Реферат на тему Клініко патогенетична характеристика розсіяного склерозу у зоні високого ризику захворювання
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2014-12-30Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ НЕВРОЛОГІЇ,
ПСИХІАТРІЇ ТА НАРКОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ"
ХАВУНКА МАРТА ЯРОСЛАВІВНА
УДК:616.832-004.2-092-036.21
Клініко-патогенетична характеристика розсіяного склерозу у зоні високого ризику захворювання
14.01.15 - нервові хвороби
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2008
ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ НЕВРОЛОГІЇ,
ПСИХІАТРІЇ ТА НАРКОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ"
ХАВУНКА МАРТА ЯРОСЛАВІВНА
УДК:616.832-004.2-092-036.21
Клініко-патогенетична характеристика розсіяного склерозу у зоні високого ризику захворювання
14.01.15 - нервові хвороби
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Негрич Тетяна Іванівна,
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, кафедра неврології, професор кафедри.
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Волошина Наталія Петрівна,
ДУ "Інститут неврології, психіатрії та наркології АМН України",
керівник відділення нейроінфекцій та патології вегетативної
нервової системи;
-доктор медичних наук, професор Соколова Лариса Іванівна,
Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ
України, кафедра нервових хвороб, професор кафедри.
Захист відбудеться "20" лютого 2008 р. о 10 00 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.566.01 при ДУ "Інституту неврології, психіатрії та наркології АМН України" за адресою: 61068, м. Харків, вул. Академіка Павлова, 46.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ДУ "Інституту неврології, психіатрії та наркології АМН України" за адресою: 61068, м. Харків, вул. Академіка Павлова, 46.
Автореферат розісланий "17" січня 2008 р.
Вчений секретар
Спеціалізованої Вченої Ради Дяченко Л.І.
Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Негрич Тетяна Іванівна,
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, кафедра неврології, професор кафедри.
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Волошина Наталія Петрівна,
ДУ "Інститут неврології, психіатрії та наркології АМН України",
керівник відділення нейроінфекцій та патології вегетативної
нервової системи;
-доктор медичних наук, професор Соколова Лариса Іванівна,
Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ
України, кафедра нервових хвороб, професор кафедри.
Захист відбудеться "20" лютого 2008 р. о 10 00 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.566.01 при ДУ "Інституту неврології, психіатрії та наркології АМН України" за адресою: 61068, м. Харків, вул. Академіка Павлова, 46.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ДУ "Інституту неврології, психіатрії та наркології АМН України" за адресою: 61068, м. Харків, вул. Академіка Павлова, 46.
Автореферат розісланий "17" січня 2008 р.
Вчений секретар
Спеціалізованої Вченої Ради Дяченко Л.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Розсіяний склероз (РС) уражає, в основному, людей молодого працездатного віку і на певному етапі свого розвитку неминуче призводить до інвалідності та втрати здатності хворих осіб до пересування й самообслуговування (Волошина Н.П., Левченко І.Л., 2006; Евтушенко С.К., Деревянко И.Н., 2006 Міщенко Т.С., 2006; Соколова Л.І., 1998; Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н., 2003). Кожного року в Україні кількість хворих збільшується на 1000. Найвищі показники поширеності зареєстровано серед інших у Львівській області (Волошин П.В. і співавт., 2005; Міщенко Т.С., 2006). Все це переводить проблему РС у ранг не тільки медичної, але і соціально-економічної (Волошина Н.П., Левченко І.Л., 2006; Соколова Л.І., 1998).
Вивчення етіології РС базується, першою чергою, на аналізі його зовнішніх факторів ризику. За даними досліджень (Гусев Е.И. и соавт., 2004; Западнюк Б.В., 1993; Boiko A.N., 1994; Gronning M. et al., 1993) серед них найбільше значення має екологічна характеристика зони проживання. Проте до теперішнього часу роль ні одного із зовнішніх факторів у розвитку РС не є достовірно доведеною, а дані літератури вкрай суперечливі.
Останнім часом почали з'являтися повідомлення про виявлення авто-антитіл (АТ), здатних каталізувати розщеплення ДНК та білків, які отримали назву каталітично активних АТ або абзимів (Невинский Г.А. и соавт., 2000; Suzuki H., 1994). Незважаючи на те, що роль анти-ДНК-антитіл в ушкодженні тканин не завжди вдається довести, ці антитіла вважаються надійними маркерами ряду захворювань, оскільки часто виявляються ще до перших проявів імунопатологічного процесу (Райт А. и соавт., 2000). Описано важливу роль автореактивних абзимів у патогенезі РС, так як вони можуть руйнувати автоантигени мієліну і впливати на В-клітини (Archelos J.J. et al., 2000; Hemmer B. et al., 2002; O’Connor K.C. et al. 2001). Така подвійна роль автореактивних абзимів передбачає їх участь у формуванні вогнищ демієлінізації, а також вони є ключовими елементами у розвитку процесів ремієлінізації (Archelos J.J. et al., 2000). Водночас, патогенетичне і клінічне значення каталітично активних АТ при різних варіантах клінічного перебігу РС вивчено не достатньо.
Останнє десятиріччя відзначилося різким підвищенням можливостей неврологів у використанні патогенетичного лікування РС, що вперше дозволило певною мірою контролювати активність патологічного процесу при цьому захворюванні (Винничук С.М., 2003; Завалишин И.А., Переседова А.В., 2005). У лікуванні РС препарати, які змінюють перебіг РС, так звані модифікуючі медикаментозні засоби, є препаратами першого вибору, поки методом доказової медицини не доведено переваги інших методів лікування. Одним із таких препаратів є Бетаферон (Shering, Німеччина). Клінічній ефективності цього препарату при РС присвячено велику кількість досліджень, проте питання його впливу на цитотоксичні властивості Ig плазми крові хворих на РС залишається не дослідженим.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі неврології Львівського національного медичного університету (ЛНМУ) імені Данила Галицького згідно з основним планом науково-дослідної роботи кафедри "Актуальні проблеми неврологічної патології (розсіяний склероз, церебро-васкулярні хвороби, епілепсія, хвороби периферійної нервової системи), нові можливості діагностики, лікування профілактики", шифр теми: ІН. 26.00.0001.03, № держреєстрації 0103U002363. Дана робота виконана згідно з Постановою Кабінету Міністрів України від 10.01.2002р. №14 у рамках міжгалузевої комплексної програми “Здоров'я нації”.
Мета дослідження: визначення прогностичних критеріїв тяжкості й перебігу РС залежно від екологічної забрудненості територій проживання цих хворих та розробка нових діагностичних підходів і лікувальної тактики у хворих на РС на підставі комплексного клінічного та імунобіологічного дослідження.
Завдання дослідження:
1. Здійснити клініко-епідеміологічну характеристику обстежених хворих на РС з урахуванням екологічної забрудненості територій їх проживання.
2. Визначити особливості дебюту, ремітуючо-рецидивуючого (РР), первинно (ПП) та вторинно-прогресуючого (ВП) типів перебігу РС залежно від стану забруднення навколишнього середовища.
3. Дослідити вплив імуноглобулінів, виділених із плазми крові хворих на РС, на життєздатність імунокомпетентних клітин.
4. Оцінити діагностичне та прогностичне значення каталітичної активності абзимів плазми крові хворих на РС, зокрема їх здатність руйнувати основний білок мієліну (ОБМ) та ДНК.
5. Оцінити прогностичну роль визначення цитотоксичної активності імуноглобулінів, виділених із плазми крові хворих на РС, в ефективності патогенетичного лікування цього захворювання.
Об’єкт дослідження - патоморфоз клінічного перебігу РС залежно від екологічної забрудненості довкілля та імунобіологічні властивості абзимів, виділених із плазми крові хворих, за умови покращення діагностики та оптимізації лікувальної тактики.
Предмет дослідження - клінічні особливості перебігу РС на територіях з різним станом забрудненості грунтів та цитотоксичні й ензиматичні властивості Ig плазми крові хворих на РС.
Методи дослідження - загальноклінічне обстеження, вивчення скарг і анамнезу хвороби, клініко-неврологічне обстеження в динаміці й оцінка неврологічного дефіциту за шкалою Expended Disability Status Scale (EDSS), магнітно-резонансна томографія (МРТ) головного мозку, імунобіологічне дослідження крові (визначення цитотоксичної активності IgG плазми крові хворих на РС, їх здатності руйнувати ДНК та ОБМ), в тому числі під час лікування Бетафероном, статистична обробка даних в основній та контрольній групах.
Наукова новизна отриманих результатів. На підставі комплексних клінічних та імунобіологічних досліджень визначено послідовність розвитку патогенетичних змін при РС з урахуванням забрудненості грунтів проживання хворих та цитодеструктивних процесів в їх автореактивних Т-клітинах. Оптимізовано підходи до діагностики та лікувальної тактики у хворих на РС.
Визначено детальні клінічні особливості дебюту та всіх основних типів клінічного перебігу РС залежно від забрудненості зони проживання хворих. Вперше показано, що препарати IgG плазми крові хворих на РС володіють зниженою цитотоксичною активністю щодо імунних людських лейкемічних Т-лімфоцитів лінії MT-4, що лежить в основі автоімунних деструктивних змін при цьому захворюванні. Встановлено, що загибель Т-клітин під дією препаратів Ig крові хворих на РС відбувається шляхом апоптозу. Вперше виявлено існування кореляційного зв’язку між низькою цитотоксичною активністю IgG плазми крові хворих на РС та тяжкістю патологічного процесу при цьому захворюванні. Використано нові підходи для обґрунтування високої терапевтичної ефективності Бетаферону. Вперше встановлено, що призначення Бетаферону хворим на РС сприяє ініціації апоптичних процесів в автореактивних Т-лімфоцитах периферійної крові хворих, гальмуючи у такий спосіб автоімунні реакції.
Практичне значення роботи. На підставі комплексного обстеження хворих на РС розширено погляди на ключові ланки патогенезу та лікування цього захворювання. Доведено, що характер цитотоксичного ефекту IgG плазми крові хворих на РС та ензиматичні властивості IgG дозволяють оцінити стан демієлінізуючого процесу у хворих на РС й ефективність проведеного лікування. Обґрунтовано, що програма обстеження хворих на РС повинна включати виявлення ранніх симптомів захворювання, детальний аналіз факторів ризику, розширену оцінку неврологічного статусу пацієнта та розгорнутий аналіз дебюту і кожного з типів перебігу.
Доведено необхідність врахування стану екологічної забрудненості території проживання хворих у визначенні прогнозу РС. Показано доцільність визначення цитотоксичної дії IgG плазми крові хворих на РС та їх здатності руйнувати ОБМ та ДНК, як додаткових критеріїв оцінки тяжкості цього захворювання й ефективності проведеного лікування. Отримані результати дозволяють оптимізувати діагностичну та лікувальну тактику у хворих на РС.
Впровадження результатів роботи у практику. Результати дисертаційної роботи впроваджено у лікувально-діагностичну практику неврологічних відділень Львівської обласної клінічної лікарні (ОКЛ), 5-ї міської клінічної лікарні м. Львова, 1120 центрального військового клінічного госпіталю, Івано-Франківської ОКЛ, 4-ої міської клінічної лікарні м. Київ, 1-ої міської поліклініки м. Дніпропетровська, Ужгородської ОКЛ, міської клінічної лікарні №7 м. Харкова, кафедри нервових хвороб національного медичного університету ім. Пирогова м. Вінниці.
Особистий внесок дисертанта. Дисертація є самостійною працею здобувача. Автор самостійно проаналізувала літературу за темою дисертації, особисто провела клініко-неврологічне обстеження, обробку первинної документації й розподіл хворих на групи, оволоділа методами імунобіологічного дослідження крові та брала участь у їх проведенні. Дисертант проводила лікування обстежених хворих із застосуванням Бетаферону на базі неврологічних відділень ЛОКЛ та 5-ої МКЛ. Статистичну обробку результатів досліджень, їх аналіз та висновки зроблено при безпосередній участі автора. Здобувачем самостійно написані всі розділи дисертації. Формулювання мети і завдань роботи та впровадження результатів дослідження у медичну практику, написання статей за темою роботи здійснено спільно з науковим керівником. Консультативну допомогу та сприяння при виконанні лабораторних досліджень за темою дисертаційної роботи надав член-кореспондент НАН України, д. б. наук, професор Р. С. Стойка.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю кафедри неврології ЛНМУ ім. Данила Галицького: "Проблеми клінічної неврології: історія, сучасність, перспективи" (Львів, 2005); на конференціях Львівського обласного товариства неврологів (2005, 2006), Львівського міського товариства неврологів (2005, 2006), на 5-ій Парнасівській конференції “Молекулярні механізми клітинної сигналізації” (Київ, 2005), 9-му з'їзді Українського біохімічного товариства (Харків, 2006), ІІІ національному конгресі (ХІ з'їзді) неврологів, психіатрів та наркологів України “Профілактика та реабілітація в неврології, психіатрії та наркології” (Харків, 2007).
Публікації. Основні положення дисертації опубліковано у 12-ти наукових працях: 8 статей та 4 тез доповідей на міжнародних та вітчизняних конференціях. Серед статей – 5-ть у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, з них 2 роботи - самостійні. Оформлено 1 інформаційний лист.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 196 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методик обстеження хворих, 4 розділів і 6 підрозділів власних досліджень, висновків, практичних рекомендацій та додатків. Робота ілюстрована 33 таблицями, 20-ма рисунками, 1 схемою і містить 146 сторінок основного тексту. Список літератури складається з 229 літературних джерел (із них 112 кирилицею та 117 латиницею).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. З метою вирішення визначених завдань, у період з 2004 по 2005 рр. неврологічно, інструментально та лабораторно обстежено 216 хворих на РС – жителів м. Львова та Львівської області. Метою І-го етапу досліджень стала клініко-епідеміологічна характеристика РС у межах різних районів м. Львова та області, яка включала порівняльний аналіз клінічних показників цього захворювання на екологічно чистих (ЕЧ) та екологічно забруднених (ЕЗ) територіях (173 хворих на РС і 128 клінічно здорових осіб). Підставою для формування поняття ЕЗ та ЕЧ райони стали дані санітарно-епідеміологічної служби Львівської області, згідно яких забрудненість грунтів Яворівського району, в якому розташований Яворівський державний гірничо-хімічний комбінат “Сірка”, є найвищою по області - 16,2% зразків із перевищенням граничнодопустимих концентрацій, водночас, найменше забрудненим виявився Буський район. У межах м. Львова порівнювали Франківський район, на території якого розташовано танкоремонтний завод, автомобільний завод та інші промислові підприємства, із Сихівським районом, який безпосередньо межує із лісосмугою і не містить жодних великих промислових об’єктів. Особливістю цього розділу виконаних досліджень був метод детального неврологічного огляду кожного хворого з встановленням достовірного діагнозу із використанням спеціально розробленої Інститутом неврології, психіатрії та наркології АМН України анкети-опитувальника.
У 38-ми хворих на РС та 27-ми здорових осіб (ІІ-й етап) досліджували здатність Ig, виділених із їх плазми крові, впливати на імунокомпетентні клітини. У дисертаційній роботі цей розділ представлений на прикладі випадкової вибірки хворих на РС (14 хворих і 6 осіб контрольної групи), оскільки всі закономірності, отримані в загальній групі, виявилися ідентичними, до тих змін, які отримали у цій вибірці.
У 9-ти хворих на РС та 6-ти донорів (ІІІ-й етап) досліджували здатність IgG, виділених із їх плазми крові, до руйнування ОБМ та ДНК.
Вплив лікування Бетафероном на ознаки апоптозу в імунокомпетентних клітинах досліджували у 10-ти хворих на РС та 10-ти здорових осіб (IV-й етап).
Для діагностики РС використовували критерії C. Poser et al. (1983) і Mc. Donald et al. (2005). Діагноз РС ставили на основі уважного виявлення і вивчення скарг, анамнезу захворювання та параклінічних (МРТ) методів обстеження хворих. При необхідності долучали консультації інших спеціалістів та серологічні обстеження крові на токсоплазмоз, бореліоз, герпесвірусну персистенцію, що дозволило виключити інтеркурентну патологію, передусім інфекційні та хронічні захворювання внутрішніх органів.
Виділення фракції імуноглобулінів із плазми венозної крові. Виділення імуноглобулінової фракції з плазми венозної крові проводили за описаною методикою (Фримель Г., 1997). Для дослідження каталітичної активності препаратів IgG використали афінну хроматографію на колонці, наповненій протеїн A – агарозою Fast Flow (Sigma, США). Для перевірки чистоти IgG, препарати піддавали гель-фільтрації на колонці розміром 180 х 5 мм, яка містила сорбент Toyopearl TSK HW-55 (Toyo Soda, Японія). На кінцевій стадії білки фракціонували електрофорезом у 12% ПААГ у присутності 0,1% SDS.
Дослідження цитотоксичної дії Ig. Як об’єкт для дослідження цитотоксичної й проапоптичної дії Ig використали людські лейкемічні Т-лімфоцити ліній Jurkat і MT-4; лейкемічні В-клітини лінії Namalwa (лімфома Беркітта); лейкемічні В-лімфоцити миші (лінія L-1210). Усі лінії клітин були отримані з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (м. Київ, Україна). Клітини культивували у флаконах Карреля у поживному середовищі RPMI-1640 (Sigma, США) із додаванням 10% сироватки крові ембріонів ВРХ (Sigma, США), 50 мкг/мл гентаміцину (Sigma, СШA) до досягнення клітинами субконфлюентного стану. Для перевірки життєздатності клітин через 24 години дії на них препаратів Ig використовували тест із фарбуванням клітин 0,1% водним розчином трипанового синього. Кількість незафарбованих живих та зафарбованих у синій колір (мертвих) клітин підраховували у гемоцитометричній камері (камера Горяєва) під світловим мікроскопом Біолам (ЛОМО, Санкт-Петербург, РФ).
Визначення проапоптичної активності Ig плазми крові хворих на РС проводили за методом G. Zauli (1993), використовуючи електрофорез тотальної ДНК моноядерних клітин периферійної крові (МКПК) хворих на РС. Розподіл фракцій деградованої ДНК визначали, використовуючи програму Gel-Pro 3.1. “Кометний” аналіз ДНК МКПК хворих на РС проводили, як описано у роботі Камінський В.О. та співавт. (2005). Підрахунок кількості комет ДНК проводили під мікроскопом при збільшенні Ч 200-400. У зразку рахували не менше 500 клітин. Комети поділяли на 5 класів залежно від співвідношення ДНК у "голові" та "хвості" комети. Актуальність теми. Розсіяний склероз (РС) уражає, в основному, людей молодого працездатного віку і на певному етапі свого розвитку неминуче призводить до інвалідності та втрати здатності хворих осіб до пересування й самообслуговування (Волошина Н.П., Левченко І.Л., 2006; Евтушенко С.К., Деревянко И.Н., 2006 Міщенко Т.С., 2006; Соколова Л.І., 1998; Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н., 2003). Кожного року в Україні кількість хворих збільшується на 1000. Найвищі показники поширеності зареєстровано серед інших у Львівській області (Волошин П.В. і співавт., 2005; Міщенко Т.С., 2006). Все це переводить проблему РС у ранг не тільки медичної, але і соціально-економічної (Волошина Н.П., Левченко І.Л., 2006; Соколова Л.І., 1998).
Вивчення етіології РС базується, першою чергою, на аналізі його зовнішніх факторів ризику. За даними досліджень (Гусев Е.И. и соавт., 2004; Западнюк Б.В., 1993; Boiko A.N., 1994; Gronning M. et al., 1993) серед них найбільше значення має екологічна характеристика зони проживання. Проте до теперішнього часу роль ні одного із зовнішніх факторів у розвитку РС не є достовірно доведеною, а дані літератури вкрай суперечливі.
Останнім часом почали з'являтися повідомлення про виявлення авто-антитіл (АТ), здатних каталізувати розщеплення ДНК та білків, які отримали назву каталітично активних АТ або абзимів (Невинский Г.А. и соавт., 2000; Suzuki H., 1994). Незважаючи на те, що роль анти-ДНК-антитіл в ушкодженні тканин не завжди вдається довести, ці антитіла вважаються надійними маркерами ряду захворювань, оскільки часто виявляються ще до перших проявів імунопатологічного процесу (Райт А. и соавт., 2000). Описано важливу роль автореактивних абзимів у патогенезі РС, так як вони можуть руйнувати автоантигени мієліну і впливати на В-клітини (Archelos J.J. et al., 2000; Hemmer B. et al., 2002; O’Connor K.C. et al. 2001). Така подвійна роль автореактивних абзимів передбачає їх участь у формуванні вогнищ демієлінізації, а також вони є ключовими елементами у розвитку процесів ремієлінізації (Archelos J.J. et al., 2000). Водночас, патогенетичне і клінічне значення каталітично активних АТ при різних варіантах клінічного перебігу РС вивчено не достатньо.
Останнє десятиріччя відзначилося різким підвищенням можливостей неврологів у використанні патогенетичного лікування РС, що вперше дозволило певною мірою контролювати активність патологічного процесу при цьому захворюванні (Винничук С.М., 2003; Завалишин И.А., Переседова А.В., 2005). У лікуванні РС препарати, які змінюють перебіг РС, так звані модифікуючі медикаментозні засоби, є препаратами першого вибору, поки методом доказової медицини не доведено переваги інших методів лікування. Одним із таких препаратів є Бетаферон (Shering, Німеччина). Клінічній ефективності цього препарату при РС присвячено велику кількість досліджень, проте питання його впливу на цитотоксичні властивості Ig плазми крові хворих на РС залишається не дослідженим.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі неврології Львівського національного медичного університету (ЛНМУ) імені Данила Галицького згідно з основним планом науково-дослідної роботи кафедри "Актуальні проблеми неврологічної патології (розсіяний склероз, церебро-васкулярні хвороби, епілепсія, хвороби периферійної нервової системи), нові можливості діагностики, лікування профілактики", шифр теми: ІН. 26.00.0001.03, № держреєстрації 0103U002363. Дана робота виконана згідно з Постановою Кабінету Міністрів України від 10.01.2002р. №14 у рамках міжгалузевої комплексної програми “Здоров'я нації”.
Мета дослідження: визначення прогностичних критеріїв тяжкості й перебігу РС залежно від екологічної забрудненості територій проживання цих хворих та розробка нових діагностичних підходів і лікувальної тактики у хворих на РС на підставі комплексного клінічного та імунобіологічного дослідження.
Завдання дослідження:
1. Здійснити клініко-епідеміологічну характеристику обстежених хворих на РС з урахуванням екологічної забрудненості територій їх проживання.
2. Визначити особливості дебюту, ремітуючо-рецидивуючого (РР), первинно (ПП) та вторинно-прогресуючого (ВП) типів перебігу РС залежно від стану забруднення навколишнього середовища.
3. Дослідити вплив імуноглобулінів, виділених із плазми крові хворих на РС, на життєздатність імунокомпетентних клітин.
4. Оцінити діагностичне та прогностичне значення каталітичної активності абзимів плазми крові хворих на РС, зокрема їх здатність руйнувати основний білок мієліну (ОБМ) та ДНК.
5. Оцінити прогностичну роль визначення цитотоксичної активності імуноглобулінів, виділених із плазми крові хворих на РС, в ефективності патогенетичного лікування цього захворювання.
Об’єкт дослідження - патоморфоз клінічного перебігу РС залежно від екологічної забрудненості довкілля та імунобіологічні властивості абзимів, виділених із плазми крові хворих, за умови покращення діагностики та оптимізації лікувальної тактики.
Предмет дослідження - клінічні особливості перебігу РС на територіях з різним станом забрудненості грунтів та цитотоксичні й ензиматичні властивості Ig плазми крові хворих на РС.
Методи дослідження - загальноклінічне обстеження, вивчення скарг і анамнезу хвороби, клініко-неврологічне обстеження в динаміці й оцінка неврологічного дефіциту за шкалою Expended Disability Status Scale (EDSS), магнітно-резонансна томографія (МРТ) головного мозку, імунобіологічне дослідження крові (визначення цитотоксичної активності IgG плазми крові хворих на РС, їх здатності руйнувати ДНК та ОБМ), в тому числі під час лікування Бетафероном, статистична обробка даних в основній та контрольній групах.
Наукова новизна отриманих результатів. На підставі комплексних клінічних та імунобіологічних досліджень визначено послідовність розвитку патогенетичних змін при РС з урахуванням забрудненості грунтів проживання хворих та цитодеструктивних процесів в їх автореактивних Т-клітинах. Оптимізовано підходи до діагностики та лікувальної тактики у хворих на РС.
Визначено детальні клінічні особливості дебюту та всіх основних типів клінічного перебігу РС залежно від забрудненості зони проживання хворих. Вперше показано, що препарати IgG плазми крові хворих на РС володіють зниженою цитотоксичною активністю щодо імунних людських лейкемічних Т-лімфоцитів лінії MT-4, що лежить в основі автоімунних деструктивних змін при цьому захворюванні. Встановлено, що загибель Т-клітин під дією препаратів Ig крові хворих на РС відбувається шляхом апоптозу. Вперше виявлено існування кореляційного зв’язку між низькою цитотоксичною активністю IgG плазми крові хворих на РС та тяжкістю патологічного процесу при цьому захворюванні. Використано нові підходи для обґрунтування високої терапевтичної ефективності Бетаферону. Вперше встановлено, що призначення Бетаферону хворим на РС сприяє ініціації апоптичних процесів в автореактивних Т-лімфоцитах периферійної крові хворих, гальмуючи у такий спосіб автоімунні реакції.
Практичне значення роботи. На підставі комплексного обстеження хворих на РС розширено погляди на ключові ланки патогенезу та лікування цього захворювання. Доведено, що характер цитотоксичного ефекту IgG плазми крові хворих на РС та ензиматичні властивості IgG дозволяють оцінити стан демієлінізуючого процесу у хворих на РС й ефективність проведеного лікування. Обґрунтовано, що програма обстеження хворих на РС повинна включати виявлення ранніх симптомів захворювання, детальний аналіз факторів ризику, розширену оцінку неврологічного статусу пацієнта та розгорнутий аналіз дебюту і кожного з типів перебігу.
Доведено необхідність врахування стану екологічної забрудненості території проживання хворих у визначенні прогнозу РС. Показано доцільність визначення цитотоксичної дії IgG плазми крові хворих на РС та їх здатності руйнувати ОБМ та ДНК, як додаткових критеріїв оцінки тяжкості цього захворювання й ефективності проведеного лікування. Отримані результати дозволяють оптимізувати діагностичну та лікувальну тактику у хворих на РС.
Впровадження результатів роботи у практику. Результати дисертаційної роботи впроваджено у лікувально-діагностичну практику неврологічних відділень Львівської обласної клінічної лікарні (ОКЛ), 5-ї міської клінічної лікарні м. Львова, 1120 центрального військового клінічного госпіталю, Івано-Франківської ОКЛ, 4-ої міської клінічної лікарні м. Київ, 1-ої міської поліклініки м. Дніпропетровська, Ужгородської ОКЛ, міської клінічної лікарні №7 м. Харкова, кафедри нервових хвороб національного медичного університету ім. Пирогова м. Вінниці.
Особистий внесок дисертанта. Дисертація є самостійною працею здобувача. Автор самостійно проаналізувала літературу за темою дисертації, особисто провела клініко-неврологічне обстеження, обробку первинної документації й розподіл хворих на групи, оволоділа методами імунобіологічного дослідження крові та брала участь у їх проведенні. Дисертант проводила лікування обстежених хворих із застосуванням Бетаферону на базі неврологічних відділень ЛОКЛ та 5-ої МКЛ. Статистичну обробку результатів досліджень, їх аналіз та висновки зроблено при безпосередній участі автора. Здобувачем самостійно написані всі розділи дисертації. Формулювання мети і завдань роботи та впровадження результатів дослідження у медичну практику, написання статей за темою роботи здійснено спільно з науковим керівником. Консультативну допомогу та сприяння при виконанні лабораторних досліджень за темою дисертаційної роботи надав член-кореспондент НАН України, д. б. наук, професор Р. С. Стойка.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю кафедри неврології ЛНМУ ім. Данила Галицького: "Проблеми клінічної неврології: історія, сучасність, перспективи" (Львів, 2005); на конференціях Львівського обласного товариства неврологів (2005, 2006), Львівського міського товариства неврологів (2005, 2006), на 5-ій Парнасівській конференції “Молекулярні механізми клітинної сигналізації” (Київ, 2005), 9-му з'їзді Українського біохімічного товариства (Харків, 2006), ІІІ національному конгресі (ХІ з'їзді) неврологів, психіатрів та наркологів України “Профілактика та реабілітація в неврології, психіатрії та наркології” (Харків, 2007).
Публікації. Основні положення дисертації опубліковано у 12-ти наукових працях: 8 статей та 4 тез доповідей на міжнародних та вітчизняних конференціях. Серед статей – 5-ть у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, з них 2 роботи - самостійні. Оформлено 1 інформаційний лист.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 196 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методик обстеження хворих, 4 розділів і 6 підрозділів власних досліджень, висновків, практичних рекомендацій та додатків. Робота ілюстрована 33 таблицями, 20-ма рисунками, 1 схемою і містить 146 сторінок основного тексту. Список літератури складається з 229 літературних джерел (із них 112 кирилицею та 117 латиницею).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. З метою вирішення визначених завдань, у період з 2004 по 2005 рр. неврологічно, інструментально та лабораторно обстежено 216 хворих на РС – жителів м. Львова та Львівської області. Метою І-го етапу досліджень стала клініко-епідеміологічна характеристика РС у межах різних районів м. Львова та області, яка включала порівняльний аналіз клінічних показників цього захворювання на екологічно чистих (ЕЧ) та екологічно забруднених (ЕЗ) територіях (173 хворих на РС і 128 клінічно здорових осіб). Підставою для формування поняття ЕЗ та ЕЧ райони стали дані санітарно-епідеміологічної служби Львівської області, згідно яких забрудненість грунтів Яворівського району, в якому розташований Яворівський державний гірничо-хімічний комбінат “Сірка”, є найвищою по області - 16,2% зразків із перевищенням граничнодопустимих концентрацій, водночас, найменше забрудненим виявився Буський район. У межах м. Львова порівнювали Франківський район, на території якого розташовано танкоремонтний завод, автомобільний завод та інші промислові підприємства, із Сихівським районом, який безпосередньо межує із лісосмугою і не містить жодних великих промислових об’єктів. Особливістю цього розділу виконаних досліджень був метод детального неврологічного огляду кожного хворого з встановленням достовірного діагнозу із використанням спеціально розробленої Інститутом неврології, психіатрії та наркології АМН України анкети-опитувальника.
У 38-ми хворих на РС та 27-ми здорових осіб (ІІ-й етап) досліджували здатність Ig, виділених із їх плазми крові, впливати на імунокомпетентні клітини. У дисертаційній роботі цей розділ представлений на прикладі випадкової вибірки хворих на РС (14 хворих і 6 осіб контрольної групи), оскільки всі закономірності, отримані в загальній групі, виявилися ідентичними, до тих змін, які отримали у цій вибірці.
У 9-ти хворих на РС та 6-ти донорів (ІІІ-й етап) досліджували здатність IgG, виділених із їх плазми крові, до руйнування ОБМ та ДНК.
Вплив лікування Бетафероном на ознаки апоптозу в імунокомпетентних клітинах досліджували у 10-ти хворих на РС та 10-ти здорових осіб (IV-й етап).
Для діагностики РС використовували критерії C. Poser et al. (1983) і Mc. Donald et al. (2005). Діагноз РС ставили на основі уважного виявлення і вивчення скарг, анамнезу захворювання та параклінічних (МРТ) методів обстеження хворих. При необхідності долучали консультації інших спеціалістів та серологічні обстеження крові на токсоплазмоз, бореліоз, герпесвірусну персистенцію, що дозволило виключити інтеркурентну патологію, передусім інфекційні та хронічні захворювання внутрішніх органів.
Виділення фракції імуноглобулінів із плазми венозної крові. Виділення імуноглобулінової фракції з плазми венозної крові проводили за описаною методикою (Фримель Г., 1997). Для дослідження каталітичної активності препаратів IgG використали афінну хроматографію на колонці, наповненій протеїн A – агарозою Fast Flow (Sigma, США). Для перевірки чистоти IgG, препарати піддавали гель-фільтрації на колонці розміром 180 х 5 мм, яка містила сорбент Toyopearl TSK HW-55 (Toyo Soda, Японія). На кінцевій стадії білки фракціонували електрофорезом у 12% ПААГ у присутності 0,1% SDS.
Дослідження цитотоксичної дії Ig. Як об’єкт для дослідження цитотоксичної й проапоптичної дії Ig використали людські лейкемічні Т-лімфоцити ліній Jurkat і MT-4; лейкемічні В-клітини лінії Namalwa (лімфома Беркітта); лейкемічні В-лімфоцити миші (лінія L-1210). Усі лінії клітин були отримані з колекції Інституту експериментальної патології, онкології та радіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (м. Київ, Україна). Клітини культивували у флаконах Карреля у поживному середовищі RPMI-1640 (Sigma, США) із додаванням 10% сироватки крові ембріонів ВРХ (Sigma, США), 50 мкг/мл гентаміцину (Sigma, СШA) до досягнення клітинами субконфлюентного стану. Для перевірки життєздатності клітин через 24 години дії на них препаратів Ig використовували тест із фарбуванням клітин 0,1% водним розчином трипанового синього. Кількість незафарбованих живих та зафарбованих у синій колір (мертвих) клітин підраховували у гемоцитометричній камері (камера Горяєва) під світловим мікроскопом Біолам (ЛОМО, Санкт-Петербург, РФ).
Дослідження каталітичної дії Ig плазми крові.
1. Гідроліз ОБМ. IgG досліджували, як описано у роботі Latry V. at al. (2003).
2. Визначення зв’язування ОБМ імуноглобулінами плазми крові за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). ІФА здійснювали, як описано в Vojdani A. et al. (2003).
3. Активність IgG щодо гідролізу ДНК. ДНК-азну активність IgG визначали, як описано (Gabibov A.G. et al., 2000).
Статистична обробка отриманих результатів. Статистичне опрацювання результатів з визначення цитотоксичної дії препаратів Ig здійснювали за допомогою програми OriginPro 7.0, вираховуючи t-критерії Стьюдента. Достовірними вважали зміни показників за умови Р<0,05.
Результати власних досліджень та їх обговорення. Згідно з результатами проведених нами досліджень (1-й етап), серед 173-х обстежених хворих переважали жінки над чоловіками (1,33:1), що підтверджує участь гормональної дисфункції в патогенезі РС. Показали деякі відмінності у порівнянні з даними літератури щодо вищої частоти захворювання в осіб віком 40 - 49 років (43,93%). Кількість хворих віком понад 50 років також виявилася вагомою (29,48%). Ймовірно, така перевага (73,41%) хворих старших 40 років й обумовлює злоякісність перебігу РС у західному регіоні України, зокрема у Львівській області. Найбільша кількість хворих мала тривалість захворювання понад 10-ть років (57,79%) і від 6-ти до 10-ти років (26,59%). Виявили статистично вірогідну більшу кількість хворих із тривалістю захворювання від 1-го до 5-ти років та від 6-ти до 10-ти років у ЕЗ порівняно з ЕЧ районами Львівської області. Кількість обстежених хворих із церебро-спінальною клінічною формою була найбільша порівняно із церебральною та спінальною (54,91% проти 28,9% та 16,18% відповідно) з перевагою у ЕЗ районах. Серед оглянутих хворих на РС переважали пацієнти із РР і ВП типами перебігу патологічного процесу (по 39,3% у кожній підгрупі). 20,8% пацієнтів перебували на етапі первинного прогресування, що є значно вищим відсотком порівняно з даними літератури (10-15%) (Вінничук С.М. та співавт., 2000; Завалишин И.А. и соавт., 2002; Соколова Л.І., 1998; Montablan X., Rio J., 2001; Runmarket B., Andersen O., 1993), і може пояснити агресивність перебігу РС у нашому регіоні. Водночас, кількість хворих на стадії вторинного прогресування виявилася вагомішою в ЕЗ порівняно з ЕЧ районами. Найбільшу кількість хворих на РС було виявлено із середньої тяжкості (42,19%) та тяжкими (50,87%) проявами патологічного процесу, з перевагою останніх у ЕЗ районах області.
Таким чином, статистично достовірну перевагу хворих із церебро-спінальною формою, тяжким ступенем інвалідизації (6-9,5 балів за шкалою Куртцке), а також у стадії вторинного прогресування патологічного процесу було зафіксовано в ЕЗ порівняно із ЕЧ районами Львівської області. Зроблено висновок про відсутність клінічних відмінностей у перебігу РС серед жителів одного навіть великого міста. Отримані еколого-епідеміологічні асоціації при оцінці клінічного перебігу РС і ступеня забрудненості грунтів, на яких проживають обстежені пацієнти, співпадають з даними інших авторів (Lauer K., 1995; Lauer K., 1989). При наявності генетичної схильності (Завалішин І.А. і співавт., 2002) цей та інші екзо- і/або ендогенні фактори ризику можуть впливати не тільки на ризик розвитку РС, але й на особливості клінічних виявів захворювання в подальшому.
При аналізі клінічних виявів РС у дебюті цього захворювання встановлено, що 78,61% серед оглянутих хворих – постійні мешканці нашого регіону, 89,02% із середніх та вищих соціальних верств, 89,01% мають середню спеціальну і вищу освіту, що узгоджується з даними літератури (Гусев Е. И. и соавт., 2004). Підтвердили факт збереження повних сімей при наявності хворого на РС одного із її членів (69,36%), а при аналізі умов соціально-побутового статусу та анамнезу захворювання у обстежених виявили професійні шкідливості (інсоляція, переохолодження, контакт з барвниками, розчинниками) у 45,66% осіб, перенесені інфекційні хвороби у 26,01%, шкідливі звички (вживання алкоголю, паління) у 24,85% та часті стресові ситуації – у 15,03% випадків. Водночас, частка осіб, які не змогли вказати на будь-який причинний фактор, також виявилася досить вагомою (31,21%).
На думку багатьох авторів (Бойко А.Н. и соавт., 2003; Длмина Т.Л. и соавт., 2006) клінічні особливості дебюту РС можуть вказати, як це захворювання буде себе вести в подальшому, що й було підтверджено власними дослідженнями. Так, незважаючи на перевагу моносиндромного дебюту РС у Львівській області (у 43,93% обстежених хворих) проти полі- і олігосиндромного, він володів наступними прогностично несприятливими ознаками: у 82,08% хворих був середньої тяжкості або тяжким, у 54,91% характеризувався гострим (до 7-ми днів) або інсультоподібним (години) початком, у 94,21% обстежених був тривалим (1 місяць і більше) або середньої тривалості (3 - 4 тижні), а у 94,79% - сповільнений (1місяць і більше) або поступовий (3 - 4 тижні) вихід з нього. Причому, в ЕЗ районах була статистично вірогідна перевага хворих на РС із тяжким, тривалим дебютом, інсультоподібним темпом входження і сповільненим виходом з нього.
Розглянувши особливості клінічного перебігу РР РС в ЕЧ та ЕЗ районах Львівської області, виявили статистично вірогідне превалювання хворих із рецидивами середньої тяжкості (23,12%) і різної тяжкості (9,25%) при мінімальній кількості пацієнтів із легкими рецидивами (2,31%); з поступовим (1 – 4 тижні) і сповільненим (більше 4 тижнів) темпами виходу з рецидиву; з одномоментною появою симптомів та синдромів при входженні у рецидив у жителів ЕЗ (10,4%) порівняно з ЕЧ (2,3%). Водночас, зафіксовано найбільшу кількість пацієнтів із короткотривалими (до 1 місяця) рецидивами (15,6%). Стосовно особливостей перебігу ВП РС було достовірно встановлено, що цей тип перебігу розвивався одразу після фази ремісії, яка йшла слідом за дебютом захворювання, без етапу попереднього рецидивування. Причому, стан прогресування у більшості обстежених був дуже коротким (від 1-го до 5-ти років). Отже, два типи перебігу РС (РР та ВП) у Львівській області мають низку негативних рис, які, не виключено, можуть бути обумовленими несприятливими екологічними факторами.
Первинне прогресування патологічного процесу в обстежених хворих виникало одразу після дебюту, часто минаючи етап стабілізації, з дуже короткими термінами первинного прогресування та поступово-прогресуючим варіантом перебігу (Р<0,05). Всі наведені характеристики цього типу перебігу РС, очевидно, і визначають його злоякісність у Львівській області.
Подальші наші дослідження ставили за мету прояснити значення механізмів реалізації патологічного впливу зовнішніх факторів ризику при цьому мультифакторному захворюванні. На сучасному етапі дослідження патогенезу РС здійснюється із загальнобіологічних позицій (Вершигора А.Ю. та співавт., 2005; Волошин П.В. и соавт., 2004; Hemmer B. et al., 2002; Latry V.J. et al., 2003). Характерною ознакою автоімунних захворювань є наявність у крові хворих антитіл (АТ) до власних антигенів. Оскільки ДНК-гідролізуючі абзими володіють високою цитотоксичною активністю, їхня присутність у крові хворих на РС може порушувати баланс лімфоїдних клітин в організмі. Визначення рівня абзимів у плазмі крові хворих на РС, є одним із важливих сучасних напрямків дослідження цієї патології (Polosukhina D.I. et al., 2004). Аналіз раніше опублікованих даних (Kozyr A.V. et al., 1988) свідчить про принципову важливість вибору високочутливого методу визначення АТ у хворих на РС та необхідність порівняння рівня цих АТ у хворих із різних популяцій. Тому на ІІ-му етапі власних досліджень визначали вплив фракцій Ig, виділених із плазми крові обстежених на ріст in vitro лейкемічних В- і Т-лімфоцитів людини і миші. Ig окремих хворих на РС було також перевірено на здатність індукувати апоптоз Т-клітин.
Встановили, що препарати Іg, виділених із плазми венозної крові клінічно здорових людей, володіли цитотоксичною активністю щодо Т-лімфоцитів. Препарати Ig плазми крові хворих на РС характеризувалися нижчою цитотоксичною активністю щодо Т-клітин (лінія МТ-4), а деякі з них навіть слабо стимулювали їх ріст у порівнянні з Ig клінічно здорових донорів. Таких відмінностей у дії цих Ig щодо В-клітин нами виявлено не було. Зниження рівня цитотоксичної дії препаратів Ig щодо Т-клітин може сприяти зростанню кількості та стійкості активованих автореактивних Т-клітин при РС і, як наслідок, посиленню процесів автоімунної деструкції, що мають місце при цьому захворюванні.
Цитотоксична активність досліджуваних препаратів Ig щодо Т-клітин (лінія МТ-4) знижувалася у послідовності контроль > легкий ступінь тяжкості РС > тяжкий ступінь РС. Нами було відзначено статистично вірогідну різницю при дії на ці клітини Ig плазми крові хворих із тяжким та легким ступенями вияву цієї хвороби порівняно з контрольною групою (рис. 1).
SHAPE \* MERGEFORMAT
| В-клітини |
| Виживання автореактивних Т-клітин (автоімунний стан) |
| Зростання продукції каталітично активних Ig (абзимів) |
| Взаємодія автореактивних Т-клітин з нейроглією та нейронами |
| Біодеструкція ОБМ олігодендроцитів |
| Деградація ядерної ДНК |
| Продукти деградації (апоптоз, некроз) цих клітин |
| Апоптоз |
| Апоптоз |
| Запальний процес |
| Патогенетичні чинники: 1. – генетична схильність 2. – вірусна інфекція 3. – інші екзо- та ендогенні чинники в тому числі екологічне забруднення навколишнього середовища |
| Нейродегенеративні процеси, що призводять до неврологічного дефіциту |
| Т-клітини |
| Зниження цитотоксичної активності |
Рис.1. Вплив Ig плазми крові донорів (К) та хворих із легким (Л) і тяжким (Т) проявами РС на ріст і виживання Т-лімфоцитів лінії МТ-4 in vitro
*- статистично вірогідна відмінність Р<0,05 порівняно з контрольною групою
** - статистично вірогідна відмінність Р<0,01 порівняно з контрольною групою
Виявили кореляцію між низькою цитотоксичною активністю Ig, виділених із плазми крові хворих на РС, на Т-лімфоцити і дуже тяжким прогредієнтним перебігом захворювання у всіх випадках із появою вираженого неврологічного дефіциту. Таким чином, показник цитотоксичної активності Ig плазми крові хворих на РС є однією із важливих складових у патогенезі цього захворювання і може слугувати додатковим діагностичним тестом тяжкості патологічного процесу. Відомо, що цитотоксичний ефект різних речовин може реалізуватися шляхом апоптозу клітин-мішеней, який супроводжується деградацією клітинної ДНК. Для того, щоб виявити, чи відбувається цей процес під час загибелі клітин під дією досліджуваних нами препаратів Ig, було використано електрофорез ядерної ДНК клітин у гелі агарози. Препарати Ig із цитотоксичною активністю викликали руйнування ДНК до низькомолекулярних фрагментів, здатних виходити за межі ядра клітини. Під час електрофорезу таких клітин спостерігалося утворення, так званих, “комет” ДНК, що характерно для апоптичних клітин. Це вказує на достатньо високий рівень апоптичної деградації ДНК Т-клітин лінії МТ-4 у проведеному нами дослідженні.
Нещодавно у плазмі крові хворих на РС були виявлені абзими, здатні гідролізувати ДНК (Барановський А.Г. и соавт., 1998) та ОБМ (Polosukhina D.I. et al., 2005). Оскільки гідроліз ОБМ є причиною демієлінізації аксонів, існують підстави припускати, що у цьому процесі задіяні абзими, які гідролізують ОБМ. Крім того, ми встановили, що абзими, які гідролізують ДНК, також володіють цитотоксичною дією щодо клітин різних типів (Kozyr A.V. et al., 1988). Це дало нам підстави припустити, що абзими, наявні в організмі хворих на РС, здатні руйнувати ДНК і ОБМ і тому можуть діяти як патогенні чинники. У ІІІ-му розділі власних досліджень ми порівняли здатність Ig, виділених із плазми крові хворих на РС, гідролізувати ДНК і ОБМ, а також обговорили потенційну роль цієї активності абзимів, як патогенетичного чинника та діагностичного маркера при РС. Виділені нами препарати IgG були протестовані за допомогою ІФА на наявність у їх складі автоантитіл, здатних взаємодіяти з ОБМ. В усіх отриманих нами препаратах IgG у хворих на РС містилися автоантитіла, які взаємодіяли із ОБМ. Ці результати дають підстави припустити, що саме ці антитіла є абзимами, здатними гідролізувати ОБМ. Дослідження каталітичних властивостей IgG продовжили у наступній серії експериментів. Для цього використали комерційний препарат ОБМ бика, в якому ОБМ є домінуючим за вмістом білком з мол. масою 21 кДА. Протеазну активність препаратів IgG оцінювали за результатами електрофорезу, який дозволив виявити руйнування білка 21 кДа, який є ОБМ, та показав накопичення низькомолекулярних продуктів його гідролізу. Встановили, що два препарати IgG із 9-ти досліджених суттєво знижували вміст білка 21 кДа на електрофореграмі, що передбачає їх властивість гідролізувати цей білок. Причому, виявили клініко-імунобіологічну кореляцію між здатністю Ig плазми крові хворих на РС викликати гідроліз ОБМ та клінічними особливостями перебігу цього захворювання (дебют, пізній початок розвитку хвороби, спінальна клінічна форма та досить тривалий перебіг РС, ПП тип перебігу, тяжкий ступінь прояву неврологічного дефіциту). Це дозволило нам припустити, що дослідження ензиматичної активності Ig щодо ОБМ можна використовувати, як діагностичний та прогностичний маркер при цьому захворюванні. Отже, IgG, очищені із плазми крові хворих на РС, володіють здатністю руйнувати ОБМ. Водночас, препарати IgG хворих на РС суттєво різняться між собою за рівнем їх активності щодо гідролізу ОБМ. Найбільш ймовірно, ензиматичні активності Ig значною мірою залежать від індивідуальних клінічних характеристик РС, зокрема його довготривалості, типу перебігу, ступеня тяжкості та стадії патологічного процесу.
Найчастіше ДНК-азну активність абзимів визначають за їх властивістю гідролізувати ДНК плазміди (Король В.Н. и соавт., 2001; Buneva V.N. et al., 1994). Це пов’язано з тим, що продукти гідролізу невеликої за розміром плазмідної ДНК досить легко детектувати за допомогою електрофорезу в гелі 1% агарози. Виявили, що у плазмі крові окремих хворих на РС одночасно присутні абзими (IgG), які володіють здатністю не лише гідролізувати ОБМ, але й ДНК. У зв’язку з тим, що IgG лише одного із 9-ти обстежених нами хворих на РС мав таку подвійну каталітичну активність, можна було припустити, що індукція таких абзимів при захворюванні на РС не є масовим явищем, проте вона, певним чином, корелює із клінічними проявами цього захворювання.
Метою досліджень, результати яких наведені у останньому розділі роботи, було вивчити вплив лікування Бетафероном на цитотоксичну дію Ig, отриманих із плазми крові хворих на РС, яким вводили Бетаферон впродовж 9 місяців. Для оцінки цитотоксичної дії Ig визначали: 1) кількість живих і мертвих людських лейкемічних Т-лімфоцитів лінії Jurkat за тестом із використанням барвника трипанового синього; 2) апоптичну фрагментацію ДНК цих клітин за умов дії на них препаратів Ig, виділених нами із плазми крові хворих на РС. Аналіз усереднених даних, отриманих нами щодо залежності цитотоксичної проапоптичної активності препаратів Ig із плазми крові хворих на РС від тяжкості цієї патології засвідчив зниження такої активності із зростанням тяжкості захворювання у 3-х із 10-ти обстежених хворих. Водночас, результати дослідження динаміки проапоптичної дії препаратів Ig протягом 3-х і 6-ти та 9-ти місячних курсів лікування хворих свідчать про неоднозначний характер змін проапоптичної активності препаратів Ig плазми крові окремих хворих на РС із різним ступенем прояву захворювання, а також до і після лікування цих хворих Бетафероном. Хворі на РС із відносно високою цитотоксичною активністю Ig плазми крові не реагують подальшим зростанням такої активності у відповідь на лікування Бетафероном. Результати такого спостереження корелюють із клінічними показниками стану цих хворих під час їх лікування Бетафероном. Лікування Бетафероном сприяє посиленню апоптозу активованих автореактивних Т-клітин. Ця дія є найбільше вираженою при РР перебігу РС у хворих із повними ремісіями, незважаючи на тяжкість загострень у цих хворих. Клінічні загострення РС корелюють із процесами апоптозу ДНК автореактивних Т-клітин, які ми опосередковано спостерігали, вивчаючи цитотоксичну активність Ig, плазми крові щодо різних Т- і В-клітинних ліній. Виявили зростання цитотоксичної активності Ig залежно від тривалості лікування хворих. Показали, що зменшення кількості загострень у хворих, повний вихід з них, незважаючи на значну вираженість цих загострень, а також зменшення ступеня тяжкості РС за шкалою рухових розладів EDSS, відповідають зростанню цитотоксичної активності Ig плазми крові хворих, їх здатності індукувати апоптоз автореактивних Т-клітин шляхом фрагментації ДНК останніх. Тому визначення цитотоксичної активності Ig, виділених із плазми крові хворих на РС, можна використовувати, як важливий діагностичний критерій тяжкості і перебігу РС, а також з метою прогностичної оцінки ефективності його лікування.
Базуючись на результатах проведених нами досліджень та аналізі даних літератури, ми запропонували узагальнену схему патогенетичних змін, які мають місце при РС. Наведена схема дозволяє по-новому підійти до розробки альтернативних підходів у лікуванні цього важкого захворювання.
Схематичне представлення механізмів біодеструктивних процесів, що відбуваються під час захворювання на розсіяний склероз
ref SHAPE \* MERGEFORMAT ВИСНОВКИ
У дисертації здійснено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукового завдання, яке полягає в удосконаленні діагностичних підходів та лікувальної тактики у хворих на розсіяний склероз на підставі комплексного клінічного та імунобіологічного дослідження, а також визначено прогностичні критерії перебігу цього захворювання залежно від екологічної забрудненості територій проживання хворих.
1. Встановлено, що серед зовнішніх факторів ризику розвитку РС важливе значення мають екологічні характеристики зони проживання хворих. Виявлено, статистично вірогідну перевагу таких несприятливих клінічних характеристик РС, як церебро-спінальна форма (Р<0,05), вторинно-прогресуючий тип перебігу (Р<0,01), тяжкий ступінь прояву патологічного процесу (Р<0,05) у хворих, які проживають на забруднених грунтах порівняно із чистими.
2. Забрудненість грунтів, відіграє хоча і не провідну, але вагому роль у появі перших симптомів РС, викликаючи їх тривалий (у 63,0% хворих) і тяжкий (у 64,16% хворих) перебіг, інсультоподібний темп входження у дебют цього захворювання (18,5%) поряд із сповільненим виходом з нього (61,27%). При РР РС має місце статистично вірогідна перевага пацієнтів із рецидивами середньої тяжкості (23,12%) при мінімальній кількості пацієнтів із їх легкими проявами (2,31%); з поступовим (14,45%) або сповільненим (18,49%) темпами виходу з рецидивів; з одномоментною появою симптомів та синдромів при входженні в рецидив у жителів екологічно забруднених (10,4%) порівняно з жителями екологічно чистих (2,3%) районів Львівської області. Не виявлено суттєвих відмінностей між клінічним перебігом вторинно-прогресуючого і первинно-прогресуючого РС залежно від екологічної ситуації, зокрема, забруднення грунтів у межах Львівської області, що вказує на існування інших екзо- і/або ендогенних факторів ризику розвитку РС при наявності генетичної схильності до цього захворювання. Водночас, ці два типи перебігу РС у межах нашої області носять низку несприятливих клінічних особливостей, які і визначають злоякісність його перебігу у західному регіоні України.
3. Препарати IgG плазми крові хворих на РС володіють нижчою цитотоксичною активністю щодо Т-клітин (лінія МТ-4), а деякі з них навіть стимулюють ріст цих клітин, у порівнянні з IgG клінічно здорових донорів. Загибель Т-клітин під дією препаратів IgG відбувається шляхом апоптозу. Отримані дані вказують на підвищену стійкість до апоптозу автореактивних Т-клітин при РС, що корелює із посиленням автоімунного процесу при цьому захворюванні. Виявлено кореляцію між низькою цитотоксичною активністю абзимів виділених із плазми крові хворих на РС щодо Т-лімфоцитів і ступенем тяжкості цього захворювання.
4. IgG, очищені із плазми крові хворих на РС, володіють здатністю руйнувати ОБМ, хоча в окремих хворих рівні цієї активності суттєво відрізняються. Ензиматичні властивості імуноглобулінів значною мірою залежать від індивідуальних клінічних характеристик РС, зокрема, його довготривалості, типу перебігу, ступеня тяжкості та стадії патологічного процесу. У плазмі крові окремих хворих на РС присутні абзими, здатні гідролізувати не лише ОБМ, але й ДНК, хоча поява таких абзимів при захворюванні на РС не є масовим явищем.
5. Препарат імуномодулюючої дії Бетаферон сприяє ініціації апоптичних процесів в автореактивних Т-лімфоцитах значної частини хворих на РС, гальмуючи, таким чином, автоімунні реакції, характерні для цього захворювання. Показано, що зменшення кількості загострень у хворих на РС, повний вихід із них, зменшення тяжкості РС в процесі такого лікування корелює із зростанням цитотоксичної активності IgG плазми крові хворих на РС та їх здатністю індукувати апоптоз автореактивних Т-клітин.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1. При визначенні прогнозу РС необхідно враховувати стан екологічної забрудненості територій проживання хворих. З прогностичною метою рекомендовано ретельне вивчення анамнезу хвороби та клінічних особливостей різних типів його перебігу за допомогою спеціально розробленої Інститутом неврології, психіатрії та наркології АМН України анкети-опитувальника.
2. Для діагностики ступеня тяжкості і характеру перебігу РС рекомендується комплексне клінічне та імунобіологічне дослідження цитотоксичної активності IgG плазми крові хворих. Низька цитотоксична активність абзимів, виділених із плазми крові хворих на РС, вказує на несприятливий прогноз цього захворювання.
3. Враховуючи ініціюючу дію апоптичних процесів в автореактивних Т-лімфоцитах у хворих на РС, лікованих Бетафероном, рекомендується застосування цього препарату як засобу вибору при РС. Показник цитотоксичної активності IgG плазми крові можна використовувати як прогностичний тест оцінки ефективності проведеного лікування РС.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Хавунка М.Я., Негрич Т.І. Характеристика клінічних виявів розсіяного склерозу в дебюті цього захворювання та залежно від екологічної забрудненості довкілля // Львівський медичний часопис Acta Medica Leopoliensia. – 2005. – V. 11, № 3. – С. 110-115. (Внесок здобувача полягає в проведенні клінічного обстеження хворих, статистичній обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
2. Негрич Т.І., Хавунка М.Я. Особливості первинно-прогредієнтного типу перебігу розсіяного склерозу у Львівській області за даними регіонального реєстру // Практична медицина. – 2005. – Т. 11, №1. – С. 50-53. (Внесок здобувача полягає в проведенні інформаційного пошуку, огляді літератури, клінічному підборі та обстеженні хворих, статистичній обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
3. Негрич Т.І., Хавунка М.Я. Основні риси вторинно-прогредієнтного типу перебігу розсіяного склерозу у жителів Львівщини // Практична медицина. – 2005. – Т. 11, №2. – С. 27-30. (Внесок
здобувача полягає в клінічному підборі та обстеженні хворих, статистичній обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
4. Хавунка М.Я. Патоморфоз ремітуючо-рецидивуючого розсіяного склерозу у жителів Львівщини // Львівський медичний часопис Acta Medica Leopoliensia. – 2006. – Т.12, № 1. – С. 130-133.
5. Дослідження здатності до руйнування основного білка мієліну та ДНК в імуноглобулінів G плазми крові хворих на розсіяний склероз / Негрич Т.І., Хавунка М.Я, Старикович М.О., Кіт Ю.Я., Стойка Р.С. // Український неврологічний журнал. – 2006. - № 1. – С. 68-75. (Внесок здобувача полягає в проведенні інформаційного пошуку, огляді літератури, клінічному підборі та обстеженні хворих, обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
6. Цитотоксическая активность иммуноглобулинов плазмы крови клинически здоровых людей и больных рассеянным склерозом / Старикович М.О., Кит Ю.Я., Хавунка М.Я., Негрич Т.И., Стойка Р.С. // Цитотокины и воспаление. – 2006. – Т. 5, № 4. – С. 26-30. (Внесок здобувача полягає в клінічному підборі хворих, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
7. Вплив Бетаферону на імунокомпетентні клітини при розсіяному склерозі / Негрич Т.І., Хавунка М.Я., Старикович М.О., Стойка Р.С. // Міжнародний неврологічний журнал. – 2006. - № 5. – С. 37-43. (Внесок здобувача полягає в клінічному підборі та обстеженні хворих, обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
8. Cytotoxic activity of immunoglobulins isolated from blood serum of multiple sclerosis patients / Старикович М.О., Хавунка М.Я., Негрич Т.І., Кіт Ю.А., Стойка Р.С. // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 2. – С. 238-239. (Внесок здобувача полягає в проведенні інформаційного пошуку і огляду літератури, проведенні клінічного підборі хворих, обробці і аналізі отриманих результатів, підготовці тез до друку).
9. Нуклеазна та протеїназна активність імуноглобулінів класу G плазми крові хворих на розсіяний склероз/ Кіт Ю.А., Хавунка М.Я., Старикович М.О., Негрич Т.І., Стойка Р.С. // Матеріали міжн. науково-практ. конф., присвяч. 100-річчю каф. неврології, м. Львів. – 2005. – С. 104-105. (Внесок здобувача полягає в клінічному підборі хворих, аналізі отриманих результатів, підготовці тез до друку).
10. Нуклеазная и протеиназная активность иммуноглобулинов класса G сыворотки крови больных рассеянным склерозом / Старикович М.О., Кит Ю.А., Хавунка М.Я., Негрич Т.И., Стойка Р.С. //Нейроиммунология. – 2005. – Т. 3. - № 2. – С. 117. (Внесок здобувача полягає в аналізі отриманих результатів, підготовці тез до друку).
11. Цитотоксична активність імуноглобулінів плазми крові здорових людей та хворих на розсіяний склероз / Старикович М.О., Хавунка М.Я., Шоробура М.С., Негрич Т.І., Стойка Р.С. // Матеріали 9-го Українського біохімічного з'їзду, м. Харків. – 2006. - Т.2. - С. 117. (Внесок здобувача полягає в проведенні інформаційного пошуку, огляду літератури, проведенні клінічного підбору хворих, статистичній обробці, аналізі отриманих результатів, підготовці тез до друку).
12. Хавунка М.Я. Біодеструктивні процеси в патогенезі розсіяного склерозу // Львівський медичний часопис Acta Medica Leopoliensia. – 2007. – Т.13, № 1-2. – С. 8-14.
АНОТАЦІЯ
Хавунка М.Я. Клініко-патогенетична характеристика розсіяного склерозу у зоні високого ризику захворювання. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.15 - нервові хвороби.- ДУ "Інститут неврології, психіатрії та наркології АМН України", Харків, 2008.
Дисертація присвячена вивченню нових патогенетичних механізмів розвитку РС, розробці ефективних діагностичних і прогностичних маркерів цього захворювання й оптимізації підходів до лікувальної тактики хворих. Досліджено особливості клінічного перебігу РС залежно від ЕЗ оточуючого середовища. Встановлено, що зменшення цитотоксичних впливів абзимів плазми крові хворих на РС по відношенню до автореактивних Т-лімфоцитів корелює із зростанням тяжкості патологічного процесу, а їх загибель здійснюється шляхом апоптозу. Визначено важливе значення ензиматичних властивостей IgG плазми крові хворих на РС у розвитку імунобіологічних патологічних змін при цьому захворюванні. Обгрунтована клінічна ефективність лікування хворих на РС Бетафероном, внаслідок якого відбувається локальна елімінація автореактивних Т-лімфоцитів шляхом індукції їх апоптозу.
Ключові слова: розсіяний склероз, абзими, апоптоз, ДНК, ОБМ, Бетаферон.
АННОТАЦИЯ
Хавунка М.Я. Клинико-патогенетическая характеристика рассеянного склероза в зоне высокого риска заболеваемости. - Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.15 - нервные болезни. – ГУ "Институт неврологии, психиатрии и наркологии АМН Украины", Харьков, 2008.
Диссертация посвящена изучению новых патогенетических механизмов развития рассеянного склероза (РС), разработке эффективных диагностических и прогностических маркеров этого заболевания, а также оптимизации подходов к лечебной тактике у больных. На основании комплексного клинического и иммунобиологического обследования больных c РС определена последовательность развития патогенетических изменений при РС в зависимости от такого экзогенного фактора, как экологическое загрязнение окружающей среды и от проявлений цитодеструктивных процессов в автореактивных Т-клетках больных. Оптимизированы подходы к диагностике и лечебной тактике у больных с РС. Определены детальные клинические особенности дебюта и всех основных типов клинического течения РС в зависимости от загрязнения зоны проживання пациентов.
В разных клинических группах больных с РС определили наличие и изучили цитотоксические качества иммуноглобулинов G (абзимов), выделенных из плазмы крови этих больных, а также энзиматические свойства последних, их способность разрушать ОБМ и ДНК.
Показали, что препараты IgG плазмы крови больных с РС обладают сниженной цитотоксичной активностью по отношению к иммунным человеческим лейкемическим Т-лимфоцитам линии MT-4, что обуславлиевает развитие аутоиммунных деструктивных изменений при этом заболевании. Подтвердили, что уменьшение цитотоксических влияний абзимов плазмы крови больных с РС по отношению к аутореактивным Т-лимфоцитам коррелирует с нарастанием тяжести патологического процесса при данном заболевании, а гибель этих иммунных клеток идет по пути их апоптоза.
Описано важное значение энзиматических свойств IgG плазмы крови больных с РС в развитии иммунобиологических патологических изменений при этом заболевании. IgG, очищенные из плазмы крови больных с РС, могут разрушать ОБМ, хотя у отдельных больных уровни этой активности существенно отличаются. Энзиматические свойства иммуноглобулинов в значительной мере зависят от индивидуальных клинических особенностей РС, в частности его продолжительности, типа течения, степени тяжести и стадии патологического процесса. В плазме крови отдельных больных с РС присутствуют абзимы, способные гидролизировать не только ОБМ, но и ДНК, хотя появление таких абзимов при РС не является массовым явлением.
Обоснована клиническая эффективность лечения больных с РС препаратом превентивного ряда Бетафероном, вследствие которого происходит локальная элиминация аутореактивных Т-лимфоцитов через индукцию их апоптоза. Препарат иммуномодулирующего действия Бетаферон способствует инициации апоптических процессов в аутореактивных Т-лимфоцитах значительной части больных с РС, тормозя, таким образом, аутоиммунные реакции, характерные для этого заболевания. Уменьшение количества обострений у больных с РС, полный выход из них, уменьшение тяжести РС в процессе такого лечения коррелирует с ростом цитотоксической активности IgG плазмы крови больных с РС и их свойством индуцировать апоптоз аутореактивных Т-клеток.
Разработан метод клинического обследования больных с акцентом на изучение преморбидного фона каждого больного, выявление ранних симптомов РС, расширенную оценку неврологического статуса и детальное исследование типов его течения. Доказана необходимость учлта состояния экологической загрязнлнности территории проживания больных в определении прогноза РС. Загрязнлнность почвы, играет хотя и не ведущую, но весомую роль в появлении первых симптомов РС, определяя течение этого заболевания и инсультоподобный темп входа в его дебют, утяжеляя клиническую картину заболевания в целом.
Ключевые слова: рассеянный склероз, абзимы, апоптоз, ДНК, ОБМ, Бетаферон.
ANNOTATION
Khavunka M.Y. The clinical pathogenetic characteristics of multiple sclerosis in the region of high risk disease. - Manuscript.
Dissertation for the candidate of medical sciences degree in speciality 14.01.15 – nervous diseases. – "Institute of Neurology, Psychiatrics and Narcology of the Academy Medical Sciences of Ukraine" State Institution. Kharkiv, 2008.
Thesis is devoted to the investigation of the new pathogenetic mechanisms of the development of the MS and the effective diagnostic and prognostic markers of this illness and optimization of the approaches to the clinical tactics with patients. Peculiarities of the flow of the MS depending on such an exogenic factor as ecological pollution of the environment have been studied. It has been determined that a decrease of cytotoxic influence of the abzymes in blood plasma of the patients with MS towards the autoreactive Т-lymphocytes correlates with an increase of the gravity of the pathologic process. Great importance of the enzymetic characteristics of Ig G in the blood plasma of the patients with MS in the development of the immunobiological patalogic changes accompanying this disease has been defined. Clinical effectiveness of the treatment of patients with by Betaferon as divventive remedy was confirmedley local elimination of the autoreactive T-lymphocytes by means of the induction of their apoptosis.
Key words: multiple sclerosis, abzymes, apoptosis, DNA, basic protein of myelin, Betaferon.
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АТ – антитіло, ВП – вторинно-прогресуючий, ГЕБ – гематоенцефалічний бар’єр, ГКГ – головний комплекс гістосумісності, ДНК – дезоксирибонуклеїнова кислота, ЕЗ – екологічно забруднені, ЕЧ – екологічно чисті, ІФА – імуноферментний аналіз, кДА – кілодальтон, ОБМ – основний білок мієліну, МКПК - моноядерні клітини периферійної крові, МРТ – магніто-резонансна томографія, ПААГ – поліакриламідний гель, ПЛП – протеоліпідний протеїн, ПП – первинно-прогресуючий, РНК – рибонуклеїнова кислота, РР – ремітуючо-рецидивуючий, РС – розсіяний склероз, ТХО – трихлороцтова кислота, ФСБ – фосфатно-сольовий буфер, EDSS – розширена шкала для оцінки недієздатності, IgG - імуноглобулін класу G, IgМ - імуноглобулін класу М.
Схематичне представлення механізмів біодеструктивних процесів, що відбуваються під час захворювання на розсіяний склероз
ref SHAPE \* MERGEFORMAT ВИСНОВКИ
У дисертації здійснено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукового завдання, яке полягає в удосконаленні діагностичних підходів та лікувальної тактики у хворих на розсіяний склероз на підставі комплексного клінічного та імунобіологічного дослідження, а також визначено прогностичні критерії перебігу цього захворювання залежно від екологічної забрудненості територій проживання хворих.
1. Встановлено, що серед зовнішніх факторів ризику розвитку РС важливе значення мають екологічні характеристики зони проживання хворих. Виявлено, статистично вірогідну перевагу таких несприятливих клінічних характеристик РС, як церебро-спінальна форма (Р<0,05), вторинно-прогресуючий тип перебігу (Р<0,01), тяжкий ступінь прояву патологічного процесу (Р<0,05) у хворих, які проживають на забруднених грунтах порівняно із чистими.
2. Забрудненість грунтів, відіграє хоча і не провідну, але вагому роль у появі перших симптомів РС, викликаючи їх тривалий (у 63,0% хворих) і тяжкий (у 64,16% хворих) перебіг, інсультоподібний темп входження у дебют цього захворювання (18,5%) поряд із сповільненим виходом з нього (61,27%). При РР РС має місце статистично вірогідна перевага пацієнтів із рецидивами середньої тяжкості (23,12%) при мінімальній кількості пацієнтів із їх легкими проявами (2,31%); з поступовим (14,45%) або сповільненим (18,49%) темпами виходу з рецидивів; з одномоментною появою симптомів та синдромів при входженні в рецидив у жителів екологічно забруднених (10,4%) порівняно з жителями екологічно чистих (2,3%) районів Львівської області. Не виявлено суттєвих відмінностей між клінічним перебігом вторинно-прогресуючого і первинно-прогресуючого РС залежно від екологічної ситуації, зокрема, забруднення грунтів у межах Львівської області, що вказує на існування інших екзо- і/або ендогенних факторів ризику розвитку РС при наявності генетичної схильності до цього захворювання. Водночас, ці два типи перебігу РС у межах нашої області носять низку несприятливих клінічних особливостей, які і визначають злоякісність його перебігу у західному регіоні України.
3. Препарати IgG плазми крові хворих на РС володіють нижчою цитотоксичною активністю щодо Т-клітин (лінія МТ-4), а деякі з них навіть стимулюють ріст цих клітин, у порівнянні з IgG клінічно здорових донорів. Загибель Т-клітин під дією препаратів IgG відбувається шляхом апоптозу. Отримані дані вказують на підвищену стійкість до апоптозу автореактивних Т-клітин при РС, що корелює із посиленням автоімунного процесу при цьому захворюванні. Виявлено кореляцію між низькою цитотоксичною активністю абзимів виділених із плазми крові хворих на РС щодо Т-лімфоцитів і ступенем тяжкості цього захворювання.
4. IgG, очищені із плазми крові хворих на РС, володіють здатністю руйнувати ОБМ, хоча в окремих хворих рівні цієї активності суттєво відрізняються. Ензиматичні властивості імуноглобулінів значною мірою залежать від індивідуальних клінічних характеристик РС, зокрема, його довготривалості, типу перебігу, ступеня тяжкості та стадії патологічного процесу. У плазмі крові окремих хворих на РС присутні абзими, здатні гідролізувати не лише ОБМ, але й ДНК, хоча поява таких абзимів при захворюванні на РС не є масовим явищем.
5. Препарат імуномодулюючої дії Бетаферон сприяє ініціації апоптичних процесів в автореактивних Т-лімфоцитах значної частини хворих на РС, гальмуючи, таким чином, автоімунні реакції, характерні для цього захворювання. Показано, що зменшення кількості загострень у хворих на РС, повний вихід із них, зменшення тяжкості РС в процесі такого лікування корелює із зростанням цитотоксичної активності IgG плазми крові хворих на РС та їх здатністю індукувати апоптоз автореактивних Т-клітин.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1. При визначенні прогнозу РС необхідно враховувати стан екологічної забрудненості територій проживання хворих. З прогностичною метою рекомендовано ретельне вивчення анамнезу хвороби та клінічних особливостей різних типів його перебігу за допомогою спеціально розробленої Інститутом неврології, психіатрії та наркології АМН України анкети-опитувальника.
2. Для діагностики ступеня тяжкості і характеру перебігу РС рекомендується комплексне клінічне та імунобіологічне дослідження цитотоксичної активності IgG плазми крові хворих. Низька цитотоксична активність абзимів, виділених із плазми крові хворих на РС, вказує на несприятливий прогноз цього захворювання.
3. Враховуючи ініціюючу дію апоптичних процесів в автореактивних Т-лімфоцитах у хворих на РС, лікованих Бетафероном, рекомендується застосування цього препарату як засобу вибору при РС. Показник цитотоксичної активності IgG плазми крові можна використовувати як прогностичний тест оцінки ефективності проведеного лікування РС.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Хавунка М.Я., Негрич Т.І. Характеристика клінічних виявів розсіяного склерозу в дебюті цього захворювання та залежно від екологічної забрудненості довкілля // Львівський медичний часопис Acta Medica Leopoliensia. – 2005. – V. 11, № 3. – С. 110-115. (Внесок здобувача полягає в проведенні клінічного обстеження хворих, статистичній обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
2. Негрич Т.І., Хавунка М.Я. Особливості первинно-прогредієнтного типу перебігу розсіяного склерозу у Львівській області за даними регіонального реєстру // Практична медицина. – 2005. – Т. 11, №1. – С. 50-53. (Внесок здобувача полягає в проведенні інформаційного пошуку, огляді літератури, клінічному підборі та обстеженні хворих, статистичній обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
3. Негрич Т.І., Хавунка М.Я. Основні риси вторинно-прогредієнтного типу перебігу розсіяного склерозу у жителів Львівщини // Практична медицина. – 2005. – Т. 11, №2. – С. 27-30. (Внесок
здобувача полягає в клінічному підборі та обстеженні хворих, статистичній обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
4. Хавунка М.Я. Патоморфоз ремітуючо-рецидивуючого розсіяного склерозу у жителів Львівщини // Львівський медичний часопис Acta Medica Leopoliensia. – 2006. – Т.12, № 1. – С. 130-133.
5. Дослідження здатності до руйнування основного білка мієліну та ДНК в імуноглобулінів G плазми крові хворих на розсіяний склероз / Негрич Т.І., Хавунка М.Я, Старикович М.О., Кіт Ю.Я., Стойка Р.С. // Український неврологічний журнал. – 2006. - № 1. – С. 68-75. (Внесок здобувача полягає в проведенні інформаційного пошуку, огляді літератури, клінічному підборі та обстеженні хворих, обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
6. Цитотоксическая активность иммуноглобулинов плазмы крови клинически здоровых людей и больных рассеянным склерозом / Старикович М.О., Кит Ю.Я., Хавунка М.Я., Негрич Т.И., Стойка Р.С. // Цитотокины и воспаление. – 2006. – Т. 5, № 4. – С. 26-30. (Внесок здобувача полягає в клінічному підборі хворих, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
7. Вплив Бетаферону на імунокомпетентні клітини при розсіяному склерозі / Негрич Т.І., Хавунка М.Я., Старикович М.О., Стойка Р.С. // Міжнародний неврологічний журнал. – 2006. - № 5. – С. 37-43. (Внесок здобувача полягає в клінічному підборі та обстеженні хворих, обробці матеріалу, аналізі отриманих результатів, підготовці статті до друку).
8. Cytotoxic activity of immunoglobulins isolated from blood serum of multiple sclerosis patients / Старикович М.О., Хавунка М.Я., Негрич Т.І., Кіт Ю.А., Стойка Р.С. // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 2. – С. 238-239. (Внесок здобувача полягає в проведенні інформаційного пошуку і огляду літератури, проведенні клінічного підборі хворих, обробці і аналізі отриманих результатів, підготовці тез до друку).
9. Нуклеазна та протеїназна активність імуноглобулінів класу G плазми крові хворих на розсіяний склероз/ Кіт Ю.А., Хавунка М.Я., Старикович М.О., Негрич Т.І., Стойка Р.С. // Матеріали міжн. науково-практ. конф., присвяч. 100-річчю каф. неврології, м. Львів. – 2005. – С. 104-105. (Внесок здобувача полягає в клінічному підборі хворих, аналізі отриманих результатів, підготовці тез до друку).
10. Нуклеазная и протеиназная активность иммуноглобулинов класса G сыворотки крови больных рассеянным склерозом / Старикович М.О., Кит Ю.А., Хавунка М.Я., Негрич Т.И., Стойка Р.С. //Нейроиммунология. – 2005. – Т. 3. - № 2. – С. 117. (Внесок здобувача полягає в аналізі отриманих результатів, підготовці тез до друку).
11. Цитотоксична активність імуноглобулінів плазми крові здорових людей та хворих на розсіяний склероз / Старикович М.О., Хавунка М.Я., Шоробура М.С., Негрич Т.І., Стойка Р.С. // Матеріали 9-го Українського біохімічного з'їзду, м. Харків. – 2006. - Т.2. - С. 117. (Внесок здобувача полягає в проведенні інформаційного пошуку, огляду літератури, проведенні клінічного підбору хворих, статистичній обробці, аналізі отриманих результатів, підготовці тез до друку).
12. Хавунка М.Я. Біодеструктивні процеси в патогенезі розсіяного склерозу // Львівський медичний часопис Acta Medica Leopoliensia. – 2007. – Т.13, № 1-2. – С. 8-14.
АНОТАЦІЯ
Хавунка М.Я. Клініко-патогенетична характеристика розсіяного склерозу у зоні високого ризику захворювання. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.15 - нервові хвороби.- ДУ "Інститут неврології, психіатрії та наркології АМН України", Харків, 2008.
Дисертація присвячена вивченню нових патогенетичних механізмів розвитку РС, розробці ефективних діагностичних і прогностичних маркерів цього захворювання й оптимізації підходів до лікувальної тактики хворих. Досліджено особливості клінічного перебігу РС залежно від ЕЗ оточуючого середовища. Встановлено, що зменшення цитотоксичних впливів абзимів плазми крові хворих на РС по відношенню до автореактивних Т-лімфоцитів корелює із зростанням тяжкості патологічного процесу, а їх загибель здійснюється шляхом апоптозу. Визначено важливе значення ензиматичних властивостей IgG плазми крові хворих на РС у розвитку імунобіологічних патологічних змін при цьому захворюванні. Обгрунтована клінічна ефективність лікування хворих на РС Бетафероном, внаслідок якого відбувається локальна елімінація автореактивних Т-лімфоцитів шляхом індукції їх апоптозу.
Ключові слова: розсіяний склероз, абзими, апоптоз, ДНК, ОБМ, Бетаферон.
АННОТАЦИЯ
Хавунка М.Я. Клинико-патогенетическая характеристика рассеянного склероза в зоне высокого риска заболеваемости. - Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.15 - нервные болезни. – ГУ "Институт неврологии, психиатрии и наркологии АМН Украины", Харьков, 2008.
Диссертация посвящена изучению новых патогенетических механизмов развития рассеянного склероза (РС), разработке эффективных диагностических и прогностических маркеров этого заболевания, а также оптимизации подходов к лечебной тактике у больных. На основании комплексного клинического и иммунобиологического обследования больных c РС определена последовательность развития патогенетических изменений при РС в зависимости от такого экзогенного фактора, как экологическое загрязнение окружающей среды и от проявлений цитодеструктивных процессов в автореактивных Т-клетках больных. Оптимизированы подходы к диагностике и лечебной тактике у больных с РС. Определены детальные клинические особенности дебюта и всех основных типов клинического течения РС в зависимости от загрязнения зоны проживання пациентов.
В разных клинических группах больных с РС определили наличие и изучили цитотоксические качества иммуноглобулинов G (абзимов), выделенных из плазмы крови этих больных, а также энзиматические свойства последних, их способность разрушать ОБМ и ДНК.
Показали, что препараты IgG плазмы крови больных с РС обладают сниженной цитотоксичной активностью по отношению к иммунным человеческим лейкемическим Т-лимфоцитам линии MT-4, что обуславлиевает развитие аутоиммунных деструктивных изменений при этом заболевании. Подтвердили, что уменьшение цитотоксических влияний абзимов плазмы крови больных с РС по отношению к аутореактивным Т-лимфоцитам коррелирует с нарастанием тяжести патологического процесса при данном заболевании, а гибель этих иммунных клеток идет по пути их апоптоза.
Описано важное значение энзиматических свойств IgG плазмы крови больных с РС в развитии иммунобиологических патологических изменений при этом заболевании. IgG, очищенные из плазмы крови больных с РС, могут разрушать ОБМ, хотя у отдельных больных уровни этой активности существенно отличаются. Энзиматические свойства иммуноглобулинов в значительной мере зависят от индивидуальных клинических особенностей РС, в частности его продолжительности, типа течения, степени тяжести и стадии патологического процесса. В плазме крови отдельных больных с РС присутствуют абзимы, способные гидролизировать не только ОБМ, но и ДНК, хотя появление таких абзимов при РС не является массовым явлением.
Обоснована клиническая эффективность лечения больных с РС препаратом превентивного ряда Бетафероном, вследствие которого происходит локальная элиминация аутореактивных Т-лимфоцитов через индукцию их апоптоза. Препарат иммуномодулирующего действия Бетаферон способствует инициации апоптических процессов в аутореактивных Т-лимфоцитах значительной части больных с РС, тормозя, таким образом, аутоиммунные реакции, характерные для этого заболевания. Уменьшение количества обострений у больных с РС, полный выход из них, уменьшение тяжести РС в процессе такого лечения коррелирует с ростом цитотоксической активности IgG плазмы крови больных с РС и их свойством индуцировать апоптоз аутореактивных Т-клеток.
Разработан метод клинического обследования больных с акцентом на изучение преморбидного фона каждого больного, выявление ранних симптомов РС, расширенную оценку неврологического статуса и детальное исследование типов его течения. Доказана необходимость учлта состояния экологической загрязнлнности территории проживания больных в определении прогноза РС. Загрязнлнность почвы, играет хотя и не ведущую, но весомую роль в появлении первых симптомов РС, определяя течение этого заболевания и инсультоподобный темп входа в его дебют, утяжеляя клиническую картину заболевания в целом.
Ключевые слова: рассеянный склероз, абзимы, апоптоз, ДНК, ОБМ, Бетаферон.
ANNOTATION
Khavunka M.Y. The clinical pathogenetic characteristics of multiple sclerosis in the region of high risk disease. - Manuscript.
Dissertation for the candidate of medical sciences degree in speciality 14.01.15 – nervous diseases. – "Institute of Neurology, Psychiatrics and Narcology of the Academy Medical Sciences of Ukraine" State Institution. Kharkiv, 2008.
Thesis is devoted to the investigation of the new pathogenetic mechanisms of the development of the MS and the effective diagnostic and prognostic markers of this illness and optimization of the approaches to the clinical tactics with patients. Peculiarities of the flow of the MS depending on such an exogenic factor as ecological pollution of the environment have been studied. It has been determined that a decrease of cytotoxic influence of the abzymes in blood plasma of the patients with MS towards the autoreactive Т-lymphocytes correlates with an increase of the gravity of the pathologic process. Great importance of the enzymetic characteristics of Ig G in the blood plasma of the patients with MS in the development of the immunobiological patalogic changes accompanying this disease has been defined. Clinical effectiveness of the treatment of patients with by Betaferon as divventive remedy was confirmedley local elimination of the autoreactive T-lymphocytes by means of the induction of their apoptosis.
Key words: multiple sclerosis, abzymes, apoptosis, DNA, basic protein of myelin, Betaferon.
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АТ – антитіло, ВП – вторинно-прогресуючий, ГЕБ – гематоенцефалічний бар’єр, ГКГ – головний комплекс гістосумісності, ДНК – дезоксирибонуклеїнова кислота, ЕЗ – екологічно забруднені, ЕЧ – екологічно чисті, ІФА – імуноферментний аналіз, кДА – кілодальтон, ОБМ – основний білок мієліну, МКПК - моноядерні клітини периферійної крові, МРТ – магніто-резонансна томографія, ПААГ – поліакриламідний гель, ПЛП – протеоліпідний протеїн, ПП – первинно-прогресуючий, РНК – рибонуклеїнова кислота, РР – ремітуючо-рецидивуючий, РС – розсіяний склероз, ТХО – трихлороцтова кислота, ФСБ – фосфатно-сольовий буфер, EDSS – розширена шкала для оцінки недієздатності, IgG - імуноглобулін класу G, IgМ - імуноглобулін класу М.
