Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 35 наукових праць, з яких, 25 – у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України (7 статей без співавторів), 7 – у матеріалах конференцій, отримано 1 деклараційний патент України на корисну модель і 2 патенти України на корисну модель.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена державною мовою на 396 сторінках, з яких 345 основного тексту, і складається із вступу, 7 розділів, рекомендацій, щодо наукового і практичного використання здобутих результатів, висновків, списку літературних джерел та додатків. Список літературних джерел містить 434 бібліографічний опис, з яких 245 викладено кирилицею, 189 – латиною. Робота ілюстрована 69 рисунками, 20 таблицями та 101 фотографією.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Об’єктами дослідження стали плаценти породіль і тварин. Враховуючи подвійне походження плаценти, доцільно вивчати окремо – материнську і плодову частину плаценти. Беручи до уваги складну будову плаценти і використання великої кількості термінів в літературі, при описанні її структури дотримувалися Міжнародної гістологічної номенклатури (Гент, Бельгія, 1992).
Дослідження складалося з двох етапів. На першому етапі дослідження будови плаценти і лімфоїдної тканини, асоційованої з нею, вивчалися плаценти породіль з фізіологічним перебігом вагітності і після зміненої імунологічної реактивності материнського і плідного організмів. Досліджено 126 доношених плацент породіль. Були сформовані чотири групи дослідження: перша група – жінки, які мали в анамнезі антигенний вплив протягом третього періоду вагітності, що було зафіксовано в картах пологів, але, згідно патологоанатомічному дослідженню, не мали запального процесу в плаценті та плідних оболонках. Друга група – група порівняння – плаценти жінок з фізіологічним перебігом вагітності. Третя група – плаценти жінок з резус–несумісністю, без наявності ознак гемолітичної хвороби у плодів і новонароджених та відсутністю патологічного процесу в плаценті. Четверта група – група порівняння – плаценти жінок з фізіологічним перебігом вагітності і без ознак гемолітичної хвороби у плодів і новонароджених.
Комісією з етичних питань та біоетики Запорізького державного медичного університету (протокол № 3 від 17.04.2008 р.) встановлено, що проведені дослідження відповідають принципам Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною Асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (2000 р.), Конвенцією Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), відповідним положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних, наукових товариств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983 р.) та законам України.
Другим етапом дослідження морфогенезу плаценти і її лімфоїдної тканини стали плаценти щурів. Плацента щурів за розвитком та будовою подібна до плаценти людини (дископодібна, хоріонічна, гемохоріальна), що дозволяє проводити порівняльний аналіз їх будови. При дослідженні експериментально отриманого матеріалу вивчали плаценти щурів, отриманих з „Біомодельсервісу” (м. Київ) з ветеринарним свідоцтвом про стан здоров’я тварин для подальшого утримання в умовах віварію згідно рекомендацій Ю.М. Кожем’якіна та ін. (2000). Догляд за тваринами здійснювали за спеціальними нормами і вимогами, розробленими згідно етичного кодексу Ради Міжнародних медичних організацій „Міжнародні рекомендації для проведення медико–біологічних досліджень із застосуванням тварин”. Забій тварин проводили шляхом декапітації після ефірного наркозу.
Об’єктом експериментального дослідження стали 146 плацент щурів племені Vistar на 18–у, 20–у, 22–у добу вагітності та на час пологів. На кожен строк дослідження забирали плаценти двох–трьох приплодів. Кількість плодів і новонароджених в приплодах становила 5–6 тварин. Тварини були поділені на п’ять груп. Перша група – інтактна. Друга експериментальна група представлена тваринами, яких імунізували комерційним стафілококовим анатоксином (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва) за методикою В. А. Сіліна та ін. (1981). Третя група контрольна – плаценти тварин, яким уводили фізіологічний розчин замість стафілококового анатоксину. Четверта експериментальна група – плаценти, що отримані від тварин, плодам яких уводили імуноглобулін за методикою М.А. Волошина (1981). П’ята група – контрольна по відношенню до четвертої, тваринам замість імуноглобуліну уводили фізіологічний розчин.
Дослідження плацент породіль і тварин починалося з огляду. До морфометричних показників відносили: масу плацент, її розміри, діаметр і об’єм плацент. Вимірювалася маса плодів і новонароджених, їх довжина тіла, обчислювався відносний показник: маса плаценти/маса плоду, або новонародженого і, відповідно, – плацентарно–плодовий коефіцієнт. Вимірювали товщину плодової і материнської частини.
Для гістологічного дослідження брали шматочки плаценти породіль розмірами 2х2 см з центральної зони плаценти, а плаценти тварин забиралися повністю. Отриманий матеріал від людини фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну (pH 7,0), при кімнатній температурі протягом 5–6 діб, або у рідині Карнуа. Анатомо–експериментальний матеріал фіксували в розчині Буена, абсолютному спирті і розчині Карнуа. Виготовляли 150–200 серійних зрізів, товщиною 5 мкм.
Для оглядової мікроскопії проводили фарбування зрізів гематоксиліном і еозином, ШЙК–реакцію з додатковим фарбуванням ядер гематоксиліном Караці. Підраховували абсолютну площу, що припадає на строму ворсин, цито– і синцитіотрофобласт, синцитіальні вузли і материнські лакуни в плаценті людини на 10000 мм2. Проводили гістометрію – підрахували відносну площу, що припадає на відкладання фібриноїду, материнські лакуни, плодові судини і сполучнотканину строму трабекул плаценти щурів. Для вивчення розподілу фібриноїду фібринового і матриксного типу гістологічні зрізи фарбували за Маллорі. Для специфічного виявлення вуглеводного компоненту композитів фібриноїду проводили лектингістохімічну реакцію з набором лектинів: кори бузини чорної (SNA), зародків пшениці (WGA), сої (SBA), ікри окуня (PFA), арахісу (PNA).
Для вивчення особливостей розподілу колагенів в плацентарних структурах проводили імпрегнацію сріблом за Лейдлоу. Лектингістохімічним методом досліджували розподіл колагенів III, V і VI типів з використанням комерційного набору „Лектинтест” (м. Львів). Для імуногістохімічного дослідження колагену ІV типу (n=40) використовували первинні антитіла (DAKO) і систему візуалізації LSAB (Labelled Streptavidin-Biotin).
Для дослідження відкладень антирезусних імунних комплексів на поверхні ворсин цитотрофобласту застосовували лектингістохімічний метод, з використанням лектину еритроаглютинину. Площу відкладень антирезусних комплексів вираховували на площу 10000 мкм2. Кількісну оцінку результатів лектингістохімічної реакції проводили методом комп’ютерної морфометрії та мікроденситометрії за допомогою ліцензійної копії комп’ютерної програми „Відеотест – Размер 5.0” (ООО Видеотест, Россия).
Для вивчення дендритних клітин лімфоїдної тканини, асоційованої з плацентою, шматочки плаценти фіксували у випарах рідкого азоту. Виготовляли кріостатні зрізи товщиною 10 мкм, виявляли дендритні клітини за допомогою реакції на АТФ–азу (за методом Вахштейна–Мейзеля). Одночасно, дендритні клітини виявляли за допомогою лектинів сочевиці (LCA) і конконоваліну А (Con A).
Для кількісного і якісного вивчення лімфоцитів плаценти, використовуючи морфометричну сітку Глаголєва в модифікації С.Б. Стефанова, підраховували загальну кількість лімфоцитів в децидуальній пластинці матки і в стромі ворсин хоріальної частини плаценти на умовну одиницю площі 10000 мкм2 при імерсійному збільшені мікроскопа (об. 100, ок.10). Для виявлення цитотоксичних лімфоцитів використовували альціанове забарвлення при критичній концентрації електроліта MgCl2 0,6М. Для вивчення розподілу плазматичних клітин проводили фарбування за Браше. Для виявлення лімфоцитів, які фенотипічно розрізняються за вуглеводними залишками, проводили дослідження із застосуванням лектинів арахісу (PNA), сої (SBA) та слимака (HPA).
Для дослідження популяції цитотоксичних лімфоцитів в плаценті аналізували рівень експресії маркера СD8+ на лімфоцитах (n=50); популяції В1–лімфоцитів – маркер СD5+ (n=75) в імуногістохімічних реакціях з моноклональними антитілами виробника DakoCytomation (Denmark – USA).
Мікрофотографування досліджуваних об’єктів виконано на відеосистемі „Aksiolap” (“Carle Ceis”, Німеччина).
Облік морфологічних ознак проводили методом морфологічного урахування структур за С.Б. Стефановим. Статистичну обробку отриманих числових результатів проводили методами варіаційної статистики. Для перевірки наявності зв’язку між перемінними, які були отримані, застосували кореляційний аналіз (коефіцієнт кореляції Пірсона). Достовірність різниці між групами оцінювали за методом Стьюдента–Фишера для порогу вірогідності результатів не менше 95%, що є загальноприйнятою в біологічних і медичних розрахунках (р<0,05).
Результати дослідження та їх аналіз. При досліджені морфо–функціональних змін в системі "мати–плацента–плід", внаслідок антигенної стимуляції протягом третього періоду вагітності і при ізоімунній несумісності по резус фактору, встановлено, що вони залежать від реактивності імунної системи материнського і плідного організмів.
Плаценти групи жінок, які мали антигенний вплив протягом третього періоду вагітності і резус–несумісність, частіше, ніж у контролі, мали неправильну форму. У породіль з антигенним впливом виявлялось зростання середньої маси плацент 506,1±11,58 г, в групі порівняння – 486,0±16,41 г і збільшення товщини плодової частини плаценти до 16,50±1,00 мм; при резус–несумісності відбувалося збільшення її площі 349,5±1,66 мм2, в групі порівняння 331,98±14,71 мм2 і потовщення материнської частини плаценти до 14,50±1,10 мм. В першій групі спостереження, після антигенного впливу на організм вагітної, відбувалося зменшення площини лакун до 445,72±45,58 мм2, в другій групі порівняння цей показник становив 524,82±9,68 мм2.
Материнські поверхні плацент жінок з резус–несумісністю часто мали неправильну форма. Товщина, розміри і розташування часточок відрізнялися значною варіабельністю.
При порівнянні гістологічних особливостей базальної пластинки першої групи і другої групи спостереження відзначено, що більшість плацент жінок (95 %) після антигенного тиску протягом третього періоду вагітності мають осередкові скупчення лімфоцито–макрофагальних клітин. В групі порівняння вони також є, але розташовуються дифузно, навколо якірних ворсин. Основна відпадна оболонка плацент третьої групи спостереження (резус–несумісність) рівномірно кровонаповнена і містить велику кількість фібриноїду.
В плаценті жінок з антигенною дією протягом третього періоду в товщі хоріоничної пластинки доволі часто виявляються осередки лейкоцито–лімфоцитарних інфільтратів (75 %, проти 40 % у контролі). Шар Лангханса хоріонічної пластинки є потовщеним (у 80 % випадків, проти 45 % у групі порівняння). При ізоімунній несумісності по резус–фактору він також представлений товстим шаром фібриноїда і хоріонічна пластинка завжди має нерівномірну товщину.
Проявом компенсаторно–пристосувальних механізмів в плаценті, на тлі дії антигенів на організм вагітної і зростання кількості лімфоцитів в ній, є зміна форми ворсин. Вони мають виражені вигини контурів, які включають численні опуклості та інвагінації, що надає таким ворсинам виду неправильної, зім’ятої форми. Одночасно такі ворсини є багатими на лімфоцити малого діаметру, особливо в прошарку синцитія.
Абсолютна площа, яка припадає на синцитіо– і цитотрофобласт в першій групі жінок (антигенний тиск на вагітну протягом останнього триместру вагітності), становить 343,06,±67,68 мм2 абсолютної площі, в другій групі порівняння – 358,32±26,37 мм2. Абсолютна площа, що припадає на синцитіальні вузли в третій групі (резус–несумісність), становить 152,59±16,27 мм2, в контролі (четверта група) – 174,19±15,29 мм2.
Площа нашарувань антирезусних імунних комплексів в плацентах при резус–несумісності становить 240,76±23,09 мкм2. В плацентах групи порівняння – 182,62±23,56 мкм2. При порівнянні щільності таких нашарувань в одиницях яскравості, в третій групі цей показник становить – 308,55±45,09 одиниць, а в контролі – 152,34±34,00 одиниць.
Останнім часом особлива увага морфологів, ембріологів, клініцистів приділяється процесу колагенезу в плаценті (Ситнікова В.О., 2004). При досліджені накопичення колагенових волокон, пофарбованих за Маллорі, встановлено, що в плацентах з антигенним впливом, в більшості випадках, волокна розрихлені, розпушені і потовщені.
У плацентах жінок з фізіологічним перебігом вагітності і без резус-несумісності колагенові волокна при виявленні їх імпрегнацією азотнокислим сріблом за Лейдлоу мають вигляд лінійних, довгих, звивистих волокон світло–коричневого кольору, товщиною до 5 мкм. Волокна світло–коричневого кольору ідентифікуються як колаген І типу. В стромі стовбурових ворсин вони щільно прилягають одне до одного, утворюючи пучки.
При дослідженні плацент породілей з вірогідним антигенним впливом, встановлено, що в стромі ворсин зростає експресія колагену I типу (++), порівняно з плацентами жінок другої групи (+). Спостерігається огрубіння цих волокон, щільність їх зростає, окремі волокна майже не розрізняються. Нерівномірне потовщення і огрубіння волокон колагену I типу також спостерігається в децидуальній пластинці.
При дослідженні розподілу колагену III типу за Лейдлоу в плацентах з фізіологічним перебігом вагітності, його волокна є тонкими і ніжними, порівняно з волокнами колагену I типу. Вони злегка звивисті, чорного кольору, товщиною до 1 мкм, радіально розташовані в товщі стінок судин стовбурових ворсин. В децидуальній пластинці вони локалізуються навколо судин і утворюють дрібнопетельний візерунок.
У жінок першої групи – з обтяжливим діагнозом, експресія колагену III типу в плаценті переважає (++), порівняно з плацентами жінок контрольної групи (+). Волокна, частіше, ніж в нормі, потовщені; спостерігається їх фрагментація, розщеплення та огрубіння. В децидуальній пластинці волокна чорного кольору зберігають петельний малюнок в стінках судин. Отримані дані співпадають з клінічними даним інших авторів (Назаренко Л.Г., Неєлова О.В., 2006; Задорожна Т.Д., Жук В.Ю., 2007).
При дослідженні колагену III типу лектингістохімічним методом встановлено, що топографія волокон співпадає з локалізацією волокон чорного кольору після імпрегнації сріблом. Оскільки приєднання лектину окуня після гідролізу відбувається до рецепторів–лігандів, розташованих на глікопротеїновій оболонці колагену III типу, волокна мають більш потовщений, огрубілий вигляд, ніж після імпрегнації сріблом, і завтовшки 3–5 мкм. Збільшення накопичення, ніж в нормі, колагену III типу просліджується в плацентах жінок першої і третьої груп (++, +++, відповідно). PFA+–волокна колагену III типу мають товщину до 7 мкм. Найчастіше вони фрагментовані й мають розщеплений характер.
При вивченні розподілу колагену IV типу, імуногістохімічним методом при фізіологічно перебігаючій вагітності встановлено, що інтенсивне накопичення колагену визначається в базальній мембрані судин ворсинчастого трофобласту (+++), базальній мембрані епітелію синцитіотрофобласту (+++), у складі міжворсинчатого фібриноїду та стромі ворсин, особливо стовбурових. В структурі базальної мембрани судин хоріону колаген IV типу нашаровується у вигляді суцільної смужки, товщиною 1,5–2 мкм. В товщі базальної мембрани синцитіотрофобласту утворює суцільну смугу, товщиною 2-3 мкм, яка має нерівний, розшарований контур.
У складі міжворсинчастого фібриноїду, який нашаровується на поверхні ворсин, колаген IV типу має вигляд аморфних мас. Особливо інтенсивне відкладання колагену IV типу у складі фібриноїду відбувається на поверхні синцитіокапілярних мембран.
У плацентах першої групи (інфекційний процес у жінок протягом третього періоду вагітності) в структурі мембран синцитіотрофобласту колаген IV типу виявляється у вигляді грубих, розволокнених смужечок, порівняно з другою групою плацент. В місцях синцитіальних вузлів колаген IV типу відсутній в структурі базальних мембран. У складі фібриноїду ворсинчастого хоріону і основної відпадної оболонки інтенсивність накопичення колагену IV типу вища, порівняно з контрольною другою групою (+++).
У разі вивчення розподілу колагену V типу лектингістохімічним методом, встановлено, що топографія тоненьких (до 1 мкм завтовшки), звивистих, довгих, світло–коричневих SBA+–волокон співпадає з локалізацією волокон коричневого кольору після імпрегнації сріблом. В сполучнотканинній стромі стовбурових ворсин вони локалізуються навколо стінок судин, або вільно, неупорядковано розташовуються в сполучній тканині. В проміжних ворсинах вони ще тонші, звивисті і їх можна підраховувати (8–10 волоконець). В термінальних ворсинах їх або не видно, або вони ледь контуруються. В децидуальній пластинці майже не візуалізуються SBA+–волокна, але вони добре ідентифікуються в стромі якірних ворсин. В плацентах жінок після перенесеного гострого респіраторного захворювання протягом третього періоду вагітності інтенсивність експресії колагену V типу дещо вища.
При виявленні розподілу колагену VI типу лектингістохімічним методом у плацентах з фізіологічним перебігом вагітності встановлено, що LCA+–волокнисті структури зустрічаються в сполучній тканині ворсин і мають вигляд коричневих уривчастих смужечок. В децидуальній пластинці вони мають павутиноподібний вигляд. При резус–несумісності колагенові LCA+–волокна VI типу мають темніший колір (коричневий) на поверхні синцитіокапілярних мембран (+++), порівняно з контрольною групою (+).
У породілей з антигенним впливом протягом третього періоду вагітності і резус-несумісністю спостерігається надлишковий, порівняно з нормою, синтез колагенів I, III, V і VI типів у плацентарних структурах, що сприяє прискореному старінню плаценти. Посилення фібрилоутворення в плаценті відбувається на фоні зростання кількості лімфоцитів в плодовій і материнській частинах плаценти.
Підтвердженням ролі лімфоїдної тканини в процесі морфогенезу плаценти є закономірність зміни морфології плацент на тлі зростання лімфоцитів в плаценті протягом третього періоду вагітності у тварин. В лабіринтній частині плаценти протягом третього періоду вагітності щурів спостерігається стоншення гемато-плацентарного бар’єру за рахунок деструкції цито– і синцитіотрофобластичного прошарку клітин сполучної зони плаценти. З 18–ї доби вагітності і до пологів відносна площа, що займають клітини трофобласту, становить 31,87±0,34 % і 16,43±1,33 %, відповідно.
Імунізація вагітних тварин стафілококовим анатоксином призводить до змін в морфогенезі плаценти і плоду протягом третього періоду вагітності. Маса і товщина плацент експериментальної групи на 18–у добу становить 0,36±0,03 г і 9,30±1,10 мм. Дані показники менші від показників групи контролю (0,65±0,01 г; 16,40±3,10 мм, відповідно), що призводить до порушення трофічної функції плаценти і зниження маси і довжини тіла у плодів (1,68±0,12 г, 24,00±1,20 мм – в нормі, 0,80±0,03 г, 21,00±2,30 мм – в експерименті). Зміни в морфогенезі плаценти компенсуються зростанням її діаметру протягом всіх строків спостереження, порівняно з контрольною групою, що можна вважати компенсаторно–пристосувальною реакцією. Різниця в морфологічних показниках новонароджених практично нівелюється, але порушується механізм пологів, які стають невчасними. Порушення пологів відбувається на фоні більш прискореного потоншання шару клітин сполучної зони протягом третього періоду вагітності, відкладання більшої кількості фібриноїдних нашарувань в материнських лакунах, що змінює структуру гемато–плацентарного бар’єру.
Внутрішньоплідне уведення імуноглобуліну плодам на 18–у добу вагітності призводить до змін у морфо–функціональному стані плаценти. На 20–у добу вагітності, плаценти мають більшу масу (0,91±0,03 г; в нормі – 0,89±0,06 г); більший діаметр (18,33±1,12 мм; в нормі – 13,92±1,16 мм), але меншу товщину (9,00±1,00 мм; в нормі – 13,20±0,30 мм), що призводить до перевищення показників маси і довжини тіла у плодів порівняно з контролем. Наприкінці вагітності, навпаки, всі морфологічні показники плаценти і плодів відстають від показників контрольної групи. Виявлені зміни плаценти супроводжуються стрімкою інволюцією шару „глікогенових” клітин і шару гігантських трофобластичних клітин, значним накопиченням материнського фібриноїду в лакунах на час пологів (28,33±9,06 % та 21,86±1,76 % в нормі), що призводить до змін у структурі гемато–плацентарного бар’єру та закінчується невчасними і десинхронізованими пологами.
Формування толерогенних фето–плацентарно–материнських взаємовідносин залежить від біологічного бар’єру, центральне місце в якому посідає лектинрецепторна система трофобласту, що корелює зі змінами в функціюванні різних відділів імунної системи плаценти протягом третього періоду вагітності. В децидуальній пластинці зростає кількість цитотоксичних HPA+–лімфоцитів, SBA+–В–лімфоцитів і плазматичних клітин материнського походження; в сполучній зоні плаценти збільшується число цитотоксичних HPA+–лімфоцитів плідного походження.
Залежно від динаміки вагітності змінюється топографія і функції фібриноїду, як механічного бар’єру для адгезії клітин або адсорбції речовин. Трофобласт вкрито шаром фібриноїду, який має складну молекулярну, хімічну і стереохімічну будову. Імунозахисні функції фібриноїда визначаються якісним і кількісним складом речовин, що входять до його композитів – фібрином, фібронектином, ламініном, тенесцином, анексином, гепаран–сульфатом, протеогліканами, колагенами I, II, III, IV і V типів (Милованов А.П., 1999). В складі цих речовин є вуглеводвміщуючі біополімери, які забезпечують різні адгезивні властивості фібриноїду, ступінь компактності і просторову структуру його нашарувань. Вуглеводна композиція речовин, що входить до відкладань фібриноїду в материнських лакунах, в плодових судинах, на межі материнської і плодової частини плаценти та в децидуальній пластинці відтворює імуноморфологічні взаємовідносини в системі мати–плацента–плід.
Маскування антигенів клітин трофобласта шаром сіалоглікопротеїдів блокує аферентну ланку імунної реакції з боку материнського організму, в той час як шар фібриноїда, що фіксує антитрофобластичні антитіла і сенсибілізовані лімфоцити матері, і виключає еферентну ланку імунної відповіді. Зовнішня поверхня трофобласта, що вкрита фібриноїдом, стає замаскованою і одночасно адгезивною, що сприяє зв’язуванню біополімерними молекулами рецепторів лімфоцитів, з подальшою їх інактивацію і відміною розвитку імунологічних реакцій з трофобластом.
Фібриноїд плаценти переважно складається із фібрину – глікопротеїну, у якого вуглеводна частина закінчується сіаловими кислотами, що є лігандом для лектину кори бузини чорної (SNA). Маскування рецепторів клітин трофобласту сіаловими кислотами захищає їх від різних руйнуючих факторів та забезпечує механізм формування імунного неспецифічного бар’єру в плаценті. Одним із агресивних факторів по відношенню до клітин трофобласту є дія материнських цитотоксичних лімфоцитів лакунарної крові і децидуальної пластинки, які проявляють тропність до рецепторів, що вміщують сіалові кислоти. Тому, у тварин експериментальної групи після імунізації вагітних стафілококовим анатоксином, інтенсивність накопичення рецепторів до лектину кори бузини чорної в структурі фібриноїдних мас збільшується в децидуальній оболонці і в сполучній зоні плаценти, що співпадає із зростанням загальної чисельності лімфоцитів.
При відсутності неспецифічного бар’єру фібринового походження на поверхні клітин трофобласту, імуноадсорбуючу функцію по відношенню до лімфоцитів виконують вуглеводні залишки рецепторів–інтегринів тенесцину і анексину. Вуглеводні залишки тенесцину і анексину V, які виявляються лектином пшениці (WGA), вибірково адгезують NK–клітини, В–лімфоцити, активовані Т–лімфоцити (Erickson H.P., 1994; Cong-xiao Gao et al., 2005). Кількість та інтенсивність нашарувань WGA+–походження корелює із загальною кількістю лімфоцитів в децидуальній пластинці і в шарі гігантських трофобластичних клітин. У тварин експериментальної групи чисельність і щільність WGA+–нашарувань в децидуальній пластинці і в перехідній зоні більша, ніж у тварин контрольної групи.
Сорбція імуноглобулінів та імунних комплексів в фібриноїдних масах діагностується за SBA+–відкладаннями, тому що вуглеводні залишки конститутивних фрагментів імуноглобулінів проявляють специфічність до лектину сої (SBA). У тварин імунізованих стафілококовим анатоксином, щільність рецепторів до лектину сої збільшується порівняно з тваринами контрольної групи в фібриноїдних депозитах кожної окремої локалізації. Таким чином, накопичення SBA+–субстанцій в різних відділах плаценти на базальних мембранах відтворює інтенсивність адгезії імуноглобулінів та імуноглобулінових комплексів і корелює із кількістю В–лімфоцитів. Зростання кількості В–лімфоцитів і плазматичних клітин після імунізації вагітних стафілококовим анатоксином посилює антитілогенез в децидуальній пластинці матки, що впливає на інтенсивність відкладання фібриноїду в усіх частинах плаценти, та узгоджується з даними окремих авторів (Глуховец Б.И., Глуховец Н.Г., 2002).
Якісний склад фібриноїду впливає на темпи інволютивних процесів у плаценті. Збільшення кількості неоднорідних за оптичною щільністю SBA+–агрегатів протягом третього періоду вагітності на межі материнської і плодової частин плаценти відображає неспроможність клітин трофобласту зруйнувати літичними ферментами імунні комплекси, які накопичуються в фібриноїдних масах. В свою чергу SBA+–субстанції можуть розпізнаватися як антигени макрофагами, що призводить до розвитку імунної реакції матері проти плоду, як алотрансплантату, наприкінці вагітності і до порушення цілісності тканинного бар’єру.
Специфічними маркерами до вуглеводного компоненту фібронектину, який є одним із компонентів фібриноїду, вважається лектин арахісу (PNA). Імунізація вагітних тварин стафілококовим анатоксином призводить до збільшення відкладань PNA+–речовин порівняно з тваринами контрольної групи серед гігантських трофобластичних клітин перехідної зони плаценти і в товщі децидуальної пластинки матки протягом всіх термінів спостереження. PNA+–вуглеводні залишки, які входять до складу молекули фібронектину, відтворюють експресію рецептору адгезії. Фібронектин є адгезином для активованих Т– і В–лімфоцитів, NK–клітин, для Т–лімфоцитів памґяті та макрофагів. Посилене відкладання материнського і плодового PNA+–фібриноїду можливо розцінювати як результат напруження імунологічних взаємовідношень між матір’ю і плодом. Динаміка та інтенсивність накопичення PNA+–депозитів в різних частинах плаценти корелює із динамікою кількості лімфоцитів у тварин контрольної та експериментальної груп. Зростання протягом останнього періоду вагітності нашарувань PNA+–фібриноїду, опосередковано, вказує на початок процесу зриву імунологічної толерантності материнського організму стосовно плоду. Подібні дані отримані О.Д. Луцик, О.В. Смольковою, А.М. Ященко (2003).
Ламінін – глікопротеїн базальних мембран, вуглеводна частина якого адгезує NK–клітини і активовані лімфоцити і специфічно зв’язується з лектином ікри окуня (PFA). У тварин експериментальних груп, після дії антигенів на материнський і плідний організм, збільшується інтенсивність відкладання часточок бензидину на мембранах клітин трофобласту і базальних мембранах плодових судин та судин децидуальної оболонки. Ламінін, як адгезивна молекула відіграє важливу роль для адсорбції лімфоцитів, кількість яких у експериментальних тварин вища, ніж у тварин контрольної групи.
Поява в фібриноїдних нашаруваннях SNA+–рецепторів до вуглеводних речовин з кінцевими залишками манози вказує на порушення трофічної функції плаценти, що пов’язано з відкладанням на поверхні лакун нерозчинних протеїнів і відповідає даним K.K. Mann, S. Andre et al. (2004).
Таким чином, проведені дослідження доводять, що морфофункціональний стан імунологічного бар’єру в системі мати–плацента–плід забезпечується давньою і консервативною системою лектинового розпізнавання „свого” – „не свого”. Пошкодження тканин трофобласту материнськими цитотоксичними лімфоцитами має постійний, каскадний характер, починаючи з глікокаліксу клітин, їх цитоплазматичних мембран та базальних мембран. Ієрархія лектинопосередкованих механізмів захисту трофобласту має також ступінчастий характер. Для підтвердження цих положень проведено експериментальне дослідження з внутрішньоплідним уведенням плодам антигену, що призвело до зміни їх імунного стану і фібриноїду. Першим тканинним бар’єром є вуглеводні залишки з сіалірованими закінченнями. При зв’язуванні з лігандами такі лектини змінюють конформацію, що веде до відкриття нових детермінант для подальшого розвитку захисної реакції. Одним із механізмів зриву імунологічної толерантності наприкінці вагітності, можливо, є зростання SNA+–фібриноїдного нашарування в плаценті.
Синтез захисних лектинрозпізнаючих рецепторів носить постійний характер і залежить від напруженості імунологічних відносин в системі мати–плацента–плід.
Згідно сучасних уявлень відносно біології трансплантатів, при вагітності повинні одночасно включатися як реакції матері, направлені проти фетоплацентарних антигенів (класична реакція хазяїн проти трансплантата), так і реакції плоду, направлені проти антигенів матері (реакція трансплантата проти хазяїна).
Внутрішньплідне уведення антигену призводить до суттєвих змін в послідовності та інтенсивності накопичень різних речовин у фібриноїдних депозитах материнських лакун на фоні зростання кількості лімфоцитів у сполучнотканинній стромі трабекул лабіринтного відділу плаценти.
Зростання кількості цитотоксичних лімфоцитів у стромі трабекул призводить до підвищеного синтезу клітинами трофобласту ламініну. При руйнуванні синцитіотрофобласту та цитотрофобласту, що відбувається наприкінці вагітності, ламінін потрапляє у великій кількості до фібриноїдних депозитів. Після внутрішньоплідного уведення антигену інтенсивність деструкції клітин трофобласту протікає більш інтенсивно, порівняно з контрольними тваринами. Зростання ламінін–PFA+–депозитів плідного походження в складі фібриноїду протікає на фоні прискорених інволютивних процесів у плаценті в прямій кореляції із зростанням чисельності цитотоксичних HPА+–лімфоцитів.
При зниженні функціональної активності клітин трофобласту протягом третього періоду вагітності зменшується синтез WGA+–танесцину і анексину. В експериментальних тварин після внутрішньоплідного уведення імуноглобуліну цей процес протягом третього періоду вагітності протікає менш інтенсивно. Уведення білкового антигену плодам, супроводжується збільшенням інтенсивності відкладання SВA+–депозитів у складі фібриноїда материнських лакун. SВA+–композити є імуноглобулінової природи плідного походження. Надлишкове відкладання SВA+–речовин змінює морфо–функціональний стан трофобласту.
Таким чином, фібриноїд є складовою частиною біологічного бар’єру в плаценті, що має материнське та плідне походження. Неспецифічні імунні реакції менш вибіркові, проте більш надійні з позиції молекулярної регуляції. Тому поетапний процес лектинового розпізнавання фібриноїдом антигенів в лабіринтній частині плаценти відображає процес імунологічного захисту плоду. Зміни в структурі фібриноїду будуть залежати від того, яка ланка імунітету і яка популяція лімфоцитів буде активована. За характером та інтенсивністю накопичення того чи іншого композиту фібриноїду, їх топографією можна робити висновки щодо напруженості імунних відносин в системі мати–плацента–плід, реактивності імунної системи новонародженого і дитини.
При досліджені будови лімфоїдної тканини, асоційованої з плацентою, яка має плодове і материнське походження, встановлено, що вона представлена наступними складовими частинами.
Антигенпрезентуючі клітини (макрофаги і дендритні клітини). Протягом третього періоду вагітності зростає кількість макрофагів в децидуальній пластинці і в стромі ворсинчастого хоріону, що пов΄язано з інтенсивними процесами альтерації на тлі інволютивних процесів у плаценті.
На початку третього періоду вагітності (29 тиждень) в зоні базальної пластинки виявляються поодинокі якірні ворсини калібром 100–120 мкм, біля яких виявляються АТФ–позитивні клітини. АТФ–позитивні дендритні клітини розташовані на межі децидуальної пластинки і плодової частини плаценти, серед клітин позаворсинчастого трофобласту, які не несуть на своїй цитоплазматичній мембрані класичні рецептори головного комплексу гістосумісності першого класу, згідно літературних даних (Blois S. M., Kдmmerer U., Soto C. A. et. al., 2007). Встановлені особливості топографії дендритних клітин дозволяє блокувати розвиток імунної відповіді на антиген та підтримує стан імунологічної толерантності материнського організму до плоду.
Тіла клітин мають подовжену форму, нерівні контури цитоплазматичної мембрани. Ядро світлого тону і також має подовжену форму та хвилясті контури. Відростки орієнтовані переважно вздовж межі плодової і материнської частини плаценти. АТФ–позитивні відростки мають звивисті контури, що повторюють контури латеральної поверхні децидуальної пластинки. Довжина відростків становить 80-90 мкм, товщина – 2–4 мкм.
На 39–40 тиждень вагітності жінок АТФ-позитивні клітини виявляються на межі материнської і плодової частини плаценти. Тіло клітин має вигляд напівмісяця, від якого відходять 3–5 відростків. Відростки потовщуються порівняно з 29 тижнем вагітності. Так, в середньому кількість відростків становить 5–7, а їх товщина – 8–10 мкм. Інтенсивність накопичення АТФ–позитивної речовини у відростках стає вищою, ніж на 29 тиждень вагітності. Наприкінці вагітності та при порушенні структури фетоплацентарного бар’єру на тлі впливу антигенів і активації місцевої імунної системи децидуальної оболонки матки у дендритних клітин виникає передчасний, ніж в нормі, контакт з клітинами плідного походження, що несуть на своїй цитоплазматичній мембрані рецептори І і ІІ класу головного комплексу гістосумісності (лімфоцити, фібробласти, макрофаги), що є стимулом їх активації і формуванням імунної відповіді, спрямованої на відторгнення плоду.
У плаценті щурів АТФ–позитивні дендритні клітини, також як і в плаценті людини, знаходяться на межі плодової і материнської частини – в сполучній зоні, що є важливою біологічною закономірностю. Сполучна зона представлена „глікогеновими” і великими трофобластичними клітинами, що не мають на своїй поверхні рецепторів головного комплексу гістосумісності І класу. Кількість відростків дендритних клітин становить, в середньому, два–три. Довжина відростків становить 70–80 мкм, а товщина – 9–10 мкм. В деяких випадках відростки дендритних клітин на кінцях мають багатоморфне потовщення: ґудзикове, віялоподібне та ін., за рахунок чого вони контактують із децидуальними клітинами компактного шару і з клітинами трофобласту, а також між собою.
На 18–у добу вагітності антигенпрезентуючі клітини розташовані, приблизно, рівномірно, через однакові проміжки – 10–12 мкм. Кількість АТФ–позитивних клітин на умовну одиницю площини 100000 мкм2 становить 1–2 клітини. Площу, яку займають дендритні клітини з відростками, становить 330,04±2,33 мкм2 на 100000 мкм2. Активність АТФ–ази, вираженої в одиницях оптичної щільності – інтегральний денсиометричний показник – становить 522,92±68,90 од. опт. щіл.
На 20–у добу вагітності кількість дендритних клітин зростає порівняно з попереднім строком спостереження. Кількість відростків збільшується. Підвищується функціональна активність клітин. Площа, яку займає АТФ–позитивний матеріал в цитоплазмі дендритних клітин, збільшується вдвічі.
Наприкінці вагітності (22–а доба вагітності) кількість відростків у клітин продовжує зростати. У кожної клітини їх стає 4–5, що в два рази більше, ніж на 18–у добу вагітності. Товщина відростків зростає до 29,15±2,00 мкм, а довжина коротшає до 57,09±6,32 мкм, з чим і пов’язане зростання загальної площи, яку займає АТФ–позитивний матеріал в цитоплазмі, – 1005,33±1,54 мкм2. Одночасно зростає накопичення АТФ–позитивного матеріалу у відростках, порівняно з попередніми строками спостереження. Активність АТФ–ази становить 870,78±91,87 од. опт. щіл. Відростки вже не утворюють на кінцях бляшки, а нагадують мережу, або павутинну структуру в товщі сполучної зони плаценти.
Під час пологів топографія дендритних клітин в плаценті принципово не змінюється. Як і при попередніх строках спостереження, вони локалізуються в сполучній зоні плаценти, товщина якої значно потоншується. Майже повна альтерація шару гігантських трофобластичних клітин супроводжується зростанням кількості АТФ–позитивного матеріалу в сполучній зоні на умовній одиниці площі. Відростки клітин розташовуються настільки щільно, що на межі плодової і материнської частин плацент формують єдину смугу чорного кольору. Відростки коротшають і потовщуються, за рахунок чого зростає абсолютна площа, яку займає АТФ–позитивний матеріал, – 3609,09±3,45 мкм2. Поодинокі трофобластичні клітини повністю оточені відростками дендритних клітин.
Незалежно від спрямованості дії антигенів: чи зі сторони материнського організму після імунізації вагітних стафілококовим анатоксином, чи зі сторони плоду – після введення імуноглобуліну плодам спостерігається прискорене стоншення сполучної зони плаценти, що призводить до передчасної активації АТФ–позитивних клітин і відміни імунологічної толерантності материнського організму до плоду. Зміни структури фетоплацентарного бар’єру супроводжуються змінами морфофункціонального стану АТФ–позитивних клітин. В дендритних клітинах збільшується накопичення АТФ–матеріалу, кількість відростків, їх товщина і довжина. Відростки замість ґудзикової форми набувають віялоподібну форму.
При лектингістохімічному дослідженні дендритних клітин виявлено, що в децидуальній пластинці доношеної плаценти жінки (38–40 тижнів вагітності) клітини, які несуть рецептори до конконаваліну (Con А+), розташовуються в базальній частині децидуальної пластинки і не зустрічаються на межі материнської та плодової частини плаценти. Вони мають розміри 20–30 мкм, неправильну форму з трьома–чотирма виступами. Ядра клітин світлі. Контури ядер неправильної, лопатної форми. В цитоплазмі клітин в невеликій кількості накопичується речовина, яка виявляється лектином конкановаліну А. Вона має світло–рудий колір, що є свідченням вмісту манозних залишків рецепторів. Бензединові часточки виявляються на поверхні цитоплазматичної мембрани в більшій кількості, ніж в цитоплазмі, тому вона має темно–коричневий колір, що вказує на накопичення манозних залишків рецепторів, які розпізнають антигени, на поверхні цитоплазматичної мембрани.
На дендритних клітинах манозні залишки рецепторів також виявляються лектином сочевиці (LCA). При вагітності, яка була ускладнена антигенною дією протягом третього періоду вагітності, в плаценті кількість дендритних клітин, які виявляються лектинами конконоваліну А, або сочевиці більша, порівняно з фізіологічним перебігом вагітності.
За даними літератури, дендритні клітини децидуальної тканини можуть бути „толерогенного” типу і альтернативного „активуючого” типу (Kдmmerer U. et. al., 2000). Вони відрізняються морфологією і функціями, що виконують. Дендритні клітини здатні виконувати роль сенсорів тканинного струсу і одночасно підтримувати імунологічну толерантність. Від цього залежить їх топографія: чи біля судин, з яких вони виходять при міграції і є ще неактивованими, або на межі материнської і плодової частин плаценти, де завжди відбуваються активні процеси руйнування клітин внаслідок інтенсивної інвазії клітин трофобласта.
За даними M. Kato, K. T. Neil D. Fearnley et al. (2000), незрілі дендритні клітини експресують рецептори, які допомагають адсорбувати екзогенні антигени. Такими рецепторами є С–тип лектинових рецепторів манозного походження – рецептори до лектину конканаваліну А. Тому Соn А+–дендритні клітини в більшій кількості виявляються на початку третього періоду вагітності, ніж перед пологами. З переключенням процесу адсорбції антигену на його процесінг кількість манозних рецепторів на поверхні цитоплазматичної мембрани зменшується, але зростає кількість ферменту АТФази в цитоплазмі клітини для розщеплення та експресії на цитоплазматичній мембрані антигену, і дендритні клітини стають активовані.
Наприкінці вагітності механізм міграції незрілих дендритних клітин в децидуальну пластинку та їх активація обумовлені змінами в інтенсивності експресії некласичних рецепторів HLA–G, HLA–Е, HLA–F і „оголенням” класичних рецепторів HLA–А, HLA–В і HLA–С МНС на поверхні клітин трофобласту (Gardner L., Moffett А., 2003), що, також, спостерігається при порушенні фетоплацентарного бар’єру. При внутрішньоутробних інфекціях процес руйнування трофобластичного бар’єру може бути дуже інтенсивним і підтримка імунологічної толерантності дендритними клітинами в таких умовах відміняється і формується імунна відповідь на тканини плоду.
Лімфоцити основної відпадної оболонки. У породілей при фізіологічно перебігаючій вагітності лімфоцити децидуальної пластинки представлені лімфоцитами малого, середнього і великого діаметру. Максимально лімфоцити концентруються навколо судин матки, залоз, ближче до вільного краю відпадаючої оболонки і в місцях вростання якірних ворсин. Лімфоцити розташовані дифузно, або утворюють невеликі скупчення з 4–7 клітин. Скупчення частіше виявляються біля судин, ближче до вільного краю відпадної оболонки. Відмічається полярне розташування лімфоцитів в децидуальній оболонці – переважно біля вільного краю і ближче до позаворсинчастого цитотрофобласту. Серед лімфоцитів середнього і великого діаметру є лімфоцити з широким і вузьким обідком цитоплазми. Загальна кількість лімфоцитів становить 26,17±2,05 клітин на умовну одиницю площі.
У породіль, вагітність яких була ускладнена антигенним впливом протягом третього періоду вагітності, зростає загальна кількість лімфоцитів децидуальної пластинки матки, особливо за рахунок малих і середніх лімфоцитів. При резус–несумісності їх кількість становить 51,34±4,55 лімфоцитів, що більше, ніж в нормі на 15 %.
Як і в плаценті жінок, лімфоцити децидуальної пластинки плаценти щурів розташовані по всій її товщині. Загальна кількість лімфоцитів спонгіозного шару децидуальної пластинки на умовній площі становить 12,44±0,30 клітин. Протягом третього періоду вагітності тварин, з 18–ї доби до пологів змінюються топографія і кількісний склад лімфоцитів. Їх кількість збільшується на межі материнської і плодової частини. В місцях контакту материнської тканини і трофобласту виявляються скупчення лімфоцитів малого діаметру з 7–9 клітин. Попередня імунізація вагітних тварин стафілококовим анатоксином призводить до зростання кількості лімфоцитів. В компактному прошарку децидуальних клітин, який тонший, ніж у тварин інтактної групи, за рахунок руйнування зовнішніх клітинних шарів, нараховується більша кількість лімфоцитів, ніж у тварин першої групи (малих лімфоцитів – 11,06±3,12, середніх – 9,04±0,45 і великих – 1,02±0,03). У тварин третьої експериментальної групи після внутрішньоплідного уведення антигену кількість лімфоцитів на 18–у добу вагітності на 25 % більше, порівняно з контролем.
Лімфоцити плодової частини плаценти. Лімфоцити ворсинчастого трофобласту плацент породіль зустрічаються в стромі ворсин дифузно. Окремі лімфоцити виявляються серед синцитіотрофобласту і з великою частотою вони зустрічаються в синцитіальних вузлах. Кількісний аналіз лімфоцитів плодової частини плаценти показав, що в першій групі спостереження плацент – у жінок з впливом антигену протягом останнього триместру вагітності, чисельність лімфоцитів вища. При фізіологічно перебігаючій вагітності кількість лімфоцитів в стромі термінальних ворсин становить 12,09±0,50 лімфоцитів.
В плацентах тварин в лабіринтному відділі плаценти лімфоцити виявляються в просвітах плодових судин, в сполучній тканині трабекул – поміж фібробластів, макрофагів, а також серед клітин цитотрофобласту і між клітинами багатоядерного синцитіотрофобласту. На умовній одиниці площи сполучної зони трабекул плаценти нараховується 5,71±0,45 клітин. Протягом третього періоду в нормі кількість лімфоцитів лабіринтної частини зменшується вдвоє. В сполучній зоні плаценти, навпаки, кількість лімфоцитів зростає наприкінці вагітності і лімфоцити утворюють невеликі скупчення з 5–7 клітин навколо гігантських трофобластичних клітин. Незалежно від спрямованості дії антигенів з боку материнського або плідного організмів кількість лімфоцитів в плодовій частині плаценти щурів зростає.
Домінуючою популяцією серед лімфоцитів децидуальної пластинки плаценти як людини, так і щурів є цитотоксичні HPA+–лімфоцити. Існує декілька типів цитотоксичних лімфоцитів, які зустрічаються в матково-плацентарному комплексі: γδ–Т–лімфоцити, CD16-CD56+–NК–клітини та CD3+CD8+–лімфоцити. Універсальним маркером всіх популяцій цитотоксичних лімфоцитів є рецептор, що проявляє спорідненість до лектину слимака (HPA) (Paffaro V.A., Celina M., Haraguchi et al., 1999). HPA+–лімфоцити мають, переважно, середній і великий діаметр. У лімфоцитів середнього діаметру є широкий обідок цитоплазми, в якій спостерігається декілька HPA+–гранул, що мають світло-коричневий колір. HPA+–лімфоцити мають круглу або неправильну форму. Лімфоцити розташовуються дифузно, виявляються серед децидуальних клітин материнських котиледонів, навколо якірних ворсин. В плацентах жінок з антигенним впливом протягом третього періоду вагітності більша частина децидуальних HPA+–лімфоцитів виявляється на межі плодової і материнської частини плаценти. Лімфоцити утворюють фронтальний пояс навколо якірних ворсин. Між кількістю цитотоксичних HPA+–лімфоцитів і загальною кількістю лімфоцитів встановлюється міцний вірогідний кореляційний зв’язок (r=0,97), який вище, ніж у групі порівняння.
Протягом третього періоду вагітності в плаценті щурів чисельність HPА+–лімфоцитів в децидуальній пластинці збільшується, особливо в компактному шарі, який контактує з плодовою частиною плаценти. Змінена імунологічна реактивність материнського організму призводить до зростання чисельності HPA+–лімфоцитів на 6–7 %.
На тлі дії антигенів зростає кількість цитотоксичних HPA+–лімфоцитів в плодовій частині плацент породіль і тварин, що вказує на активацію клітинної ланки імунітету плодів і новонароджених. Імунна система плоду людини відповідає посиленням міграції цитотоксичних лімфоцитів як в плаценту, так і в інші органи. Тому кількість цитотоксичних HPA+–лімфоцитів в стромі ворсин плацент жінок, як з антигенним впливом, так і з резус-несумісністю, вища.
Цитотоксичні CD8+–лімфоцити переважно середнього діаметру з середнім, або широким цитоплазматичнім обідком. Цитоплазматична мембрана має хвилясті контури. При фізіологічному перебігу вагітності CD8+–лімфоцити локалізуються, переважно, біля клітин цитотрофобласту якірних ворсин.
У плацентах жінок, вагітність яких була ускладнена антигенним впливом, кількість CD8+–лімфоцитів менша на 15 % (3,88±0,22), оскільки як більша їх частина занурена у фібриноїдні депозити. Так як CD8+–лімфоцити становлять 20–25 % від загальної кількості цитотоксичних HPA+–лімфоцитів, то, вірогідно, із всіх цитотоксичних лімфоцитів в децидуальній пластинці домінують NК–клітини і, або γδ–Т–лімфоцити.
Тривалий час підтримувалася точка зору, що в децидуальній пластинці відсутні В–лімфоцити (Mincheva–Nilsson L., 2003). Застосовуючи імуногістохімічний метод дослідження описано топографію CD5+–В1–лімфоцитів в основній відпадній оболонці і в стромі ворсин хоріону, що є підтвердженням функціювання гуморальної вродженої ланки імунітету в плаценті. CD5+–лімфоцити, або В1–лімфоцити децидуальної пластинки мають фенотип середніх лімфоцитів, ексцентричне ядро, широку хвилясту цитоплазму і повторюють морфологію плазматичних клітин. CD5+–лімфоцити локалізуються дифузно, переважно, в середній частині плаценти, в проміжках між материнських котиледонів і серед децидуальних клітин. Також CD5+–лімфоцити розташовуються навколо просвіту судин, ближче до вільного краю відпадної оболонки плаценти.
Антигенний вплив на організм матері призводять до активації гуморальної ланки імунітету імунної системи як матері, так і плоду. Підвищення чисельності CD5+–лімфоцитів вказує саме на активацію неспецифічної гуморальної ланки імунітету – В1–лімфоцитів, які синтезують слабко специфічні імуноглобуліни з класу М, які не проходять через фетоплацентарний бар’єр. Це призводить до збиткового відкладання SBA+–композиту фібриноїду, що було підтверджено в експерименті. Отримані дані співпадають з клінічними даними, які отримані Н.Ю. Сотниковою, А.В. Кудряшовою (2008).
Стосовно виявлення В–лімфоцитів в плодовій частині плаценти породіль питання залишалося до теперішнього часу дискусійним. Вважається, що гуморальна ланки імунітету у новонародженого є незрілою. Виявлені CD5+–В1–лімфоцити в основній відпадній оболонці і в стромі ворсин хоріону є підтвердженням існування гуморальної ланка імунітету у плоду і новонародженого. Фактично, це пов’язано з В1–лімфоцитами, які належать до вродженої ланки імунітету.
Застосовуючи лектингістохімічний метод дослідження, вперше описано розподіл всіх В–лімфоцитів в плаценті, які несуть на своїй поверхні рецептори до лектину сої (SBA) і бузини (SNA), а гістологічним методом виявлені поодинокі плазматичні клітини. SBA+– і SNA+–В–лімфоцити, які ідентифікуються, як В–лімфоцити виявляються в крайовій зоні плаценти, ближче до демаркаційної лінії, по якій відбувалося відокремлення плаценти. SBA+–лімфоцити мають малий і середній діаметр. SBA+–лімфоцити, інколи, утворюють скупчення з 2-3 клітин, частіше навколо судин. В зоні, що контактує з плодовими тканинами, вони не виявляються. SBA+– і SNA+–лімфоцити виявляються навколо мезометральних залоз і судин. Топографія SNA+–лімфоцитів співпадає з топографією SBA+–лімфоцитів. Кількість SBA+– і SNA+–лімфоцитів становить 5,03±0,3 і 6,07±1,12 клітин. Від загальної кількості лімфоцитів (36,78±2,05) вони становлять 14 %. У породілей третьої групи (матері не мали резус–фактору) SBA+–лімфоцити складають 10,03±1,09 клітин на умовну одиницю площі. Плазматичні клітини в децидуальній пластинці, з піронінофільною рожевою цитоплазмою, в кількості 3-5 клітин розташовані навколо просвітів судин, що локалізуються біля вільного краю децидуальної оболонки.
У тварин SBA+–лімфоцити зустрічаються лише в спонгіозному шарі децидуальної пластинки матки. SBA+–лімфоцити розташовані поодиноко і мають середній діаметр. На 18-у добу вагітності кількість SBA+–лімфоцитів становить 1,9±0,06 клітин на умовну одиницю площі децидуальної пластинки матки. На 20–у, 22–у добу вагітності та під час пологів кількість SBA+–лімфоцитів поступово зменшується, що корелює з припиненням функціювання мезометральних залоз. У тварин другої експериментальної групи після імунізації самок стафілококковим анатоксином кількість SBA+–лімфоцитів на 18–у і 20–у добу вагітності зростає на 18 % і 23 %, відповідно, порівняно з тваринами інтактної та контрольної груп.
До складу лімфоїдної тканини плаценти входять імунологічно незрілі PNA+–лімфоцити. У породіль з обтяжливими діагнозами, на відміну від груп порівняння, в материнській частині плаценти збільшується кількість імунологічно незрілих PNA+–лімфоцитів (3–4 лімфоцити на умовну одиницю). Аналогічно, у тварин після імунізації вагітних стафілококовим анатоксином або після внутрішньоутробного уведення антигену плодам зростає кількість імунологічно незрілих PNA+–лімфоцитів в децидуальній пластинці матки.
Зростання чисельності імунологічно незрілих PNA+–лімфоцитів в плодовій частині плаценти людей після антигенного впливу на материнський організм, і особливо, при резус–несумісності, підтверджує, що імунна система плоду здатна відповідати посиленням імунної відповіді на дію антигенів. Зростання кількості імунологічно незрілих PNA+–лімфоцитів в стромі ворсин плацент після антигенного впливу на організм вагітної протягом третього періоду вагітності до 7,11±1,12 лімфоцитів, проти групи порівняння – 5,38±0,13 лімфоцитів, вказує на надлишкову міграцію імунологічно незрілих лімфоцитів з тимусу плоду в плаценту, як і в інші органи (Волошин Н.А., Карзов М.В., Григорьева Е.А. и др., 2002). Отримані дані співпадають з даними інших авторів – в крові новонароджених дітей, після внутрішньоутробної інфекції нараховується 25 % незрілих Т–лімфоцитів, тоді як в нормі цей показник становить 10 % (Griffits-Chu S., Patterson J. A., Berger C.L. et al., 1984).
Узагальнюючи отримані факти та встановлені закономірності стосовно будови лімфоїдної тканини, асоційованої з плацентою (placenta associated lymphoid tissue – PALT), пропонуємо уніфіковану схему її будови із урахуванням даних літератури. Розподіл лімфоцитів за лектиновим фенотипом доповнює уявлення про будову лімфоїдної тканини, асоційованої з плацентою (рис. 1 а, б) і підкреслює зв’язок між вродженим і адаптивним імунітетом плаценти.

ВИСНОВКИ
В дисертаційній роботі розв’язана наукова проблема нормальної анатомії щодо закономірності будови плаценти і асоційованої з нею лімфоїдної тканини та показана її реактивність на дію антигенів; визначено роль дендритних клітин в підтримці імунологічної толерантності та доведено тісний зв’язок між морфо–функціональним станом плаценти та вмістом в ній лімфоцитів. Описано вроджену ланку імунітету, яка залежить від лектинопосередкованого розпізнавання.
1.     Лімфоїдна тканина, асоційована з гемохоріальною плацентою, відноситься до лімфоїдної тканини дифузного типу, має подвійне походження (плодове і материнське) і представлена: макрофагами і дендритними клітинами; цитотоксичними HPA+–лімфоцитами, які є домінуючою популяцією; CD8+–лімфоцитами; SBA+– і SNA+–В–лімфоцитами; СD5+–лімфоцитами, та одиничними плазматичними клітинами; імунологічно незрілими PNA+–Т–лімфоцитами. На початку третього періоду вагітності в складі лімфоїдної тканини, асоційованої з плацентою превалює вроджена ланка імунітету, а наприкінці вагітності доповнюється адаптивною.
2.     У породіль з антигенним впливом зростає середня маса плацент і плодів, площа плацент зменшується, порівняно з фізіологічним перебігом вагітності, на тлі зростання загальної кількості лімфоцитів у основній відпадній оболонці (51,34±4,55) і плодовій частині плаценти (23,00±1,11), що вдвічі більше, ніж у нормі.
3.     Товщина плаценти, особливо материнської частини зростає до 37,10±1,30 мм, проти 15,10±1,00 мм; абсолютна площа материнських лакун до 503,51±45,86 мм2, порівняно з контролем, 445,16±52,45 мм2; зменшується площа цито– і синцитіотрофобласту; зростає відносна площа строми ворсин у жінок з резус–несумісною вагітністю на тлі збільшення загальної кількості лімфоцитів до 23,90±0,83 в основній відпадній оболонці і кількості HPA+–лімфоцитів і SBA+–В–лімфоцитів в плодовій частині до 28,92±5,55 і 14,14±1,06, порівняно з групами контролю – 21,79±0,65 і 8,33±1,16, відповідно, та числа СD8+–лімфоцитів до 5,55±0,36 і до 6,44±0,24 в плодовій частині плаценти лімфоцитів, що на 15 %, більше, ніж при фізіологічному перебігу вагітності.
4.     Встановлено надлишковий вміст колагенів I, III, V і VI типів у сполучній тканині строми ворсин, децидуальній пластинці, в структурі фібриноїду і базальних мембран в плаценті породіль, які зазнали антигенного впливу, що сприяє прискореній інволюції плаценти. Вміст колагену ІV типу зменшується при резус–несумісності і супроводжується зростанням площі нашарувань антирезусними комплексами до 182,62±23,56 мкм2, проти групи порівняння 240,76±23,09 мкм2 на фоні зростання кількості СD5+–лімфоцитів до 6,44±0,24 в плодовій частині плаценти, що на 16 % більше, ніж у групі порівняння.
5.     Протягом третього періоду вагітності в плаценті щурів відбуваються зміни від адаптивно–компенсаторних до інволютивних, що проявляється зменшенням маси і зростанням її діаметру; накопиченням фібриноїду до 28,80±9,33 %; звуженням сполучної зони до 0,34±0,02 мм, в якій виявляються активовані дендритні клітини в кількості 4,23±1,90 і цитотоксичні лімфоцити, кількість котрих стає максимальною на час пологів – 7,00±0,36, порівняно з іншими частинами плаценти, що сприяє відміні імунологічної толерантності при вагітності.
6.     Після імунізації вагітних самок щурів стафілококовим анатоксином спостерігається збільшення діаметру плаценти на 16 % на фоні підвищеного в два–три рази вмісту лімфоцитів у плаценті. Зростає кількість нашарувань фібриноїду до 37,67±3,71 %, що позитивно корелює із кількістю цитотоксичних HPA+–лімфоцитів в плодовій частині плаценти (r=0,9). Прискорюється звуження сполучної зони до 0,25±0,02 мм із зменшенням кількості в ній цитотоксичних лімфоцитів на час пологів до 5,29±1,06.
7.     Внутрішньоутробне уведення антигену призводить до: зменшення маси плаценти, зростання її діаметра на тлі потрійного збільшення лімфоцитів плодової частини плаценти, зростання кількості PNA+–лімфоцитів (5,86±0,76), що корелює із кількістю фібриноїдних нашарувань (35,34±3,67 %); прискореного звуження сполучної зони плаценти до 0,24±0,02 мм і значного зростання цитотоксичних лімфоцитів в ній з 20–ї до 22–ї доби вагітності, що закінчується передчасними пологами.
8.     Дендритні клітини знаходяться на межі плодової і материнської частини плаценти. Протягом третього періоду вагітності їх кількість збільшується в чотири рази. Зростає кількість, товщина і довжина відростків; збільшується активність АТФ–ази до 883,27±54,91 од. оп. щіл., що відображає зміни в морфо–функціональному стані дендритних клітин.
9.     Протягом третього періоду вагітності змінюється структура фето–плацентарного бар΄єру: зростає кількість нашаруваниь фібриноїду, з΄являються нашарування, які мають рецептори до лектинів SBA+ і PNA+, споріднених до імунних комплексів і фібронектину. Імунізація вагітних стафілококовим анатоксином призводить до надлишкового відкладання SBA+– і WGA+–нашарувань на межі плодової і материнської частини плаценти, які споріднені до імунних комплексів та тенасцину і анексину V. Після внутрішньоутробного уведення антигену збільшується інтенсивність накопичення композитів фібриноїду в лабіринтній частині плаценти, споріднених до лектинів сої та ікри окуня, який тропний до ламініну.
10.Реактивні зміни лімфоїдної тканини впливають на морфогенез плаценти щурів протягом третього періоду вагітності: реактивність імунної системи плоду супроводжується зменшенням маси плаценти, але зростанням її площі і збільшенням маси плодів. Реактивність лімфоїдної тканини материнської частини плаценти тварин закінчується зростанням діаметру плаценти і зменшенням розмірів плодів.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ЩОДО НАУКОВОГО І ПРАКТИЧНОГО ВИКОРИСТАННЯ ЗДОБУТИХ РЕЗУЛЬТАТІВ
1.     Морфогенез плаценти пов’язано з морфо–функціональним станом лімфоїдної тканини, асоційованої з нею, яка представлена вродженою і адаптивною ланками імунітету.
2.     Вплив антигенів під час вагітності з боку материнського або плідного організмів викликає реактивність лімфоїдної тканини, асоційованої з плацентою, що може бути морфологічним критерієм внутрішньоплідної дії антигенів.
3.     Підтримка імунологічної толерантності при вагітності обумовлена морфо–функціональним станом дендритних клітин, які є загальним елементом вродженої і адаптивної ланок імунітету.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1.                             Волошин М. А. Динаміка кількості лімфоцитів у плаценті в третьому триместрі в нормі і під дією антигенів з боку плода / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Вісник морфології. – 2003. – Т. 8, № 2. – С. 194-195. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
2.                             Волошин М. А. Компенсаторно-пристосувальна реакція плаценти на внутрішньоплідне уведення антигену / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Наук. вісн. Львівської нац. академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. – 2004. – Т. 6 (№1). Ч. 1. – С. 56–59. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
3.                             Кущ О. Г. Вплив лімфоцитів на морфо-функціональний стан плаценти щурів після іммунізації вагітних стафілококковим анатоксином / О. Г. Кущ, М. А. Волошин // Таврич. медико–биол. вестн. – 2004. – Т. 7, № 4. – С. 69–72. (Самостійно проведене дослідження, обробка результатів, написання статті).
4.                             Волошин М. А. Взаємозв’язок між інтенсивністю відкладання фібріноїду в лабіринтному відділі плаценти щурів та вмістом лімфоцитів в компактному шарі децидуальної оболонки матки протягом третього триместру вагітності / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Світ медицини та біології. – 2005. – № 3. – С. 95–99. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
5.                             Кущ О. Г. Лектингістохімічна характеристика лімфоцитів лімфоїдної тканини асоційованої з плацентою / О. Г. Кущ // Вісник морфології. – 2005. – № 11 (2). – С. 238–241.
6.                             Волошин М. А. Особливості розподілу В-лімфоцитів в децидуальній оболонці матки протягом третього періоду вагітності в нормі та після імунізації вагітних стафілококовим анатоксином / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Світ медицини та біології. – 2006. – № 1. – С. 11–13. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
7.                             Кущ О. Г. Динаміка кількості макрофагів в децидуальній тканині матки протягом третього періоду вагітності в нормі та при імунізації вагітних стафілококовим анатоксином / О. Г. Кущ // Вісник проблем біології та медицини. – 2006. – Вип. 2. – С. 232–234.
8.                             Волошин М. А. Динаміка HPA+–цитотоксичних лімфоцитів у матково-плацентарному інтерфейсі протягом третього періоду вагітності / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения : тр. Крымского гос. мед. ун–та им. С. И. Георгиевского. – 2006. – Т. 142, ч. 1. – С. 10–13. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
9.                             Волошин М. А. Лектингістохімічна характеристика фібріноїду / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Вісник морфології. – 2006. – № 12 (1). – С. 49–53. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
10.                        Волошин М. А. Топографія дендритних клітин в плаценті / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Вісник морфології. – 2006. – № 12 (2). – С. 165 – 167. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
11.                        Волошин М. А. Фібріноїд плаценти – фактор неспецифічного імунного захисту материнського і плідного організмів / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Таврический медико-биологический вестн. – 2006. – Т. 9, № 3. Ч. ІІІ. – С. 34–39. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
12.                        Кущ О. Г. Особливості синтезу колагенів в плаценті при фізіологічно перебігаючий вагітності та при пізніх гестозах / О. Г. Кущ // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. – 2006. – № 2 (6). – С. 148–151.
13.                        Волошин М. А. Виявлення В-лімфоцитів у плаценті при резус–ізоімунному конфлікті матері та плоду / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Вісник морфології. – 2007. – № 13 (2). – С. 290–293. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
14.                        Кущ О. Г. Взаємозв’язок між кількістю лімфоцитів компактного і спонгіозного шарів децидуальної оболонки матки протягом третього триместру вагітності в нормі та в експерименті / О. Г. Кущ // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. – 2005. – № 1 (5). – С. 94-96.
15.                        Волошин М. А. Динаміка товщини сполучної зони плаценти щурів і вміст в ній лімфоцитів протягом третього періоду вагітності / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Запорож. мед. журн. – 2005. – № 3. – С. 26–28. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
16.                        Кущ О. Г. Особливості будови і реактивності лімфоїдної тканини, асоційованої з децидуальною тканиною / О. Г. Кущ, М. А. Волошин // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. – 2007. – № 2 (7). – С. 105–107. (Самостійно проведене дослідження, обробка результатів, написання статті).
17.                        Волошин М. А. Морфологія дендритних клітин плаценти щурів протягом третього триместру вагітності / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Журн. АМН України. – 2007. – Т. 13, № 2. – С. 327–336. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
18.                        Волошин М. А. Особливості будови лімфоїдної тканини асоційованої з плацентою у породіль при фізіологічно перебігаючий вагітності та при зміненій імунологічній реактивності материнського та плодового організмів / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Український морфологічний альманах. – 2008. –Т. 6, № 1. – С. 64–67. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).
19.                        Волошин М. А. Розподіл дендритних клітин та лімфоцитів децидуальної тканини матки в третьому періоді вагітності людини / М. А. Волошин, О. Г. Кущ // Науковий вісник Ужгородського ун–ту, серія „Медицина” – 2008. – Вип. 33. – С. 18–21. (Самостійно проведено дослідження, обробка результатів, написання статі).