Національний Університет

“Києво-Могилянська Академія”

Модель мікрокомпартмента-метаболона.

Асоціати ферментів гліколізу, циклу трикарбонових кислот.

Реферат з курсу

“Регуляція метаболізму клітини”

студентки 1-го року навчання

МП “Біологія” НаУКМА

Ткаченко Н.І.

Київ – 2000

План.

1. Поняття про метаболон.

2. Загальна принципи організації метаболонів.

3. Моделі метаболонів.

3.1.Асоціати ферментів ЦТК.

3.2.Асоціати ферментів гліколізу.

4. Функціонування метаболонів та його контроль.

Література

1. Поняття про метаболон.

Метаболон – це мобільна структура, в якій об’єднані мультиферментний комплекс і елементи біомембрани (чи іншої клітинної структури, наприклад, цитоскелету). Головна особливість метаболону полягає у тому, що це структура, яка об’єднує всі ферменти певної метаболічної системи і, відповідно, яка виконує певну метаболітичну функцію.

Термін “метаболон” запропонований Шрером в 1985р. Метаболон був визначений як “надмолекулярний комплекс ферментів, які каталізують послідовні стадії метаболітичного шляху (sequential metabolic enzymes) і структурних елементів клітини”. Накопичені дані, які свідчать на користь існування комплексів ферментів таких метаболічних шляхів, як шляхи синтезу ДНК, РНК, білку, глікогена, пуринів і пирімідинів, ліпідів, стероїдів, антибіотиків, шляхи метаболізму амінокислот, цикл мочевини, перенос електронів, окислення жирних кислот, деградація сАМР. Але найбільш досліджені комплекса ферментів гліколізу і комплекса ферментів цикла трикарбонових кислот.

Метаболони характерні для широкого спектру організмів – від прокаріотів до клітин вищих тварин, що свідчить про їх появу на ранніх етапах розвитку життя. Очевидно, метаболони виникли у ході предбіологічної еволюції.

Подібні комплекси не плавають вільно всередині вільно всередині клітини, а формуються на структурних елементах клітини (так званих “якірних білках”), утворюючи тим самим з цими елементами єдину систему.

Асоціація метаболонів з клітинними структурами створює передумови для структурної єдності метаболізму. Важливим є також те, що якірні білки, на яких формуються метаболони, стають центрами управління даної метаболічної системи.

2. Загальні принципи організації метаболонів.

Метаболон формується на біологічній підложці, роль якої можуть виконувати мембрани, структурні білки м’язів, елементи цитоскелета і, зокрема, нитки мікротрабекулярної сітки. Однією з важливих характеристик метаболона є його симетрія, яка повинна відповідати симетрії тої структури (підложки), на якій метаболон формується. Фосфоліпіди мають гексагональну упаковку у площині мембранм. Очевидно, така упаковка ліпідів визначає симетрію олігомерів інтегральних мембранозв’заних білків: останні мають вісь симетрії третього порядку, перпендикулярну площині мембрани. Можна припустити, що той же тип симетрії повинен бути характерний і для метаболонів, які формуються на інтегральних мембраннозв’язаних білках.

З іншого боку, модель переносу енергії в біоструктурах потребує дуплікації, тобто наявність вісі симетрії, які задовольняють обидві умови, є диедрична група симетрії D₃. Структури, симетрія яких належить до групи D₃, містять одну вісь симетрії третього порядку і три перпендикулярні до неї осі симетрії другого порядку і складаються з шести ідентичних субодиниць. Очевидно, симетрія типу D₃ переважає серед метаболонів.

Фермент, який утворює “ядро” метаболона і відіграє ключеву роль у формуванні комплекса, повинен відповідати вимогам:

А) молекула фермента повинна мати найбільші розміри серед ферментів метаболічної системи;

Б) фермент повинен бути здатним адсорбуватися на мембрані, зберігаючи при цьому каталітичну активність;

В) фермент повинен мати вісь симетрії третього порядку чи збиратися в тримери в адсорбованому стані;

Г) фермент повинен проявляти здатність до самоасоціації. Ця здатність означає наявність у фермента “липких” кінців, які в умовах in vivo можуть насичуватися шляхом взаємодії з якірним білком підложки і з іншими ферментами метаболічної системи;

Д) фермент повинен бути чутливим до дії вторинних посередників, оскільки він утворює разом з якірним білком підложки центр керування метаболону.

Для визначення взаємного розташування фермент в метаболоні запропоновані такі принципи:

• Ферменти, які каталізують реакції, що слідують одна за іншою в метаболічному шляху, повинні займати сусідні позиції в комплексі.

• Ферменти, що використовують і регенерують NAD, ATP, CoA та інші коферменти, повинні знаходитись у контакті один з одним. У ряді випадків є доцільним, щоб всі ферменти, які використовують один кофермент, були розташовані поруч.

• Ферменти, активність яких регулюється інтермедіатами даної метаболітичної системи, повинні розташовуватись у метаболоні таким чином, щоб забезпечити можливість реалізації цього регуляторного механізму.

3. Моделі метаболонів.

3.1. Комплекс ферментів цикла трикарбонових кислот.

При побудові структурної моделі метаболону цикла трикарбонових кислот в якості “ядра” був прийнятий -кетоглутаратдегідрогеназний комплекс. Серцевину цього комплексу складають 24 субодиниці транссукцинілази, що утворюють структуру куба з трьома вісями симетрії четвертого порядку, чотирма вісями третього порядку і шістьма вісями другого порядку (група симетрії О). До них приєднуються по шість димерів -кетоглутаратдегідрогенази і ліпоїламіддегідрогенази, що призводить до зниження симетрії. Аналогічну організацію має і -кетоглутаратдегідрогеназний комплекс з E.coli.

Точна структура -кетоглутаратдегідрогеназного комплекса залишається нез’ясованою. Досліди in vitro дозволяють припустити, що комплекс не має унікальної четвертинної структури, а представляє собою родину структурних ізомерів, загальна кількість яких може сягати 125 000. In vivo -кетоглутаратдегідрогеназний комплекс адсорбований на мембрані, і тому можна припустити існування в нативних умовах більш-менш визначеної структури комплекса. Для мітохондрій серця ссавців при дослідженнні типу фіксації -кетоглутаратдегідрогеназного комплекса на мембрані було показано, що розмір ребра куба, утвореного транссукцинілазою, складає 11,7 нм. Таким чином, довжина діагоналі куба (15-30 нм) відповідає середній відстані між внутрішніми поверхнями внутрішньої мембрани мітохондрій серця. Очевидно, транссукцинілаза розташовується так, що дві протилежні вершини куба дотикаються протилежних поверхонь мембрани; при цьому вісь симетрії третього порядку перпендикулярна цим поверхням. Шість молекул ліпоаміддегідрогенази розташовані на гранях куба і також торкаються однієї з поверхонь мембрани (це необхідно для обміну NAD і NADH з комплексом І ланцюга переносу електронів), а шість молекул -кетоглутаратдегідрогенази прикріплені до тих ребер куба, які не торкаються мембрани. Таким чином, -кетоглутаратдегідрогеназний комплекс має, окрім вісі третього порядку, ще три осі симетрії другого порядку (точкова група симетрії D₃). Навколо цієї структури і повинні розташовуватись інші ферменти, що входять в метаболон ЦТК (окрім ферментів ЦТК метаболон включає аспартатамінотрансферазу і нуклеозиддифосфаткіназу, які каталізують реакції, функціонально тісно пов’язані з ЦТК).

Виходячи з принципів, викладених раніше, була побудована структурна модель комплексу ферментів ЦТК. Принято, що симетрія комплекса ферментів ЦТК належить, як і симетрія -кетоглутаратдегідрогеназного комплекса, до точкової групи D₃. Кількість асиметричних молекул кожного типу відповідає порядку групи, який для групи D₃ дорівнює шести. Отже, комплекс повинен включати по шість молекул кожного фермента.

Структуру комплекса ферментів ЦТК можна уявити у вигляді гексамеру з шести ідентичних асиметричних субодиниць. Кожна асиметрична субодиниця містить тетрамер транссукцинілази, по одній молекулі всіх останніх ферментів та якірний білок.

Загальний вигляд комплекса ферментів ЦТК показаний на рисунку . Розміри ферментів на схемі відповідають їх молекулярній масі. Комплекс “затиснутий” між протилежними поверхнями внутрішньої мембрани, при цьому до мембрани торкаються всі ферменти, за виключенням -кетоглутаратдегідрогенази та аспартатамінотрансферази. В якості якірних білків, відповідних за зборку комплекса ферментів ЦТК на мембрані, виступають інтегральні білки внутрішньої мембрани мітохондрій, в тому числі сукцинатдегідрогеназа. Висота комплекса вздовж вісі третього порядку складає 20 нм, діаметр комплекса 50 нм. Молекулярна маса (без урахування сукцинатдегідрогенази) складає 8 МДа.

Отримані дані про те, що ферменти дикарбонової частини ЦТК разом з аспартатамінотрансферазою утворюють “швидкий кластер” ЦТК, який здатний функціонувати в обхід трикарбонової частини цикла. Структура метаболону, що описується, не протирічить цьому уявленню, оскільки ферменти “швидкого кластера” згруповані з нею разом, в той час як ферменти трикарбонової частини (цитратсинтаза, аконітаза та ізоцитратдегідрогеназа) знаходяться на периферії комплекса.

3.2. Асоціати ферментів гліколізу.

В еритроцитах комплекс ферментів гліколізу формується на внутрішній поверхні плазматичної мембрани. Роль якірного майданчика, що забезпечує фіксацію метаболона на мембрані еритроцитів, відіграє інтегральний мембрано-зв’язаний глікопротеїн з молекулярною масою 93 кДа, основною функцією якого є транспорт аніонів через мембрану еритроцитів – так званий білок смуги 3. Найбільш ймовірно, що в мембрані білок смуги 3 існує в гексамерній формі.

Очевидно, формування комплекса ферментів гліколізу на внутрішній поверхні мембрани еритроцитів починається з посадки найбільшого за розмірами фермента – 6-фосфофруктокінази. Білок смуги 3 здатний зв’язувати 6-фосфофруктокіназу, фруктозобісфосфат-альдолазу і гліцеральдегідфосфатдегідрогеназу. При цьому зв’язування фруктозобісфосфат-альдолази і гліцеральдегідфосфатдегідрогенази супроводжується повним зникненням каталітичної активності, а при зв’язуванні 6-фосфофруктокінази спостерігається зменшення чутливості фермента до інгібування високими концентраціями АТР і, як результат, збільшення каталітичної активності в області фізіологічних значень концентрації АТР. Ясно, що метаболони, формування яких починається з адсорбції фруктозобісфосфат-альдолази чи гліцеральдегідфосфатдегідрогенази, не можуть функціонувати потрібним чином. Логічно припустити, що першим етапом зборки повноцінного комплекса гліколітичних ферментів є адсорбція 6-фосфофруктокінази на олігомерах білка смуги 3.

Припускають, що стехіометрія зв’язування 6-фосфофруктокінази така: одна тетрамерна молекула фермента зв’язується димером білка смуги 3. Отже, гексамер білка смуги 3 повинен зв’язувати, таким чином, три молекули 6-фосфофруктокінази.

Відомо, що 6-фосфофруктокіназа еритроцитів здатна до самоасоціації, яка призводить до утворення асоціатів необмеженої кількості. Останні ферменти гліколізу схильності до самоасоціації не проявляють. Можна припустити, що центри асоціації в молекулі 6-фосфофруктокінази в фізіологічних умовах насичуються таким чином: один з центрів асоціації бере участь у посадці на димер білку смуги 3, а інший насичується фруктозобісфосфат-альдолазою, тобто ферментом, що каталізує стадію гліколіза, яка слідує за фосфофруктокіназною реакцією. Тример 6-фосфофруктокінази, фіксований на тримері димерів білку смуги 3, повинен приєднати три молекули фруктозобісфосфат-альдолази.

Молекула 6-фосфофруктокінази еритроцитів подібно м’язевому ферменту має тетрамерну структуру. Однак, на відміну від м’язевого фермента, побудованого з ідентичних субодиниць з молекулярною масою 85 кДа, фермент з еритроцитів містить одну субодиницю (М) м’язевого типу і три субодиниці (Е) з молекулярною масою 80кДа і з амінокислотним складом, що відрізняється від складу для субодиниць м’язевого типу. Тетрамер будови МЕ₃ не має, очевидно, осей симетрії, і кількість молекул МЕ₃, в метаболоні, що має вісь симетрії кратну n, буде дорівнювати величині n (в даному випадку n=3). Можливо, особливості субодиничної структури 6-фосфофруктокінази еритроцитів сприяють зборці в адсорбованому стані саме тримірної структури.

Гіпотетична структура комплексу гліколітичних ферментів, адсорбованого на внутрішній поверхні мембрани еритроцитів, показана на рисунку . Метаболон має вісь симетрії третього порядку, перпендикулярну до площини мембрани, і містить потрійний набір гліколітичних ферментів. Молекулярна маса комплекса складає 4,5 кДа. 6-фосфофруктокіназа на рисунку зображена еліпсоїдом обертання, розміри якого прийняті рівними розмірам м’язевої 6-фосфофруктокінази. Піруваткіназа також представлена еліпсоїдом обертання. Останні гліколітичні ферменти умовно зображені як сферичні частинки, розміри яких відповідають їх молекулярній масі.

Така структура є лише першим поверхом комплексу. Ферменти, що знаходяться на вершині зображеного комплексу (гліцерол-3-фосфатдегідрогеназа і тріозофосфатізомераза), є димерами, що побудовані з ідентичних субодиниць. Можна вважати, що комплекс здатний рости вздовж осі симетрії третього порядку. Ріст комплекса у площині, паралельній площині мембрани, буде блокуватися розташованою в центральній області комплекса мономерною фосфатгліцераткіназою. Симетрія двоповерхового комплексу буде відповідати точковій групі симетрії D3 аналогічно симетрії структури комплекса ферментів ЦТК. Двоповерховий комплекс містить шестикратний набір гліколітичних ферментів; мікрокомпартмент, що утворюється при зборці такого комплекса, складається з шести відсіків.

Фізіологічно виправданим є формування гліколітичного метаболону на м’язевих філаментах, оскільки таке розташування метаболону забезпечує поступання АТР, що продукується гліколітичною системою, на АТРазні активні центри, розташовані на головках молекули міозину. За підложку для формування комплексу ферментів гліколізу у м’язах служать молекули актину.

Тонкі і товсті нитки міофібрил, утворені переважно актином та міозином відповідно, виглядають у поперечному зрізі міофібрил упакованими в гексагональну решітку. Актинова нитка є подвійною спіраллю, утвореною глобулярними одиницями (молекулами G-актину), з періодом 36,5 нм. Міозинова нитка утворена дванадцятьма піднитками, упакованими вздовж основної осі нитки за гексагональним типом. Поперечний розріз нитки має вид трикутника з дев’ятю піднитями на поверхні і трьома в центрі. Розташування поперечних містків на поверхні міозинової нитки відповідає приблизно двозаходовій 6/1-спіралі.

Розташування комплексів гліколітичних ферментфів на м’язевих філаментах повинно бути, очевидно, таким, щоб воно не порушувало їх гексагональної упаковки. Це можливо лише в тому випадку, якщо комплекс формується таким чином, що він має вісь симетрії третього порядку, яка співпадає з осями актинової та міозинової ниток. Це підтверджується дослідами по вивченню адсорбційної ємності актину у відношенні гліколітичних ферментів, які показали, що кількість молекул фермента, які зв’язуються з мономерами актину, що укладаються в межах одного періоду спіралі, дорівнює трьом.

4. Функціонування метаболону та його контроль.

Зборка метаболону призводить до утворення мікрокомпартмента, в якому метаболічний процес може протікати ізольовано, без виділення інтермедіатів у об’єм. Внаслідок обмежених розмірів мікрокомпартмента в ньому одночасно може знаходитись лише відносно невелика кількість молекул інтермедіатів. Таким чином, здійснюється мікрокомпартменталізація метаболічних процесів.

Припускається, що мікрокомпартмент є достатньо вузьким каналом, стінками якого є поверхні контактуючих білкових молекул. Канал поділяється на відсіки, з’єднані більш вузькими алостеричними протоками, де локалізовані активні (а також алостеричні) центри ферментів. При цьому активні центри двох сусідніх ферментів мають бути зближені настільки, що стає можливим перенос інтермедіату від одного активного центру до іншого. Однак просторові обмеження не дозволяють розмістити поруч активні центри всіх ферментів, що входять до метаболону. Тому канал має бути подовжений , і загальному випадку для переходу від одного активного центру до іншого, інтермедіатам необхідно подолати певну відстань.

Калер і Фрідлянд запропонували модель організованої поліферментної системи, вхід в яку закритий до тих пір, поки всередині системи знаходиться молекула будь-якого проміжного або кінцевого продукта. Проте, здається малоймовірним, щоб в компартменті метаболону одночасно знаходились всього одна молекула метаболіта. В той же час можна припустити “конвеєрний” механізм роботи метаболону: в мікрокомпартменті одночасно знаходяться n молекул ( за кількістю субодиниць метаболону) кожного метаболіта, а всі реакції здійснюються синхронно на активних центрах відповідних ферментів.

Важливо відмітити, що мікрокомпартмент є динамічною структурою, оскільки ферменти, що його утворюють, у ході каталізу зазнають конформаційних переходів. Це не може не призводити до зміни конфігурації каналу.

Для функціонування метаболону необхідна симетрія його структури. Як і у випадку мультиферментного комплексу “симетрія керує динамікою комплекса”. Очевидно, вісь симетрії третього порядку повинна зберігатися в процесі функціонування метаболону.

Потрібно мати на увазі, що метаболон є мобільною структурою і знаходиться у рівновазі з вільними ферментами.

Об’єм матрикса зазнає значних змін при переході мітохондрій від конденсованої конформації до ортодоксальної. Цей процес, що контролюється енергетичним станом мітохондрій, повинен впливати на рівновагу між комплексом ферментів ЦТК і вільними ферментаими. Висока концентрація білка у матриксі в конденсованій конформації повинна сприяти утворенню метаболона. При набуханні матрикса можливий частково зворотній розпад комплексу на вільні ферменти. Іншим важливим фактором, що визначає формування метаболону, є рівні концентрацій певних метаболітів. Відомо, що адсорбція ферментів на мембранах чутлива до наявності специфічних метаболітів.

Таким чином, рівновага між метаболоном і вільними ферментами залежить від функціонального стану клітини чи органели.

Метаболон як керована система повинен мати просторово розділені робочі центри та центри управління. В ролі робочого центра метаболона виступає, очевидно, мікрокомпартмент, в якому здійснюється хімічна концентрація субстратів, які до нього надходять. Роль центра керування відводиться якірному білку підложки, що бере участь у сборці комплекса.

Роль факторів функціонування метаболону (за типом включення-виключення) відводиться не інтермедіатам метаболічного процесу, а зовнішнім факторам – вторинним посередникам, за допомогою яких забезпечується оптимальне функціонування метаболону в рамках системи більш високого рівня складності, тобто в клітині.

Загальний контроль функціонування за типом включення-виключення можна уявити наступним чином. Існує стан метаболону, в якому просторове розташування ферментів і конформації молекул ферментів такі, що вхід до мікрокомпартменту зачинений, і комплекс є неактивним. Вплив вторинного посередника на центр керування комплекса викликає такі зміни конформацій молекул ферментів комплекса (і, можливо, відносного розташування ферментів у комплексі), які призводять до зняття стеричних перешкод для входу субстратів в мікрокомпартмент і для подальшої хімічної трансформації їх в мікрокомпартменті.

Центр управління метаболону повинен включати не тільки якірний білок підложки, але і певні ферменти “першого поверху” комплекса, що знаходяться у безпосередній близькості до якірного білка.

У випадку комплекса ферментів гліколізу центр управління повинен включати, зокрема, 6-фосфофруктокіназу. Цей фермент може фосфорилюватись за участю протеїнкіназ, які активуються сАМР, що виконує в клітині функції вторинного посередника. У випадку комплекса ферментів ЦТК одним з якірних білків підложки є фермент, що входить до цієї метаболічної системи: сукцинатдегідрогеназа. Цей фермент особливо чутливий до іонів Са²+ і сАМР. Це може свідчити про те, що сукцинатдегідрогеназа виконує роль центра управління комплексом ферментів ЦТК і, можливо, системи більш високого рівня складності, а саме дихального ланцюга, асоційованого з комплексом ферментів ЦТК.

Отже, зборка ферментів, які беруть участь в загальному метаболічному шляху, забезпечує можливість реалізації механізму контролю, який в ієрархії рівней контролю займає більш високе положення у порівнянні з ізостеричними та алостеричними механізмами регуляції. Цей механізм контролю відповідає за управління каталітичної дії комплекса як цілого і забезпечує чутливість метаболічної системи до сигналів, які поступають від нервової, гормональної та імунної систем, тобто належить до механізмів спостереження. Механізми ізостеричної та алостеричної регуляцій при зборці ферментів в комплекс зберігаються, хоч їх ефективність може змінюватися.

Література:

1. Ермаков Г.Л. Надмолякулярная организация гликолиза эритроцитов. І.Состав цитоплазмы // Биохимия – 1995 – т.60, вып. 4 – с.560-567.

2. Карасев В.А., Стефанов В.Е., Курганов Б.И. Надмолекулярные биоструктуры: Организация, функционирование, происхождение // Итоги науки и техники. Серия: Биология химия, М.,:ВИНИТИ., 1989, т.31 - 200с.

3. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Принципы пространственно-временной организации клеточного метаболизма. // Успехи современной биологии. - 1989 – т.108, вып.1(4) – с.19-35.

4. Поглазов Б.Ф. Организация биохимических систем. // Биохимия. – 1996 – т.61, вып.11 – с.1941-1947.

5. Velok C., Mixon M.B., Teige M., Srere P.A. Model of quinary structure between Krebs TCA cycle enzymes : a model for the metabolon // Biochemistry – 1997 – v.36, № 47 – p. 14272-14276.