Асимметрия мембран

Введение

Все биологические мембраны асимметричны, и легко понять почему: ведь каждая из них имеет две поверхности, омываемые разными средами. В качестве примера можно привести плазматическую мембрану, обращенную одной стороной в цитоплазму, а другой — во внеклеточное пространство. Именно трансмембранная асимметрия, дифференцирующая две половинки бислоя, обусловливает чувствительность мембраны к изменениям среды по обе ее стороны. Очевидно, что асимметрия мембранных белков зависит от способа, каким тот или иной белок был внедрен в мембрану. Скорость «флип-флопа» белков в бислое пренебрежимо мала. Мембранные липиды тоже расположены асимметрично. Наиболее убедительно это было показано для эритроцитов. Как возникает липидная асимметрия и как она поддерживается — в настоящее время во многом неясно. В одних случаях важную роль играют физические факторы, в частности кривизна мембраны, в других определяющий вклад вносят взаимодействия с цитоскелетом или участие АТР-зависимых ферментоподобных «флипаз».

Ясно, что помимо трансмембранной асимметрии мембранам присуща и латеральная негомогенность. Поверхностная мембрана многих эукариотических клеток сильно поляризована и имеет четко выраженные макроскопические домены. В качестве примера можно привести базолатеральную и апикальную области плазматической мембраны поляризованных эпителиальных клеток. Эти домены выполняют различные функции, имеют неодинаковый состав и физически разнесены по поверхности клетки. Мембраны тила-коидов в хлоропластах также имеют доменную структуру; в частности, у них есть плотно прилегающие друг к другу мембранные участки и несоприкасающиеся области, содержащие различные элементы системы электронного транспорта. Эти достаточно протяженные латеральные домены могут существовать за счет специфических белок-белковых взаимодействий между мембранами или могут быть обусловлены наличием в самой мембране специальных структур, взаимодействием с компонентами цитоскелета или агрегацией белков в плоскости мембраны. Детали этих взаимодействий пока неизвестны.

Что касается возможности существования малых липидных доменов в мембране, т. е. отдельных участков, в пределах которых бис-лой имеет специфические физические свойства и состав, то говорить об этом можно с меньшей определенностью. В модельных системах при различных условиях действительно наблюдается латеральное разделение фаз, и заманчиво было бы предположить, что подобное разделение существует и в биологических мембранах при физиологических условиях. Возможно, это не-бислойные элементы мембраны или какие-то переходные структуры.

Мы рассмотрим асимметричное распределение мембранных белков и липидов. В целом всю эту область можно назвать мембранной топографией. Сюда же относится и описание цитоскелета, поскольку он, по-видимому, играет важную роль в организации белков и, возможно, липидов в плазматической мембране эукариот.

1. Топография мембранных белков

Мембранные белки встроены в бислой асимметрично, и эта асимметрия регулируется кинетическими факторами. Энергия активации для такой переориентации белка в мембране, когда полярные и заряженные остатки, обычно находящиеся на поверхности, хотя бы временно оказываются в гидрофобной области бислоя, очень велика. И хотя известно, что некоторые мембранные белки диффундируют вдоль бислоя и/или вращаются вокруг оси, перпендикулярной его поверхности, нет никаких данных о том, что какое-либо спонтанное перемещение может привести к изменению транс-мембранной ориентации белка по отношению к двум сторонам бислоя.

В этом разделе представлен обзор основных экспериментальных подходов к определению трансмембранной ориентации белков в би-слое. Есть много способов, позволяющих предсказать локализацию спиралей, пронизывающих мембрану, исходя из первичной последовательности данного белка. В одних случаях эти предсказания являются достаточно четкими и согласуются с результатами экспериментальных исследований, в других однозначный ответ получить не удается. Ни одна модель, построенная с помощью компьютера, не является окончательной, она дает лишь исходную точку для анализа. Совершенно ясно, что любое детальное исследование интегрального мембранного белка должно включать экспериментальное изучение его топографии. Сделать это бывает непросто, и часто для построения адекватной модели приходится применять несколько подходов, поскольку ни один метод не застрахован от ошибок. Детальному рассмотрению отдельных экспериментальных подходов посвящены обзоры.

1.1 Методология протеолиз

Использование протеаз для определения топографии белков в ряде случаев оказалось исключительно плодотворным. Ориентированный мембранный препарат, содержащий изучаемый белок, обрабатывают протеолитическим ферментом и по местам расщепления устанавливают те участки полипептида, которые находятся с наружной стороны мембраны. Ключевым моментом является приготовление мембран с однозначной топологической ориентацией; только в этом случае возможна адекватная интерпретация результатов фрагментации изучаемого белка. Некоторые мембраны можно изучать без предварительного выделения. Однако в большинстве случаев необходима тщательная работа по получению топологически ориентированного препарата с вывернутой мембраной или с мембраной, имеющей нативную ориентацию. Такие препараты были получены для мембран эритроцитов, плазматических мембран некоторых эукариотических клеток, внутренних митохондриальных мембран, мембран саркоплазматического рети-кулума и некоторых бактериальных мембран. В отдельных случаях удается исследовать локализацию конкретного белка, специально встроенного в ориентированную мембрану реконструированных протеолипосом. В биологических мембранах помимо изучаемого белка чаще всего находятся и другие белки. Если изучаемый белок преобладает, то продукты протеолиза можно выделить и охарактеризовать. Если же он является минорным белковым компонентом, то для идентификации фрагментов приходится использовать косвенные методы, связанные с применением специфических антител или химических реагентов с последующим электрофорезом в ПААГ в присутствии ДСН. Важно убедиться в том, что те участки белка, которые недоступны для расщепления, не будут подвергаться гидролизу из-за повреждения мембран при первоначальном протеолизе. Необходимо также быстро и обратимо ингибировать протеа-зы, поскольку многие из этих ферментов остаются активными даже после добавления ДСН перед электрофорезом. Следует иметь в виду, что отсутствие расщепления еще ничего не означает, поскольку возможные места расщепления на наружной поверхности могут оказаться недоступными для протеазы из-за особенностей третичной структуры мембранного белка.

Как и в случае многих растворимых белков, протеолиз не обязательно сопровождается существенными изменениями в третичной или четвертичной структуре мембранного белка in situ, хотя его биологическая функция может быть полностью утрачена. В тех случаях, когда при расщеплении по одному или двум местам активность исчезает, с помощью протеолиза можно идентифицировать и даже выделить функционально важные домены белка.

В качестве примеров, иллюстрирующих использование протеоли-тических ферментов, можно привести белок полосы 3 эритроцитов, бактериородопсин, лактозопермеазу Е. coli и субъединицу IV цитохром с-оксидазы.

Иммунологические методы

Очень ценным инструментом для определения топографии мембранных белков являются специфичные антитела. В этом случае исследуют связывание антител с белками только в ориентированных мембранных препаратах типа мембранных везикул Е. coli. Анализ можно сделать количественным, если использовать соответствующие иммунологические методы. Места связывания можно локализовать с помощью электронной микроскопии, пометив антитела коллоидным золотом или используя золото, связанное со специфичным комплексом антиген—антитело на поверхности мембраны. Ясно, что в процессе приготовления мембранного препарата не должны разрушаться нативные топографические структуры. Чем точнее данные о местах связывания антител, тем информативнее будут эти эксперименты. Если исследовать ориентированные мембраны с нормальной или вывернутой ориентацией, то с помощью поли-клональных антител против определенного очищенного полипептидного фрагмента можно определить, имеет ли изучаемый белок участки, экспонированные на какой-либо одной стороне мембраны. Однако такие эксперименты не позволяют определить, какая часть белка экспонирована. Более детальную информацию можно получить с помощью двух подходов. Один состоит в использовании мо-ноклональных антител, а второй предусматривает применение поли-клональных антител против пептидов, соответствующих определенным областям белка.

Наиболее полезны те из них, которые связываются как с белком в мембране, так и с денатурированными фрагментами белка, что позволяет изучать белки после их разделения с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН. Это особенно важно для локализации места связывания антител на полипептиде. В принципе эпитоп можно локализовать с точностью до нескольких аминокислотных остатков. В качестве примеров успешного использования моноклональных антител можно привести родопсин, бактериородопсин, ацетилхолиновый рецептор и белок LamB — рецептор фага X из наружной мембраны Е. coli.

Использование антител против синтетических пептидов, соответствующих отдельным белковым фрагментам, позволяет точно выяснить, доступна ли эта область белка для связывания антитела. Если антитела, специфичные к определенной аминокислотной последовательности, связываются с нативной формой белка в мембране, то исследователь получает мощный инструмент для определения топографии белка. Этим путем можно проверять отдельные топографические модели. Примерами успешного использования данного подхода являются работы по лактозопермеазе Е. coli, микросомному цитохрому Р450 и ацетилхолиновому рецептору. К сожалению, нет гарантий, что антипептндные антитела вообще будут связываться с белком. Потенциальный центр связывания в нативном белке может находиться в такой конформации или так быть упрятанным внутри белковой глобулы, что не будет узнан антителом или доступен для него. Действительно, в некоторых случаях антипептидные антитела не связываются с белком даже после его денатурации в ДСН.

Весьма остроумным является подход к определению топографии полипептида, основанный на методах молекулярной генетики. Он состоит во введении чужеродного эпитопа в аминокислотную последовательность мембранного белка с последующим использованием антител, специфичных к этому эпитопу.

Химическая модификация

Этот подход широко использовался для локализации белков или их отдельных участков на поверхности мембраны или в ее гидрофобной области. Белок вступает в реакцию с реагентом, который может действовать лишь на одной стороне ориентированной мембраны или в ее гидрофобной сердцевине. Реагент, предназначенный для идентификации белка на поверхности мембраны, должен быть сильно полярным; он не должен адсорбироваться на мембране или накапливаться внутри ее. Для локализации же той части белка, которая находится в контакте с углеводородными хвостами липидных молекул, следует использовать очень неполярные реагенты, которые концентрируются в гидрофобной области мембраны. Артефакты, возникающие при этом подходе, чаще всего бывают связаны с тем, что реагент модифицирует белок не только в том реакционном пространстве, для которого он был предназначен. Например, реагент, направленный на модификацию поверхности мембраны, может иметь достаточно неполярный характер, чтобы проникать через мембрану и получать доступ к белкам внутреннего компартмента. Химическая модификация может также привести к повреждению мембраны и сделать ее проницаемой для того реагента, который, как ожидается, должен быть непроникающим. В табл. 1 перечислены некоторые из химических реагентов, используемые для изучения топографии мембранных белков.

Модификацию белков на поверхности мембраны часто проводят с помощью фермента лактопероксидазы, которая катализирует иодирование доступных остатков тирозина или гистидина. Поскольку реакция между I" и Н₂О₂ происходит в активном центре лактопероксидазы, последняя должна быть в высшей степени «векторной», т.е. локализованной только на одной стороне мембраны. Однако при определенных условиях в ходе реакции может образовываться Ь, который, проникая через мембрану, способен иодировать аминокислотные остатки на внутренней стороне мембраны. Это показывает, насколько важен строгий контроль условий протекания реакций для исключения артефактов.

Для поверхностной модификации часто используются и другие реагенты — соли диазония, которые реагируют с боковыми цепями остатков лизина, цистеина, тироксина и гистидина, а также фотоак-тивируемые реагенты, например NAP-таурин.

В табл. 1 перечислен также ряд неполярных фотоактивируемых реагентов, которые используются для избирательной модификации аминокислотных остатков белка, контактирующих с гидрофобной областью бислоя. Эти реагенты обычно добавляют к мембранному препарату, дают им возможность накопиться в бислое и затем подвергают их фотоактивации. Преимущество образующихся при этом нитренов и карбенов состоит в том, что их реакции намного менее специфичны по сравнению с реакциями других активных частиц, так что ковалентная модификация не ограничивается боковыми цепями каких-либо определенных аминокислот. Правда, нитрены проявляют избирательность по отношению к нуклеофилам. Использование карбенов предпочтительнее, поскольку они вступают в реакцию с более высоким выходом. Для получения информации о вторичной структуре трансмембранных участков полипептидной цепи путем определения тех остатков, которые контактируют с липидами, использовали реагент ТИД. Например, спираль С бак-

Таблица 1. Некоторые реагенты, применяемые для изучения топографии мембранных белков

териородопсина включает метку лишь с одной стороны; это согласуется с представлением о том, что данная спираль является трансмембранной, причем ее неполярная область обращена в липидную фазу.

Локализация специфических центров

Ценную информацию иногда можно получить, определяя положение специфических центров в ряде белков. Например, места присоединения сахарных остатков в гликопротеинах плазматической мембраны всегда находятся на ее наружной поверхности, так что выявление их в полипептидной цепи имеет и топологическую ценность. Столь же информативными могут быть и данные о локализации сайтов модификации белка, например сайтов фосфорилирования, если локализация модифицирующего фермента известна. Так, в белках плазматической мембраны фосфорилированные аминокислотные остатки находятся на цитоплазматической стороне. Аналогичным образом может оказаться полезной локализация специфических мест связывания. Например, были идентифицированы места связывания бактериофага с экспонированными на поверхности клетки участками белков ОтрА и LamB наружной мембраны Е. coli; для этого использовались мутантные белки.

Генетические подходы

Возможность генетической модификации мембранных белков привела к созданию новых подходов к их топографическому анализу. Такие методы, по всей вероятности, будут применяться все шире, однако пока число удачных примеров не столь велико, чтобы судить об их надежности и универсальности. Так, в белок ОтрА методами генной инженерии были встроены в определенные места короткие пептиды, затем был проведен протеолиз и по его результатам определено, были ли участки, содержащие включенный пептид, экспонированы на поверхности клетки. Анализ мутантных вариантов позволил идентифицировать также места связывания фага и соответствующие эпитопы в белках, экспонированных на наружной стороне мембраны.

Ценные данные о топографии белков цитоплазматической мембраны Е. coli были получены и с помощью метода гибридизации белков. Гибридные белки можно сконструировать так, что их N-концевой участок будет представлен мембранным белком, а на С-конце будет находиться каталитический центр щелочной фосфатазы. Щелочная фосфатаза обычно локализуется в периплазматическом пространстве Е. coli, куда она транспортируется и где проявляет свою ферментативную активность. Синтез многих мембранных белков, по-видимому, осуществляется линейным образом, начиная с N-конца. Поэтому, если место сочленения, где начинается последовательность щелочной фосфатазы, локализовано на периплаз-матической стороне мембраны, то гибридный белок будет транспортироваться в периплазму и проявлять ферментативную активность. Если же место сочленения находится на цитоплазматической стороне, то щелочная фосфатаза в гибридном белке останется внутри клетки и будет проявлять низкую ферментативную активность. Следовательно, те места сочленения в гибридных белках, которые приводят к высокой активности щелочной фосфатазы, будут соответствовать наружным доменам мембранного белка.

1.2 ПРИМЕРЫ АНАЛИЗА ТОПОГРАФИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Один из наиболее ярких примеров детального топографического анализа мембранного белка — это изучение бактериородопсина. Как показывают данные по реконструкции изображения, бактерио-родопсин имеет семь трансмембранных сегментов, по-видимому представляющих собой а-спирали. Результаты протеолиза, химической модификации и связывания антител согласуются с этой моделью, хотя точные границы трансмембранных сегментов не установлены.

Еще один белок, для которого получены непротиворечивые топографические данные, — это бычий родопсин. В этом случае анализ первичной структуры тоже предполагает наличие семи трансмембранных а-спиралей с соединяющими их петлями. С такой моделью согласуются результаты изучения топографии с помощью антител и протеаз, а также данные о локализации мест фосфорилирования и присоединения углеводов. Обратите внимание, что хотя бактериородопсин и родопсин связывают одну и ту же простетическую группу — ретиналь — и, по-видимому, уложены в мембране одинаковым образом, никакой гомологии в их аминокислотной последовательности не наблюдается и выполняют они разные функции. Бактериородопсин является бактериальным светочувствительным протонным насосом, а родопсин — это зрительный пигмент, содержащийся в палочках сетчатки. Под действием света родопсин претерпевает светозависимые конформационные изменения, инициируя целый каскад событий, конечным результатом которых является зрительный сигнал.

Большое внимание было уделено анализу топографии еще одного трансмембранного белка — ацетилхолинового рецептора. Исходя из анализа первичной последовательности, было предложено несколько топографических моделей этого рецептора, адекватность которых проверялась с помощью иммунологических методов. Следует, однако, отметить, что полученные данные весьма противоречивы; это означает, что применение этих методов не всегда является оправданным.

В качестве последнего примера можно привести микросомный цитохром Ь$. Этот белок функционирует как переносчик электронов, участвуя в некоторых окислительно-восстановительных реакциях в эидоплазматическом ретикулуме. Цнтохром bs — это амфифильный белок, в котором гемсвязывающий каталитически активный домен соединяется с помощью десяти аминокислотных остатков с неполярным доменом — мембранным якорем. Эти два домена можно отделить друг от друга путем проте-олиза. Структуру гемсвязывающего фрагмента изучали методом рентгеноструктуриого анализа. Строение якорного пептида на С-конце белка неизвестно. Топографические исследования, проводившиеся в нескольких лабораториях, были направлены на выяснение одного простого вопроса: пересекает ли этот якорь бислой или он погружен в него только наполовину и, сделав петлю, идет обратно, так что его N- и С-концы оказываются по одну сторону мембраны? Несмотря на все усилия, окончательный ответ на этот вопрос пока не получен. В большинстве исследований использовался очищенный цитохромом bs, встроенный в фосфолипидные везикулы. Проблема состоит в том, что разные методики реконструкции дают разные кон-формации белковой молекулы. При «непрочном» связывании цито-хрома bs С-конец доступен для карбоксипептидазы Y и локализован на той же стороне, что и гемсвязывающий домен. Однако с помощью определенных методик можно получить «прочно» связанный домен, в котором С-конец недоступен для протеолиза, что, вероятно, отвечает топографической ориентации белка in vivo. Корана и др. пытались решить этот вопрос, изучая модификацию двух форм этого белка с помощью фотоактивируемых аналогов фосфолипидов. Они пришли к выводу, что в «прочно» связанной форме белка мембранный якорь пронизывает бис-лой. Этот вывод, однако, не нашел полной поддержки. Другие подходы либо вообще не позволили сделать выбор в пользу той или иной модели, либо дали противоречивые результаты.

Все сказанное выше показывает, что в отсутствие структурных данных высокого разрешения трудно определить способ укладки интегральных белков в мембране. И в самом деле, число белков, для которых это удалось сделать, очень мало.

2. Цитоскелет

В принципе как трансмембранное, так и латеральное распределение мембранных компонентов может зависеть от их взаимодействия со структурами, находящимися на поверхности мембраны. В ряде случаев такая зависимость была четко выявлена, в частности с этим связан все более возрастающий, интерес к взаимодействию мембраны с цитоскелетом. Цитоскелет — это сложная сеть волокон разного типа, обнаруженная в эукариотических клетках. У прокариоти-ческих клеток ничего подобного не выявлено. Основная функция этой системы, по-видимому, связана с механикой клетки. Цитоскелет обеспечивает механическую опору для плазматической мембраны и тем самым определяет форму клетки, а также местоположение клеточных органелл и их перемещение при митозе. С подвижностью внутриклеточных мембранных везикул связаны такие процессы, как эндоцитоз, экзоцитоз и фагоцитоз, а также перемещения плазматической мембраны при амебоидном движении клеток. Все эти процессы осуществляются с участием цитоскелета. По сути цитоскелет является динамическим каркасом клетки, который реагирует как на внутренние, так и на внешние стимулы. Часть этой системы тесно связана с плазматической мембраной. В настоящее время лучше всего охарактеризован мембранный скелет эритроцитов млекопитающих. Менее детально изучены биохимические свойства цитоскелета микроворсинок щеточной каемки кишечного эпителия. Обычно ци-тоскелет представляет собой трехмерную сеть волокон, охватывающую всю клетку. В некоторых точках он прикреплен к плазматической мембране, и эти области, как известно, участвуют в межклеточных контактах или в фокальных контактах, с помощью которых клетки прикрепляются к субстрату в клеточных культурах.

Предполагается, что именно благодаря взаимодействиям цитоскелета с мембраной возникает трансмембранное распределение ли-пидов, стабилизируются латериальные белковые домены и обеспечивается направленное перемещение белков в мембране.

Цитоскелетную сеть образуют три типа волокон: 1) микрофила-менты, состоящие из актина и связанных с ним белков; 2) промежуточные филаменты, состоящие из кератинов и родственных им белков; 3) микротрубочки, состоящие из тубулина. В биохимическом отношении лучше всего изучено связывание с мембраной актиновых мик-рофиламентов. Особого рассмотрения здесь заслуживает актин-спектриновая сеть эритроцитов. Эти белки способствуют объединению актиновых волокон в пучки, прикрепляют филаменты к мембране, образуют сшивки в актине, регулируют длину филаментов, влияют на их сократительную способность и обеспечивают отклик на Са^{2 +}. В ряде случаев актин участвует в сократительной активности. Микрофиламенты разрушаются цитоха-лазинами.

Микрофиламенты могут располагаться параллельно цитоплазматической мембране, как в сократимом кольце в делящейся клетке, или могут быть связаны с плазматической мембраной одним своим коццом, как в местах адгезии в области контакта клетка—клетка или клетка—субстрат. Полагают, что связывание актина с мембранами обеспечивается несколькими мембранными белками. Из данных о физической близости микро-филаментов к мембране, о биохимических взаимосвязях микрофила-ментов и разрушающем воздействии цитохалазина следует, что микрофиламенты участвуют во многих мембранных процессах, в частности в опосредуемом рецепторами эндоцитозе, пэтчинге и кэппинге, клеточной подвижности и цитокинезе. С биохимической точки зрения лучше всего охарактеризованы взаимодействия актина с мембраной у эритроцитов.

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ФИЛАМЕНТЫ

Это полимеры, состоящие из одного или двух фибриллярных полипептидов, которые различаются в клетках разного типа и кодируются семейством мультигенов. Примером являются кератины из эпителиальных клеток и виментин из клеток мезенхимы.

Функции промежуточных филаментов неизвестны. Мало что можно сказать и о биохимической основе их взаимодействия с мембранами.

МИКРОТРУБОЧКИ

Они состоят из тубулина, который хорошо охарактеризован и представляет собой а/?-гетеродимерный белок. Микротрубочки образуют цитоплазматическую сеть, которая, как полагают, связывает плазматическую мембрану с органеллами, например с митохондриями. Вдоль микротрубочек, по-видимому, происходит перемещение эндосом и лизосом. Есть доказательства, что тубулин прикрепляется к мембранам в особых точках. Выделен мембранный белок синапсин I, который, по-видимому, взаимодействует с тубулином. В ходе митоза цитоплазматическая сеть микротрубочек распадается и перестраивается в митотическое веретено. Микротрубочки разрушаются под действием колхицина.

МЕМБРАНА И ЦИТОСКЕЛЕТ ЭРИТРОЦИТОВ

Наиболее детально изучены мембрана и цитоскелет эритроцитов млекопитающих. В табл. 4.2 перечислены основные белки, которые были разделены с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза. Цифровые обозначения полипептидов связаны с их относительной электрофоретической подвижностью в геле. При промывании мембраны растворами с низкой ионной силой удаляются периферические мембранные белки, к которым прежде всего относятся компоненты цитоскелета. Основными интегральными белками цитоскелета являются белок полосы 3 и гликофорины А, В и С. Белок полосы 3 представляет собой анионный переносчик, а функции гли-кофоринов, относящихся к классу гликопротеинов, неизвестны. В электронном микроскопе цитоскелет выглядит как упорядоченная сеть на внутренней стороне мембраны. Как видно из табл. 4.2, белки цитоскелета являются основными мембранными компонентами, и это облегчает их биохимическую характеристику. По сути белковый каркас состоит из спектрин-актинового комплекса, который связан с плазматической мембраной благодаря взаимодействиям как с белком полосы 3, так и с гликофорином; эти взаимодействия осуществляются с помощью специальных белков — ан-

Таблица 2. Свойства, степень ассоциации и функции эритроцитарных мембранных белков

кирина и белка полосы 4.1. Основные компоненты были очищены до гомогенного состояния и изучены in vitro. Комплексы между основными белками, такими, как белок полосы 3 и анкирин или анкирин и спектрин, характеризуются константами диссоциации порядка Ю^-7 М, которые могут меняться в физиологических условиях. Фосфорилирование анкирина влияет на его аффинность по отношению к спектрину, а взаимодействие между белком полосы 4.1 и гликофорином, по-видимому, модулируется фосфатидилинози-толами.

Интересно, что белки, близкородственные компонентам цитоскелета эритроцитов, обнаружены в ряде неэритроидных клеток. Большой интерес к цитоскелету эритроцитов, по всей вероятности, обусловлен тем, что данная система не является уникальной лишь для этих клеток, а представлена в виде кортикального цитоскелета и в клетках другого типа. Рассмотрим свойства некоторых цитоскелет-иых белков.

1. Спектрин. Это тетрамер типа г, в котором два гетероди-мера a/J объединены по схеме «конец-к-концу». Молекула может достигать в длину 2000 А. Спектрин связан с анкирииом и белком полосы 3 по сайтам, расположенным на противоположных концах молекулы. Кроме того, спектрин связан с актином, возможно, в комплексе с белком полосы 4.1. Спектринопо-

добные молекулы, например фодрин, обнаружены в клетках разного типа.

2. Актин. Это глобулярный белок, который существует в виде линейных олигомеров, содержащих по 12—18 молекул. Они выглядят на электронных микрофотографиях как короткие стержни, к которым может быть прикреплено до шести спектриновых тетрамеров.

3. Анкирин. Это наиболее охарактеризованный растворимый белок, обеспечивающий взаимодействия между интегральными мембранными белками и цитоскелетом. Он имеет отдельные домены, ответственные за независимое связывание со спектрином и с цитоп-лазматическим доменом белка полосы 3. Анкирин был обнаружен и в неэритроидных клетках.

4. Белок полосы 4.1. Он также относится к классу белков, обеспечивающих связь цитоскелета с мембраной. Белок полосы 4.1 связывается со спектрином и актином, а также с гликофорином. Кроме того, при определенных условиях он может связываться и с белком полосы 3. Белку полосы 4.1, по-видимому, родствен синапсин I, обнаруженный в мембране синаптических везикул.

5. Белок полосы 3. Это основной анионный переносчик в эритроцитах. Цитоплазматический домен содержит на N-конце кислый участок, который связывается с некоторыми гликоли-тическими ферментами, а также с гемоглобином. Цитоплазматический домен не участвует в транспорте анионов. Его сегмент, расположенный вблизи мембраны, связывается с анкири-ном и с белком полосы 4.2. На основании анализа аминокислотной последовательности было высказано предположение, что белок полосы 3 имеет 12 трансмембранных сегментов, но полученные к настоящему времени экспериментальные данные не позволяют ни подтвердить, ни опровергнуть это положение.

6. Гликофорин А. Это основной сиалосодержащий гликопротеин; В отличие от белка полосы 3 он имеет относительно небольшой цитоплазматический домен и один трансмембранный сегмент. Полагают, что этот белок связывается с белком полосы 4.1. Другие его функции неизвестны.

Трансмембранная асимметрия липидов

Мембранные белки, находясь в плоскости бислоя, не меняют Свою топологическую ориентацию. Они встраиваются в мембрану в jCTporo определенной ориентации и остаются в таком положении в течение всего времени их жизни. Липиды ш ряде биологических мембран, напротив, с довольно большой частотой мигрируют с одной стороны мембраны на другую. Определить скорость трансмембранной миграции липидов очень важно по двум причинам: это помогает понять Природу липидной асимметрии и позволяет критически оценить пригодность методов, используемых для нахождения распределения липидов между двумя сторонами бислоя. Чтобы измерения содержа-1кия, например, фосфатидилсерина на наружной стороне мембранных везикул были достоверными, они должны быть завершены до того, как фосфатидилсерин из внутреннего монослоя переместится в наружный. Некоторые методы установления липидной асимметрии модифицируют саму изучаемую систему и индуцируют трансмембранную миграцию липидных молекул, поэтому полученные результаты бывает трудно интерпретировать. Детальная оценка достоинств и недостатков методов изучения липидной асимметрии в мембранах дается, например, в обзорах.

МЕТОДЫ УСТАНОВЛЕНИЯ ТРАНСМЕМБРАННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ

Химическая модификация фосфолипидов

Относительно легко подвергаются химической модификации только аминофосфолипиды, например фосфатидилсерин и фосфати-дилэтаноламин. При этом мембранный препарат с известной топологической ориентацией обрабатывают реагентом, который не проникает через бислой и ковалентно связывается со свободными аминогруппами тех аминофосфолипидов, которые находятся только на наружной поверхности мембраны. Чаще всего с этой целью используют ТНБС. Доля фосфатидилэтаноламина, вступившего в реакцию, должна служить мерой его содержания на наружной стороне мембраны. Очевидно, однако, что такой вывод неправомочен, если реакция не доходит до конца или если в ходе реакции значительное количество фосфатидилэтаноламина перемещается с внутренней стороны мембраны на наружную и становится доступным для реагента. Как правило, в реальной ситуации имеют место оба обстоятельства, что значительно осложняет интерпретацию результатов.

Предложен вариант этого подхода, предусматривающий синтез аналогов фосфолипидов с реакционноспособными сульфгидрильны-ми группами с последующим использованием непроникающих реагентов, избирательно реагирующих по SH-группам. Естественно, что эти липидные аналоги следует включать в изучаемые мембраны перед обработкой реагентами, и желательно предварительно исследовать их поведение в модельных системах.

Фосфолипидный обмен

Спонтанный обмен фосфолипидами между мембранами, как правило, протекает с пренебрежимо малой скоростью. Однако были выделены белки, называемые липидпереносящими белками, которые катализируют обмен. Эти белки чаще всего выделяют из тканей млекопитающих. Наиболее изучен белок из печени крысы, который обладает абсолютной специфичностью по отношению к фосфатидилхолину и катализирует его обмен между мембранами. Большинство других липидперенося-щих белков менее специфичны к полярным головкам липидных молекул. Это растворимые белки, которые имеют высокоаффинные места связывания фосфолипидных молекул. Механизм обмена неизвестен, однако ЛПБ можно использовать для изучения липидной асимметрии, поскольку они связывают липиды только наружной поверхности бислоя, с которыми они контактируют. Обычно мембранные везикулы инкубируют с избытком липосом, содержащих радиоактивно меченный фосфолипид, в присутствии липидперенося-щего белка. Фосфолипидный обмен со стехиометрией 1:1, который катализируется указанными белками, не приводит к изменению состава мембран, при этом степень обмениваемости фосфолипидов можно определить, измерив удельную радиоактивность мембраны. Если фосфолипид в мембране полностью доступен для обмена, то его удельная радиоактивность в липосомах и мембранах в конце эксперимента будет одинаковой. Если же изучаемый липид на внутренней стороне мембраны недоступен для обмена, то его удельная радиоактивность в мембране будет ниже, чем в липосомах. Если трансмембранная миграция протекает медленнее, чем устанавливается равновесие при обмене, то удельная радиоактивность будет возрастать во времени, и это возрастание будет отражать скорость флип-флопа. При проведении этих экспериментов необходимо отделять липосомы от изучаемых мембран; для этого обычно используют центрифугирование.

Достоинство этой методики состоит в том, что ЛПБ не проникают через мембрану, недостаток же связан с тем, что равновесие устанавливается медленно, за несколько часов или даже больше. Поэтому данная методика неприменима, когда происходит быстрая трансмембранная миграция, но ее можно использовать в сочетании с другими методами. Например, можно провести обмен радиоактивных липидов, находящихся на наружной поверхности бислоя, а затем использовать фосфолипазы для оценки скорости, с которой эти липи-ды мигрируют с наружной стороны мембраны на внутреннюю.

Фосфолипазы

Фосфолипазы — это ферменты, гидролизующие фосфолипиды по связям, указанным на рис. 4.3. Фосфолипазы представляют собой

растворимые белки, которые взаимодействуют только с наружной поверхностью бислоя и поэтому являются ценным инструментом для изучения асимметрии фосфолипидов и скорости их трансмембранной миграции. При работе с фосфолипазами следует иметь в виду два момента: 1) не все фосфолипиды на наружной стороне мембраны легко вступают в реакцию; 2) продукты реакции обычно дестабилизируют бислой. Даже если при действии фосфолипаз целостность бислоя не нарушается, скорость трансмембранной миграции фосфолипидов может существенно возрасти. Поэтому ход реакции необходимо тщательно контролировать, а выводы, сделанные на основании полученных результатов, — критически анализировать.

Другие методы

Для установления трансмембранного распределения липидов были предложены и другие специальные методы. Рассмотрим некоторые из них.

1. Распределение кардиолипина можно определить по специфичному связыванию с ним адриамицина.

2. Распределение гликолипидов можно определить, окисляя их либо галактозооксидазой, либо периодатом натрия с последующим восстановлением ³Н-боргидридом натрия.

3. Распределение стеролов можно определить несколькими методами. Стеролы могут самопроизвольно обмениваться между мембранами даже без участия особых белков. Поэтому их присутствие в наружном монослое мембраны можно определить по переносу в липосомы или из липосом. Распределение холестерола между двумя сторонами мембраны устанавливали, изучая кинетику образования комплекса между ним и филипином. Наконец, для определения содержания холестерола в наружном монослое мембраны использовали холестеролоксидазу, однако возникающие при этом артефакты ставят возможность применения этого фермента под сомнение.

ПРИМЕРЫ ЛИПИДНОЙ АСИММЕТРИИ

Из-за экспериментальных трудностей, связанных с определением липидной асимметрии, можно привести лишь несколько примеров, в которых асимметрия несомненно доказана. Прежде всего следует упомянуть эритроциты человека, которые в этом отношении были, детально изучены, причем все использованные методы дали хорошо согласующиеся между собой результаты. Другой пример такого рода — это высокая степень асимметрии наружной мембраны грамот-рицательных бактерий; впрочем, эта мембрана необычна в том отношении, что ее основным компонентом является уникальный липо-полисахарид. Нет никаких сомнений, что асимметричное распределение липидов свойственно и другим биологическим мембранам, однако убедительные данные получены лишь в немногих случаях.

Липидная асимметрия в фосфолипидиых везикулах

Для малых моноламеллярных везикул, состоящих из двух разных липидов, характерно асимметричное распределение липидов. Например, в везикулах, состоящих из смеси фосфатидилхолина с другими липидами, наружный монослой обогащен сфингомиелином или фосфатидилглицеролом, а фосфати-дилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол и фосфа-тидная кислота предпочитают находиться на внутренней поверхности. Общепризнано, что в этих случаях липидная асимметрия возникает прежде всего из-за различий в упаковке молекул на двух сторонах бислоя ММВ. Липиды с более объемными полярными головками стремятся находиться в наружном монослое, потому что там больше площадь поверхности, приходящейся на молекулу. Однако биологические мембраны, за отдельными исключениями, не имеют участков со столь большой кривизной, так что эти выводы нельзя безоговорочно распространить на любые биологические мембраны. С помощью трансмембранного градиента рН липидную асимметрию можно индуцировать и в больших моноламеллярных везикулах.

Липидная асимметрия в эритроцитах человека

Четко показано, что распределение липидов в мембране эритроцитов в высшей степени асимметрично. Как видно из рис. 4.4, фосфа-тидилхолин и сфингомиелин находятся преимущественно в наружном монослое, тогда как фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсе-рин — в основном во внутреннем.

Имеются убедительные данные о том, что для сохранения липидной асимметрии необходима целостность цитоскелета. Она нарушена в клетках, дефицитных по спектрину или белку полосы 4.1. Воздействия, нарушающие цитоскелет, изменяют и липидную асимметрию, хотя неясно, являются ли эти эффекты прямым следствием повреждения цитоскелета. Кроме того, в малых везикулах, полученных из мембраны эритроцитов, распределение липидов менее асимметрично. Эти данные показывают, что цитоскелет играет определенную роль в поддержании липидной асимметрии. Механизм такого влияния неясен, однако можно предположить, что имеет место прямое связывание цитоске-летных белков с аминофосфолипидами.

Прямая стабилизация асимметрии, если она существует, — это только одна сторона вопроса. Так, экзогенные фосфолипиды, включенные в мембрану эритроцитов с помощью обменивающих белков, примерно через сутки перераспределяются, и их асимметрия принимает такой же характер, как и у эндогенных липидов. На рис. 4.5 приведена схема этих экспериментов. Измеряя кинетику гидролиза под действием фосфолипаз, можно определить скорость флип-флопа липидных молекул. Эта скорость возрастает в ряду фосфатидилсерин > фосфатидилэтаноламин > фосфатидил-холин > сфиигомиелии. Подобные результаты были получены с помощью спин-мечеиных липидов и лизофосфолипидов. Таким образом, те липиды, которые локализуются на внутренней стороне мембраны, имеют и относительно большую скорость транс-мембраииой миграции. Те же липиды, которые находятся на наружной стороне, мигрируют значительно медленнее либо вообще не совершают флип-флоп-перескоков.

Очень важным является вывод о том, что быстрая трансмембранная миграция аминофосфолипидов, по-видимому, является АТР-зависимой и значительно замедляется в клетках, дефицитных по АТР. Это послужило основанием для предположения о том, что специфичный флип-флоп липидов катализируется особыми ферментами типа транслоказ. В пользу этого предположения появляется все больше данных, правда, многие из них являются косвенными.

Есть два взгляда на то, как поддерживается липидная асимметрия в мембранах; они взаимно дополняют друг друга и могут быть в равной степени важны. Один из них дает статическую картину с акцентом на стабилизацию асимметрии за счет специфических взаимодействий фосфолипидов с цитоскелетными белками, а другой представляет асимметрию как динамический феномен, когда энергозависимые транслоказы избирательно переносят липиды через бислой, поддерживая их стационарное асимметричное трансмембранное распределение.

Липидная асимметрия наружной мембраны бактериальных клеток

Наружная мембрана грамотрицательных бактерий в отличие от мембраны эритроцитов не может служить моделью других бактериальных мембран. Это связано с тем, что содержащийся в ней липо-полисахарид является в своем роде уникальным мембранным компонентом. Детальные исследования показали, что эта мембрана представляет собой высокоасимметричную структуру. Указанный липополисахарид был обнаружен только на наружной стороне бислоя, а большая часть фосфолипидов локализована во внутреннем монослое, обращенном в периплазму. Липополисахарид играет важную роль как барьер для проникновения внутрь клетки некоторых веществ; в частности, именно благодаря ему бактерии приобретают устойчивость к ряду антибиотиков. Одним из основных компонентов наружной мембраны явлется так называемый липопротеин Брауна, который закреплен в мембране с помощью ковалентно связанных с ним липидов, а кроме того, связан с пептидогликановой стенкой за счет ковалентных и нековалентных взаимодействий.

ТРАНСМЕМБРАННАЯ МИГРАЦИЯ ЛИПИДОВ

Биосинтез фосфолипидов и сборка мембраны протекают асимметрично. Активные центры ферментов биосинтеза фосфолипидов локализованы на одной, а не на двух сторонах мембраны. Например, фосфолипиды синтезируются и внедряются в мембрану на цитоплазматической стороне эндоплазматического ре-тикулума печени крысы и на внутренней стороне бактериальной цитоплазматической мембраны. Ясно, что эти липиды должны пересечь мембрану, чтобы достичь противоположной стороны бислоя.

Скорость трансмембранной миграции фосфолипидов в фосфоли-пидных везикулах пренебрежимо мала: ее характерное время составляет несколько суток. Флип-флоп-переход может ускоряться в присутствии таких интегральных мембранных белков, как гликофорин, или при возмущениях в бислое, происходящих, например, при обработке фосфолипазами. Как и следует ожидать, перемещение липидных молекул затрудняют именно полярные головки, поскольку производные диацилглицерола очень быстро мигрируют через бислой. Для некоторых биологических мембран, например мембраны вируса гриппа и внутренней мембраны митохондрий, также характерна очень малая скорость трансмембранной миграции фосфолипидов.

Однако имеются мембраны, в которых миграция липидов протекает очень быстро, с порядка нескольких минут. Такие данные получены для эндоплазматического ретикулума печени крысы, а также для цитоплазматической мембраны грамположитель-ных бактерий В. megaterium. В этих мембранах происходит синтез липидов, и в них, по-видимому, присутствуют специальные транслоказы, которые обеспечивают быструю трансмембранную миграцию липидных молекул. Такое предположение было высказано в отношении эндоплазматического ретикулума, но оно пока не нашло экспериментального подтверждения. Характерное время трансмембранной миграции липидов в мембране эритроцитов имеет промежуточное значение и составляет величины порядка нескольких часов в зависимости от структуры изучаемого липида. Такие же результаты были получены при измерении скорости флип-флопа спин-меченных аналогов фосфолипидов и экзогенных лизо-фосфолипидов. Было установлено, что скорость миграции возрастает при нарушениях цитоскелета, а также под действием агентов, влияющих на структуру липидиого бислоя. Возможно, цитоскелет играет определенную роль в уменьшении скорости миграции липидов через бислой благодаря связыванию аминофосфолипидов. Характерно, что ни эндоплазматический ретикулум, ни бактериальная ци-топлазматическая мембрана, для которых характерна высокая скорость флип-флопа липидов, не связаны с цитоскелетом.

Тот факт, что скорость трансмембранной миграции липидов в эритроцитах является АТР-зависимой, предполагает присутствие в этой мембране энергозависимой транслоказы. АТР-зависимая трансмембранная миграция аминофосфолипидов наблюдается также в плазматической мембране фибробластов и лимфоцитов. Однако ни одна из фосфолипидных транслоказ до сих пор не выделена, поэтому возможность существования таких ферментов и их потенциальная роль в поддержании липидной асимметрии или в биогенезе мембран представляются вероятными, но не более того.

Латеральная гетерогенность мембран

Исходная жидкостно-мозаичная модель предполагает, что распределение белковых и липидных компонентов в плоскости бислоя является гомогенным. Однако не вызывает сомнений, что в ряде мембран существуют домены или области, отличающиеся по составу от остальной части мембраны вследствие ограничений в диффузионном обмене их компонентов. Имеются различные виды мембранных доменов, о которых можно говорить в рамках жидкост-но-мозаичной модели, вводя определенные ограничения, налагаемые дополнительными стабилизирующими эти домены взаимодействиями.

1. Макроскопические домены, как правило, представляют собой обширные участки на поверхности клетки с характерной морфологией и четкими границами. Примерами являются апикальная и базолатеральиая области поляризованных эпителиальных клеток. В тилакоидах соприкасающиеся и несоприкасающиеся участки фото-синтезируюших мембран тоже имеют разный состав и, по-видимому, стабилизируются межмембранными взаимодействиями в стопках.

2. Агрегация белков в плоскости мембраны может приводить к образованию довольно больших островков, или доменов, которые обогащены определенным белком и находятся в смеси с какими-либо другими компонентами. Примерами являются пурпурные мембраны Н. halobium, содержащие бактериородопсин, или щелевые контакты, содержащие коннексин.

3. Домены, формируемые при участии цитоскелета, в принципе могут образоваться путем ассоциации определенных мембранных белков за счет их взаимодействия с внутриклеточными белками. В основе такой латеральной организации мембранных белков могли бы лежать особенности взаимодействий, наблюдаемых в случае цитоскелета эритроцитов. Пока четкие примеры существования таких доменов отсутствуют, однако можно предположить, что пэтчинг и кэппинг антигенов на клеточной поверхности осуществляются именно с участием цитоскелета и что концентрирование специфичных рецепторов в окаймленных ямках плазматической мембраны перед эн-доцитозом осуществляется благодаря их взаимодействию с компонентами цитоскелета или с клатрином.

4. Липидные микродомены могут быть термодинамически стабильны как в биологических мембранах, так и в модельных липид-ных системах. Об этом свидетельствуют многочисленные косвенные данные, хотя четкие доказательства существования таких доменов пока отсутствуют.

Приведенная классификация доменов условна; указанные четыре категории отнюдь не исключают друг друга при рассмотрении способов стабилизации латеральной гетерогенности мембран.

МАКРОСКОПИЧЕСКИЕ ДОМЕНЫ И БАРЬЕРЫ В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ

Плазматическая мембрана клеток часто бывает разделена на отдельные домены, которые можно даже выделить и охарактеризо-

вать. Как правило, эти домены разделены барьерами, которые препятствуют переходу белков и, возможно, липидов из одного домена в другой. В пределах же областей, ограниченных этими барьерами, белки и липиды диффундируют свободно. На рис. 4.7 приведено несколько примеров таких доменов.

1. Апикальная и базолатеральная области мембраны поляризованных эпителиальных клеток имеют разный состав. Показано, например, что ганглиозиды не пересекают границу между этими областями, которая в данном случае представляет собой область плотных контактов между клетками.

2. Плазматическая мембрана спермиев состоит из четко разграниченных участков разного состава, которые можно разделить. Граница между доменами препятствует свободной диффузии мембранных белков.

3. Соединительный отросток на палочке сетчатки разделяет ее наружный и внутренний сегменты. Родопсин исходно включается в мембрану внутреннего сегмента, а затем концентрируется в мембране наружного сегмента. Вероятно, в мембране палочки существует диффузионный барьер, поддерживающий эту разность концентраций.

4. Натриевые и калиевые каналы локализованы в разных областях мембраны миелинизированного аксона. Возможно, такая организация стабилизируется благодаря контактированию мембраны с глиальиыми или шванновскими клетками, которые образуют миелиновую оболочку вокруг нервного волокна.

Следует отметить, что макроскопическая латеральная гетерогенность может быть характерна и для мембран прокариотических клеток. Например, в мембранах грамотрицательных бактерий имеются области адгезии, в которых, по-видимому, осуществляется контакт между наружной и внутренней мембранами. У пурпурных несерных фотосинтезирующих бактерий фотосинтетический аппарат локализован в специализированных мембранах, образующихся в результате инвагинаций цитоплазматической мембраны.

Экспериментальные исследования в этой области затруднены, поэтому о природе барьеров, разделяющих различные мембранные домены, известно очень мало.

ТИЛАКОИДНЫЕ МЕМБРАНЫ

Мембраны тилакоидов в хлоропластах высших растений содержат фотосинтетический аппарат. Эти мембраны собраны в стопки, называемые гранами. Соприкасающиеся и несоприкасаю-

щиеся участки мембраны тилакоидов имеют разную морфологию, и их можно разделить. Известно также, что эти две области мембраны имеют разный состав, вероятно стабилизируемый благодаря взаимодействиям между мембранами. Одним из факторов стабилизации мембран в стопках является прямое связывание светособирающих комплексов друг с другом в соприкасающихся мембранах. Важную роль в стабилизации стопок могут играть и электростатические взаимодействия. Детали этих взаимодействий во многом неясны, однако очевидно, что они каким-то образом приводят к функционально значимому латеральному разделению компонентов. Например, две фотосистемы, I и II, которые являются компонентами электронтранс-портной цепи, расположены в разных мембранных доменах, но связаны биохимически с помощью диффундирующего пластохинона. Распределение светособирающего комплекса между этими двумя доменами зависит от степени его фосфорилирования.

ВИРУСЫ С ОБОЛОЧКОЙ

Вирусы с оболочкой имеют нуклеокапсид, окруженный липидным бислоем. Последний происходит от мембраны клетки-хозяина и образуется при почковании вируса. Вирус саркомы Рауса и вирус везикулярного стоматита отпочковываются от плазматической мембраны клетки-хозяина в среду, а другие вирусы высвобождаются во внутренние компартменты клетки, например в аппарат Гольджи или эндоплазматический ретикулум. Эти вирусы очень полезны как модели для изучения мембранного биогенеза и внутриклеточного мембранного транспорта. Кроме того, они представляют интерес и с точки зрения изучения образования доменов в мембранах. Как показано на рис. 4.9, процесс отпочковывания включает взаимодействие мембраны с нуклеокапсидом и трансмембранными белками шиловидных выростов вируса. Гликопротеины этих выростов внедряются в плазматическую мембрану клетки-хозяина и с помощью своих цитоплазматических доменов взаимодействуют с белками вирусного матрикса, которые связаны с вирусным нуклеокапсидом. В процессе отпочковывания концентрация белков шиловидных вирусов в растущей почке увеличивается, а белки плазматической мембраны клетки-хозяина полностью из нее исключаются. Сформировавшаяся вирусная оболочка содержит только белки шиловидных выростов и совсем не содержит белков клетки-хозяина. Предполагается, что именно взаимодействие между матриксными белками и белками выростов обусловливает латеральное разделение компонентов, происходящее в плазматической мембране. Интересно, что ли-пидный состав вирусной оболочки не совпадает с составом плазматической мембраны клетки-хозяина. Проще всего объяснить

это предпочтительными взаимодействиями между гликопротеинами шиловидных выростов и определенными липидными компонентами. Эта модельная система окажется полезной и для дальнейших исследований латеральной гетерогенности в мембранах.

ЛИПИДНЫЕ МИКРОДОМЕНЫ

При подходящих условиях липиды подвергаются латеральному фазовому разделению с образованием стабильных ламеллярных доменов. Такое разделение можно индуцировать изменением температуры, давления или ионной силы либо добавлением двухвалентных катионов или белков. Вопрос о том, существуют ли микродомены, подобные наблюдаемым в модельных липидных системах, также и в биологических мембранах, всегда вызывал большой интерес У исследователей. Полученные результаты не являются абсолютно убедительными, поскольку липидные домены не удается выделить и охарактеризовать, как в случае латеральной гетерогенности, рассмотренной выше. Конечно, лучше всего было бы провести фрагментацию мембраны и проиллюстрировать различия в распределении компонентов в выделенных мембранных фракциях. Для обнаружения латеральной гетерогенности биологических мембран часто используют электронную микроскопию. О такой гетерогенности можно судить также по данным биофизических методов, если полученный от образца сигнал свидетельствует о наличии различных мембранных популяций, а не одной гомогенной популяции. В качестве примера можно привести измерения коэффициента диффузии флуоресцентных аналогов липидов в протопластах сои. О микрогетерогенности мембран иногда можно судить по поведению ферментов, если ферментативная активность не отвечает усредненному физическому состоянию липидной фазы по всей массе мембраны. Часто эти методы свидетельствуют о наличии в мембране областей с разной текучестью липидов, что указывает на сосуществование фазы геля и жидкокристаллической фазы. Такие выводы были сделаны в ряде исследований, где различные возмущения, вызываемые присутствием цис- и транс-ненасыщенных жирных кислот, объяснялись их разным распределением между доменами, находящимися в жидкокристаллическом состоянии и в фазе геля.

Все эти исследования согласуются с предположением о наличии в биологических мембранах микродоменов, но в большинстве случаев такое объяснение не является единственно возможным или несомненным. Тем не менее идея о существовании липидных микродоменов весьма привлекательна. Ведь благодаря им ферменты в одной и той же мембране могут находиться в разном окружении, и их активность может регулироваться за счет специфичных взаимодействий с липидами или другими белками. Кроме того, на границах между доменами могут проявляться «дефекты» упаковки липидного бислоя. Как полагают, такие границы с резким изменением упаковки липидов в ряде случаев оказывают решающее влияние на функции бислоя. Исследования модельных липидных систем показали, что при фазовом переходе, когда сосуществуют фаза геля и жидкокристаллическая фаза, пассивный транспорт как гидрофобных, так и гидрофильных веществ ускоряется в несколько раз по сравнению с жидкой фазой. По-видимому, в областях бислоя с дефектами упаковки, где сжимаемость липидов высока, могут образовываться поры. Благодаря наличию дефектов в пограничных областях бислоя может ускоряться флип-флоп фосфолипидов, возрастать их доступность для фосфолипаз, а также усиливаться тенденция липидных везикул к слиянию.

Идея липидных микродоменов в мембранах весьма привлекательна, поскольку она позволяет легко объяснить многие факты, но она все еще нуждается в подтверждении.

Резюме

Множество фактов свидетельствует о гетерогенности биологических мембран как в продольном, так и в поперечном направлениях. Трансмембранная асимметрия означает, что разные половины бислоя имеют разный состав. Установлено, что интегральные мембранные белки встроены в мембрану асимметрично и эта асимметрия стабильна. Таким образом, к цитоплазматической и наружной поверхностям мембраны обращены разные белковые домены. Получено множество данных о том, что совершенно разным может быть и фосфолипидный состав двух половин бислоя. Как создается эта липидная асимметрия и за счет чего она поддерживается — пока неясно, хотя имеются данные о существовании АТР-зависимых транслоказ, которые ускоряют перенос липидов через бислой. Другими факторами, определяющими асимметрию мембран животных клеток, являются взаимодействия липидов с цитоскелетом и с внеклеточным матриксом иа ее поверхности.

Имеются данные и о латеральной гетерогенности биологических мембран. Это могут быть достаточно обширные специализированные участки мембраны, например апикальная или базолатеральная области плазматической мембраны поляризованных эпителиальных клеток. Примером того, как в пределах одной мембраны соседствуют области с разным составом и функциями, могут служить менее протяженные соприкасающиеся и несоприкасающиеся участки тила-коидной мембраны. Все это показывает, что молекулярная организация мембран гораздо сложнее, чем это следует из жидкостно-мозаич-ной модели, первоначально предложенной Сингером и Николсоном.