории от 20 до 39 лет. Клиническое наблюдение и обследование больных проводили в больнице N 30 имени С.П. Боткина г.Санкт-Петербурга, Республиканской клинической инфекционной больнице г. Усть-Ижоры Ленинградской области, в Центре по борьбе и профилактике СПИДа г.Санкт-Петербурга. Больные были распределены по группам в соответствии с клинической классификацией В.И.Покровского (1989). Вич-инфицированных в стадии инкубации и больных в терминальной стадии не обследовали. Контрольную группу составили 25 практически здоровых мужчин (доноров крови) в возрасте от 20 до 39 лет - военнослужащие. Иммунологические и биохимические исследования проводили в Военно-медицинской академии, определение белков теплового шока - на базе института цитологии Академии наук. Диагноз ВИЧ-инфекции верифицировали серологически - по наличию в крови специфических антител к ВИЧ с помощью тест-систем для гетерогенного иммуноферментного анализа методом двойных антител (производства фирм СП"ДиаПЛЮС". Россия-Швейцария, СП"Авиценна", Россия-Сирия). Результаты иммуноферментного анализа подтверждали с помощью иммуноблотинга ("Du Pont", США). Для оценки иммунного статуса у обследованных пациентов изучали следующие показатели: количество лейкоцитов, лимфоцитов; субпопуляции Т-лимфоцитов с помощью проточного цитофлюориметра "EPICS-C" (Coulter elektronics. США-Франция) с применением моноклональных антител фирмы "Ortho Diagnostic Systems"(США): РТМЛ с КонА определяли по методу M.George. J.H.Vaughan (1962); количество В-лимфоцитов, несущих Ig M, G, А, определяли методом иммунофлюоресценции с использованием моноспецифических сывороток к иммуноглобулинам человека; концентрации Ig M. G, А, определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Mancini С. et al.. 1963); содержание циркулирующих иммунных комплексов по методу Ю.А.Гриневича. А.Н.Алферова (1981). Для исследования системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных была получена панель поликлональных антител. При иммунизации животных и аффинной очистки антител применяли препарат белков БТШ-70. Для получения препарата БТШ-70 использовали белковый экстракт, полученный из мышечной ткани крупного рогатого скота и клеток культуры HeLa. Выделяли препарат методами ионообменной (с DEAE-сефарозой; и аффинной(с АТФ-агарозой) хроматографии. Чистоту полученных белков БТШ-70 проверяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Препарат БТШ-70 имел чистоту около 98% и содержал смесь конститутивной (hsc-70) и индуцибельной (hsp-70) изоформ семейства БТШ-70. Из иммунной сыворотки кроликов выделяли антитела к БТШ-70 методами высаливания и аффинной хроматографии на колонках со смесью белков hsc-70 и hsp-70. Каждая серия антител подвергалась проверке на специфичность двумя методами - иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Для определения эпитопов БТШ-70, с которыми реагировали полученные антитела, использовали "сэндвич"-метод иммуноферментного анализа и реакция иммунопреципитации с предварительным мечением белков [35S]-метионином. Иммунопреципитаты были подвергнуты одно- и двумерному электрофорезу (Laemli U.K., 1970; O'Farrel P.H.. 1978). Поликлональные антитела использовали в конструкции иммуноблотинга с последующей денситометрией проявленных зон белков, что позволяло полуколичественно оценивать содержание изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови больных. Для проверки функционального состояния системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови служили нагрузочные тесты In vitro - тепловой шок (прогрев клеток при 43±0.3° С в водяном термостате) и ультрафиолетовое облучение с использованием прибора МД-73 "Изольда". Определение активности ксантиноксидазы и ее формы в мононуклеарной фракции крови проводили по методу У.Прайор (1979). Уровень процессов свободнорадикального окисления тотально в мононуклеарах периферической крови и отдельно в их ядрах оценивали по содержанию продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, которые определяли по методу M.Uchlyama, M.Michara (1978). В качестве интегральных биохимических показателей нестабильности генома клеток были избраны относительная доля продуктов деградации хроматина - полидезоксинуклеопротеидов, которые являются фрагментами ДНК, (Parks D.A., Granger D.N., 1986) и интенсивность образования однонитевых разрывов ДНК (Birnboim H.C.. Jewcac J.J.. 1981). Статистическая обработка цифровых данных осуществляли методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия (t) Стьюдента. В случае малых выборок использовали непараметрические статистические критерии. Расчеты производили с использованием программы STATGRAF (Statistical Graphics System), версия 2.1. 2. Результаты собственных исследований Гуморальный и клеточный иммунитет на разных стадиях болезни Исследование изменений в иммунной системе при развитии ВИЧ-инфекции имело целью выявить показатели, достоверно изменяющиеся при переходе от одной клинической стадии (фазы) к другой. Анализ изменений иммунологических параметров больных позволяет заключить, что в динамике ВИЧ-инфекции, в первую очередь, происходит прогрессирующее снижение функциональной состоятельности иммунной системы по мере развития клинической картины заболевания. Выявленная дефектность иммунного статуса касается, прежде всего. Т-системы иммунитета. Однако далеко не все исследованные традиционные иммунодиагностические параметры в своей динамике достоверно отражают начало перехода от бессимптомной фазы заболевания к манифестным стадиям. Достоверное различие между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдалось у следующих показателей: - при переходе от бессимптомной фазы (IIБ) к ПГЛ (IIB) - увеличение относительного содержания лимфоцитов от 39,00±2,13 до 45,92±1.96% (р<0,05), уменьшение содержания СD8+-лимфоцитов (супрессоров) ОТ 36,90±2.90 до 27,83±1,80% (p<0,01); - при переходе от ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) - увеличение содержания В (IgA+) -лимфоцитов от 0,06±0,01 до 0,10±0,01xlO9/л (p<0,01), увеличение концентрации IgG от 11,74±0.89 до 13.77±0.66 г/л (р<0.05), увеличение содержания циркулирующих иммунных комплексов - уменьшение пропускания светового потока от 92,1±1,2 до 84.3±1.6% (р<0,01). Как показал анализ, процентные (относительные) показатели во многих случаях нельзя использовать без оценки абсолютных значений. абсолютное содержание В(IgA+)-лимфоцитов, остается неизменным на стадии IIIA по сравнению с бессимптомной фазой, изменение концентрации иммуноглобулинов IgG происходят в диапазоне нормальных значений (9-15 г/л), что снижает прогностическую информативность указанных показателей. Важен и тот факт, что нет единого иммунологического показателя, который бы достоверно характеризовал оба перехода ВИЧ-инфекции - от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний. Содержание продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, в мононуклеарах периферической крови Уже в бессимптомной фазе у ВИЧ-инфицированных отмечается увеличение средних значений содержания ТБК-связывающих соединений в мононуклеарах периферической крови на 56%, а в их ядрах - на 90%. По мере развития заболевания уровень названных продуктов свободно-радикального окисления возрастает, достигая максимума у больных в стадии IIIB. При этом средние значения в группе больных в стадии IIIB превышали контрольные в 3.2 раза в мононуклеарах и в 4,6 раза в ядрах мононуклеаров. Однако достоверный рост показателей свободнорадикального окисления между группами больных ВИЧ-инфекцией отмечается в мононуклеарах. но не в ядрах, и только в одном из интересующих нас переходах клинического течения - из бессимптомной фазы (ПБ) к ПГЛ (IIB) от 2,82±0,30 до 3,61±0.37 нмоль/106 клеток (р<0,01). Активность форм ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови Отмечается прогрессивное возрастание общей ксантиноксидазной активности в мононуклеарах периферической крови пациентов по мере развития заболевания. Однако динамика состояния D- и 0-форм фермента, оказалась разнонаправленной: по мере прогрессирования заболевания происходит постепенное снижение средних значений активности D-формы ксантиноксидазы (на 12,5% в стадии IIB и на 75,5% в стадии III В) и нарастание активности 0-формы фермента (на 13,4% в стадии ПБ и в 6,5 раз в стадии IIIB). При этом достоверного уменьшения активности D-формы ксантиноксидазы в переходах клинического течения IIБ-IIB и IIB-IIIA не отмечается, а активность 0-формы достоверно возрастает только при переходе от бессимптомной фазы (ПБ) к ПГЛ (IIB) (р<0,05). Интегральные метаболические показатели дестабилизации генома мононуклеаров периферической крови У ВИЧ-инфицированных уже в бессимптомной фазе отмечается увеличение средних значений содержания полидезоксинуклеопротеидов (ПДН) в 1,3 раза, а выраженности однонитевых разрывов ДНК в 2.3 раза. Выявленные изменения прогрессируют по мере развития ВИЧ-инфекции, однако достоверных различий показателей нестабильности ге-нома между группами больных не отмечается, что не позволяет рассматривать их в качестве прогностических критериев перехода клинического течения болезни из одной стадии в другую. Характеристика поликлональных антител к белкам семейства БТШ-70 Каждый из полученных нами препаратов антител распознавал специфический профиль изоформ семейства БТШ-70, денатурированных до-децилсульфатом натрия. Антитела из сыворотки кролика N5 (антитела N5) различают две зоны молекулярной массы 68-72 кДа, которые представляют собой две изоформы семейства БТШ-70. Тепловое воздействие (43°С - 30 минут) на клетки HeLa, белковый экстракт которых использовали для приготовления иммуноблота. отражалась на результате иммуноблота усилением интенсивности зоны, соответствующей hsp70. Антитела N7 распознавали и hsp70. и р75, тогда как антитела N10 главным образом связывались только с р75. a Nil - с hsp70. Такие же примеры распознавания белков семейства БТШ-70 на иммуноблотах наблюдались, когда вместо клеток HeLa для анализа использовали мононуклеары периферической крови человека. Для того, чтобы определить компоненты семейства БТШ-70, которые реагируют в неденатурированном состоянии с представленной панелью антител, выполнено исследование иммунопреципитации. И одно-, и двумерные электрофоретические анализы иммунных комплексов не показывали различий между антигенами, преципитированными с тестируемыми антителами: иммунные комплексы содержали только одну зону. соответствующую индуцибельной форме hsp70. Иммобилизованные на твердой фазе антитела N5 и N7 также избирательно реагировали с антигеном hsp70 из белкового экстракта клеток HeLa. В итоге, по причине особых свойств полученных антител к БТШ-70. которые, как оказало-сь, распознают только один или несколько смежных сайтов на нативных молекулах БТШ-70. а также по причине свойств белков семейства БТШ-70 легко образовывать прочные соединения е другими белками клетки в обычных условиях, не представилось возможным использовать полученные поликлональные антитела для создания иммуноферментной тест-системы, предназначенной для количественного определения БТШ-70 в белковых экстрактах мононуклеаров периферической крови. Поэтому пришлось использовать указанные антитела в конструкции другого метода для определения БТШ-70 в белковых экстрактах - метода иммуноблотинга с -последующей денситометрией проявленных зон белков. Изменения состояния семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови на различных стадиях ВИЧ-инфекции Семейство БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови всех групп обследованных представлено полностью тремя изоформами: индуцибельной (hsp-70), конститутивной (hsc-70) и белком р75. Не обнаружено достоверных различий в соотношении изоформ БТШ-70 между донорами и пациентами в бессимптомной фазе ВИЧ-инфекции. Напротив, у больных в более поздних стадиях заболевания выявлено достоверное изменение анализируемых параметров по сравнению с контрольной группой. Наблюдается прогрессивное уменьшение средних значений содержания изоформ hsp-70 и р75, увеличение hsc-70 по мере развития клинической картины заболевания. Однако достоверное различие изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдали только по отношению к конститутивной изоформе (hsc-70). содержание которой увеличивается при переходе заболевания из бессимптомной фазы (ПБ) к фазе ПГЛ (IIB) от 59,3±2,5 до 66.2±2,7 у.д.е. (р<0,05) и от фазы ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) от 66,2±2.7 до 7l,l±3,0 у.д.е. (р<0,05). Исследование влияния теплового воздействия на мононуклеары периферической крови обследованных лиц позволило выявить прогрессивное достоверное уменьшение содержания индуцибельной изоформы hsp-70 при переходах ПБ к IIB от 38,9±4,3 до 30.4±3.1 у.д.е.' и IIB к IIIA от 30,4±3,1 до 22.1±3.7 у.д.е. (р<0,05). Нами предложен индекс hsp-70 Tlll/hsp-70 N. представляющий собой отношение содержания индуцибельной изоформы семейства БТШ-70 в клетке, подвергнутой тепловому шоку in vitro, к содержанию этого белка в клетке, находящейся при t=370С. Индекс hsp-70 TШ/hsp-70 N характеризует реакцию клетки на экстремальное воздействие синтезом и накоплением индуцибельной изоформы. по которому косвенно можно судить об адаптивной состоятельности исследованных клеток. Достоверное уменьшение индекса hsp-70 TlB/hsp-70 N наблюдается в обоих переходах клинических стадий: ПБ - IIB от 4,23 до 3.42 (р<0,05) и IIB - IIIA от 3,42 до 2.99 (р<0.05). что свидетельствует о прогрессивном ослаблении адаптивной функции мононуклеаров периферической крови. Воздействие ультрафиолетового облучения на нононуклеары периферической крови вызывало аналогичные сдвиги в системе белков теплового шока во всех группах больных. Представленный анализ полученных результатов выявляет значимость динамики показателей семейства белков теплового шока БТШ-70 мононуклеаров периферической крови для прогноза перехода клинического развития ВИЧ-инфекции от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. Патогенетическая связь исследованных биохимических показателей и белков теплового шока БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови при ВИЧ-инфекции Выявленная динамика показателей нестабильности генома мононуклеаров периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией сопровождалась существенным увеличением концентрации соединений, связывающих тиобарбитуровую кислоту, (продуктов свободнорадикального окисления) в клетках и их ядрах, что свидетельствует о повреждении ДНК мононуклеаров свободными радикалами. Ведущим генератором активных форм кислорода при этом. судя по полученным результатам, служит 0-форма ксантиноксидазы, образующаяся из D-формы фермента в результате ее ограниченного протеолиза. В свою очередь, протеолитическая трансформация D-формы ксантиноксидазы в 0-форму может быть прооксидантно-индуцированной. Таким образом можно предположить, что повреждение ДНК мононуклеаров вызвано свободными радикалами, генерируемыми ксантинок-сидазой. В результате атаки ДНК свободными радикалами наблюдается образование.апуриновых/апиримидиновых сайтов и однонитевых разрывов ДНК мононуклеаров периферической крови. Причем степень указанных процессов находится в зависимости от клинического течения ВИЧ-инфекции. В свою очередь, образование однонитевых разрывов является стимулирующим фактором повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах, а образующиеся олигонуклеотиды могут служить факторами активации экспрессии провирусного генома ВИЧ. интегрированного в ДНК мононуклеаров периферической крови. В результате формируется патологический круг. способствующий репликации ВИЧ (рис.1, в конце). Описанные процессы, среди которых наиболее значимым является свободнорадикальное окисление, сопровождаются характерными изменениями системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови, происходящими в тесной связи с клиническим течением ВИЧ-инфекции. Указанные изменения БТШ-70 в неинфицированных клетках могут быть опосредованы влиянием вирусного белка gplZO. взаимодействие которого с рецептором CD4 не только вызывает стрессовую реакцию. проявляющуюся рядом функциональных изменений, в том числе и усилением транскрипции с генов БТШ-70 (G.Furlini at al.. 1994).. но и приводит к программированной клеточной гибели - апоптозу зрелых СD4+-лимфоцитов или СD34+-гематопоэтических клеток-предшественников (Hofman Во, 1991; Montagnier L. et al., 1992). В инфицированных клетках экспрессия генов ВИЧ и генов, кодирующих синтез БТШ-70. осуществляется по общим механизмам с участием ядерного фактора NF-kB (Krumm A. et al.. 1993). Таким образом, и в неинфицированных, и в инфицированных ВИЧ иммунокомпетентных клетках крови больных показатели семейства БТШ-70 могут обоснованно рассматриваться в качестве индикатора активности репликативного процесса вируса, формирования вторичного иммунодефицита (вследствие дисфункции и гибели СБ4+-клеток) и развития клинического течения болезни. ВЫВОДЫ 1. Традиционные для оценки иммунного статуса лабораторные показатели (количество CD3+. CD4+. С08+-лимфоцитов. В-лимфоцитов. несущих Ig М, G. А; РТМЛ с КонА; концентрация Ig M, G. А; содержание циркулирующих иммунных комплексов) недостаточно полно отражают динамику перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. 2. Повышение активности 0-формы ксантиноксидазы и интенсивности процессов свободнорадикального окисления в мононуклеарах периферической крови прогрессируют в динамике заболевания, при этом достоверные различия (р<0,05 и р<0.01 соответственно) наблюдаются только при переходе от бессимптомной фазы к персистирувщей генерализованной лимфаденопатии. 3. При развитии ВИЧ-инфекции наблюдается увеличение относительной доли продуктов деградации хроматина (уровня полидезоксинуклеопротеидов) и интенсивности образования однонитевых разрывов ДНК в мононуклеарах периферической крови без достоверных различий в динамике болезни (р>0,05). 4. Белки теплового шока семейства БТШ-70 индуцируют образование поликлональных антител высокой специфичности и аффинности, распознающих один или несколько смежных сайтов на нативных молекулах белков, что исключает возможность использования полученных иммуноглобулинов в конструкции иммуноферментных тест-систем для количественного определения БТШ-70. но допускает их применение в методе иммуноблотинга. 5. При переходе клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний происходит достоверное увеличение содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови, характеризующее пребывание иммунокомпетентных клеток в состоянии хронического стресса (р<0.05). 6. Функциональное истощение системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови ВИЧ-инфицированных проявляется снижением интенсивности ответа (синтез индуцибельной изоформы БТШ-70) на стрессорные воздействия в виде гипертермии и ультрафиолетового облучения. 7. Динамика изменений белков теплового шока семейства БТШ-70 в совокупности с показателями свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови соответствует клиническому развитию ВИЧ-инфекции, что позволяет использовать их для прогнозирования перехода клинического течения заболевания из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Предложенный способ оценки функционального состояния системы белков теплового шока мононуклеаров периферической крови с применением стрессорных воздействий - гипертермии и ультрафиолетового излучения - целесообразно использовать в экспериментальных исследованиях, направленных на изучение патогенеза вторичных иммунодефицитных состояниях при ВИЧ-инфекции и других инфекционных заболеваниях. Комплекс показателей, отражающих состояние семейства белков теплового шока БТШ-70 (повышение содержания конститутивной изофор-мы hsc-70 более 68,9 у.д.е.) и системы ксантиноксидазы (повышение активности 0-формы более 1,03 мкмоль/мг белка-мин) мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными показателями иммунного статуса может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии. Для перехода ПГЛ в стадию вторичных заболеваний характерно повышение содержания конститутивной изоформы hsc-70 более 74,1 у.д.е. Включение указанных методов в комплексное лабораторно-диагностическое обследование больных ВИЧ-инфекцией позволяет прогнозировать клиническое течение заболевания. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Приготовление специфических поликлональных антител к белкам теплового шока // Мат. XI науч. конф. молодых ученых и специалистов академии.- Л.:ВМедА, 1990.- С.18-19. 2. The characterization and use of different antibodies against the hsp70 major heat shock protein family for the development of an Immunoassay // Electrophoresls.- 1991.-N12.-P.670- 673 (coавт. Б.А.Маргулис и др.). 3. The state of HSP-70 in lymphocytes In transition of HIV Infection to the clinical manifestation stage // Social and medical problem of AIDS.- St.-Petersburg. 1994.- P. 14 (соавт. Л.А.Кожемякин и др.). 4. HSP-70 state significance In the diagnosis and prognosis HIV-Infection // AIDS. cancer and related problems.- St.-Petersburg, 1996.- P. 130-131 (соавт. Е.И.Змушко). 5. Лабораторный контроль донорской крови в целях безопасности по ВИЧ-инфекции // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии.- СПб. 1996.- С. 67 (соавт. Е.И.Змушко и др.). 6. Диагностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Новые информационные технологии в медицине и экологии. -Гурзуф. Ялта, 1996.- С. 56 (соавт. Е.И.Змушко). 7. Прогностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Инфектология. Достижения и перспективы. -СПб: ВМедА, 1996.-С.99 (соавт. Е.И.Змушко и др.).
