Реферат на тему Зміни протеїназно інгібіторного балансу при рості злоякісних пухлин з індукованою резистентністю
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2014-12-30Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ
І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО
КОВТОНЮК ОКСАНА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 616-006.04:615.477.2:57.042.2:615.277.3
ЗМІНИ ПРОТЕЇНАЗНО-ІНГІБІТОРНОГО БАЛАНСУ ПРИ РОСТІ ЗЛОЯКІСНИХ ПУХЛИН З ІНДУКОВАНОЮ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ ДО ЦИСПЛАТИНУ
14.01.07 – онкологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Науковий керівник-
академік НАН України, доктор медичних наук, професор Чехун Василь Федорович,
директор, завідувач відділу механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Офіційні опоненти: -
доктор біологічних наук, професор Воронцова Ада Леонідівна,
провідний науковий співробітник відділу експериментальних клітинних систем Інститутуекспериментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України;
кандидат біологічних наук
Кизим Олександра Йосипівна,
старший науковий співробітник лабораторії біохімії Інституту отоларингології ім. проф. О.С.Коломійченка АМН України
Захист дисертації відбудеться “26” березня 2008 року о 13.30 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Автореферат розісланий “26” лютого 2008 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук
Л.М. Шлапацька
ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ
І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО
КОВТОНЮК ОКСАНА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 616-006.04:615.477.2:57.042.2:615.277.3
ЗМІНИ ПРОТЕЇНАЗНО-ІНГІБІТОРНОГО БАЛАНСУ ПРИ РОСТІ ЗЛОЯКІСНИХ ПУХЛИН З ІНДУКОВАНОЮ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ ДО ЦИСПЛАТИНУ
14.01.07 – онкологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Науковий керівник-
академік НАН України, доктор медичних наук, професор Чехун Василь Федорович,
директор, завідувач відділу механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Офіційні опоненти: -
доктор біологічних наук, професор Воронцова Ада Леонідівна,
провідний науковий співробітник відділу експериментальних клітинних систем Інститутуекспериментальної патології, онкології і радіобіології
ім. Р.Є. Кавецького НАН України;
кандидат біологічних наук
Кизим Олександра Йосипівна,
старший науковий співробітник лабораторії біохімії Інституту отоларингології ім. проф. О.С.Коломійченка АМН України
Захист дисертації відбудеться “26” березня 2008 року о 13.30 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Автореферат розісланий “26” лютого 2008 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук
Л.М. Шлапацька
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Проблема формування лікарської резистентності до цитостатиків є, без сумніву, надзвичайно актуальною і навіть ключовою в клінічній практиці, оскільки саме цей феномен у багатьох випадках визначає неефективність хіміотерапії і ставить під загрозу життя онкологічних хворих.
На сьогодні відомо, що резистентність пухлинних клітин до цитостатиків є багатофакторним явищем і пов’язана з рядом особливостей клітин на рівні цитоплазматичної мембрани, внутрішньоклітинних систем детоксикації, систем репарації (Liang X.J. et al., 2004; Longley D.B. et al., 2005; Чехун В.Ф. и соавт., 2006; Chekhun V.F. et al., 2007). Однією з відомих причин виникнення лікарської резистентності може бути порушення сигнальних шляхів розвитку апоптозу (Biliran H.Jr. et al., 2005; Choi H.K. et al., 2005; Ohmichi M. et al., 2005). Слід зазначити, що серед численних факторів регуляції апоптозу, викликаного дією протипухлинних препаратів, значну роль відіграють серинові протеїнази – представники окремого класу протеолітичних ферментів. Зокрема, на сьогодні встановлена участь серинових протеїназ у регуляції апоптозу, індукованого дією цисплатину – протипухлинного препарату, який широко застосовується в клінічній практиці (Kim R. et al., 2001; Wu C.H. et al., 2002; Downing S. et al., 2003; Chien J. et al., 2006; Alfano D. et al., 2006). За цих обставин логічно припустити участь серинових протеїназ та їх інгібіторів і в формуванні резистентності до цисплатину, тим більше, що дані ферменти та їх інгібітори відіграють суттєву роль у механізмах, які асоціюються зі зниженням накопичення цитостатику в пухлинній клітині (Dong Y. et al., 1997).
Слід зазначити, що в літературі вже є інформація про зв’язок між зміною рівня експресії серинових протеїназ та розвитком резистентності пухлинних клітин до цисплатину (Dong Y. et al., 1997; Osmak M. et al., 1999; Alfano D. et al., 2006), хоча цей зв’язок виявлений лише в системах іn vitro. Що стосується ситуації in vivo, то тут проблема залишається відкритою, і її висвітлення є, безумовно, актуальним; не менш важливим за цих умов є вивчення рівня інгібіторів протеолітичних ферментів, оскільки нормальне функціонування системи протеолізу знаходиться під контролем ендогенних інгібіторів протеолітичних ферментів.
Серед основних природних інгібіторів серинових протеїназ особливий інтерес викликають б1-інгібітор протеїназ (б1-ІП) і б2-макроглобулін (б2М), які є важливою складовою частиною антипротеолітичного потенціалу плазми крові (Hibbets К. et al., 1999; Нероев В.В. и соавт., 2007). Інтегральним показником, який дозволяє визначати ендогенну активність серинових протеїназ плазми крові/пухлинної тканини і дає уявлення про протеолітичний потенціал біологічного об’єкту, є рівень сумарної протеолітичної активності – ПРА (Веремеенко К.Н. и соавт., 2000). Враховуючи те, що співвідношення рівнів ПРА з рівнями б1-ІП і б2М свідчить про стан динамічної рівноваги між протеїназами та їх інгібіторами в плазмі крові чи пухлинній тканині, не виключено, що співставлення рівнів ПРА/б1-ІП і ПРА/б2М в динаміці росту пухлин з різним ступенем чутливості до цитостатику може бути важливим критерієм розвитку лікарської резистентності в умовах іn vivo. Саме цій проблемі – дослідженню змін протеїназно-інгібіторного балансу при рості пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину, присвячена дана робота.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відповідності з планом науково-дослідної роботи інституту за темами: “Вивчення біологічних особливостей пухлинного процесу при формуванні фенотипу лікарської резистентності” (2000–2004 рр., державний реєстраційний № 0101U000670), “Роль гомоцистеїну в процесах формування лікарської резистентності пухлин до дії цитотоксичних препаратів” (2004–2007 рр., державний реєстраційний № 0104U006131).
Мета дослідження. Дослідити зміни протеолітичної активності та вмісту основних інгібіторів протеїназ (плазма крові та пухлинна тканина) при рості експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину.
Задачі дослідження.
1. Вивчити кінетику росту резистентної до цисплатину карциноми Герена.
2. Дослідити динаміку змін ПРА, вмісту б1-ІП та б2М в плазмі крові щурів при рості резистентної до цисплатину карциноми Герена.
3. Вивчити кінетику росту та інтенсивність метастазування карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
4. Дослідити динаміку змін ПРА, вмісту б1-ІП та б2М в плазмі крові мишей при рості карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
5. Дослідити динаміку змін ПРА та вмісту б1-ІП у тканині карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
6. Вивчити зміни протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині при рості карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
7. Проаналізувати кореляційні залежності між зміною рівнів ПРА, вмісту б1-ІП і б2М та кінетикою росту експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину.
Об’єкт дослідження – миші лінії С57BL/6 з перещепленою карциномою легені Льюїс (вихідного та резистентних до цисплатину підштамів); щури лінії Вістар з перещепленою карциномою Герена (вихідного та резистентного до цисплатину штамів).
Предмет дослідження – індукована резистентність до цисплатину, протеолітична активність та вміст основних інгібіторів протеїназ (б1-ІП та б2М), кінетика росту пухлин, метастазування.
Методи дослідження – використання експериментальних модельних систем пухлинного росту, біохімічні, статистичні.
Наукова новизна. Вперше експериментально доведено, що формування резистентності карциноми Герена та карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики пухлинного росту: пролонгацією латентного періоду росту пухлини та підвищенням швидкості її росту в експоненційній фазі. Встановлено, що зміна кінетики росту пухлин асоціюється з підвищенням рівнів ПРА і б1-ІП та зниженням рівня б2М в плазмі крові.
Вперше виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом резистентної карциноми Герена та рівнями ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001) і б1-ІП (rho = 0,67; p = 0,000002) в плазмі крові. Пряма кореляційна залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) і б1-ІП (rho = 0,65; p = 0,001) в плазмі крові виявлена також при рості карциноми легені Льюїс за умов розвитку резистентності до дії цисплатину. Аналогічний кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) і б1-ІП (rho = 0,76; p = 0,0001) був виявлений безпосередньо і в пухлинній тканині.
Вперше за співвідношенням рівнів ПРА/б1-ІП та ПРА/б2М в плазмі крові тварин з різними за чутливістю до цисплатину пухлинами виявлено, що розвиток резистентності карциноми Герена та карциноми легені Льюїс до цитостатику супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в напрямку підвищення рівня ПРА. Показано, що при рості резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс (LLC-27) в пухлинній тканині значно підвищується рівень ПРА та знижується рівень б1-ІП у порівнянні з такими у вихідній пухлині. Виявлено асоціативний зв’язок між змінами протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині при розвитку резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину.
Практичне значення результатів дослідження. Особливості протеїназно-інгібіторного балансу, виявлені в динаміці росту пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину в плазмі крові та пухлинній тканині, можуть бути використані для подальшої розробки методів оцінки чутливості злоякісних пухлин до дії даного цитостатику. Одержані дані можуть також бути підґрунтям для пошуку шляхів профілактики метастазування через вплив на систему протеолізу.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто поставлена мета роботи, сформульовані основні завдання і налагоджені методи дослідження. Автором зібрана та проаналізована сучасна наукова література за темою дисертації, самостійно виконані наукові дослідження, проведено аналіз первинного матеріалу, статистичну обробку отриманих даних. Автором проведено теоретичне узагальнення результатів роботи, сформульовані основні положення і висновки дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на: VI конференції молодих онкологів України (Київ, 2003); ІІ науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005); ІІІ з’їзді онкологів та радіологів СНД (Мінськ, Білорусія, 2004); 18 European association for cancer research (Інсбрук, Австрія, 2004); International Student Congress of Medical Sciences (Гронінген, Нідерланди, 2005); всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів”, (Київ, 2006); International Medical Students’ Congress in Novi Sad (Сербія, 2006); 17 European Student’s Conference (Берлін, Німеччина, 2006); IV з’їзді онкологів та радіологів СНД (Баку, Азербайджанська Республіка, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 3 статті у провідних фахових журналах, рекомендованих ВАК України та 9 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних з’їздів та конференцій. Отримано 1 патент на винахід в Україні.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 148 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, огляду літератури, 6-ти розділів, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 11 таблицями та 36 рисунками. Список цитованої літератури налічує 215 першоджерел, у тому числі 195 зарубіжних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи дослідження. В дослідженнях використано 478 мишей-самців лінії С57Bl/6 та 140 щурів-самців лінії Вістар, які були отримані з розплідника віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Утримання тварин та робота з ними проводилися у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил виконання робіт з експериментальними тваринами.
Штами карциноми Герена та карциноми легені Льюїс були отримані з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Перещеплення експериментальних пухлин здійснювали загальноприйнятим методом. Вироблення резистентності пухлин до цисплатину досягали шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин, які одержували від тварин, котрим було проведено курс ін’єкцій цитостатику.
Після перещеплення суспензії пухлинних клітин тварини були поділені на дві групи: контрольну і дослідну. Цисплатин (“Ebewe”, Австрія) вводили тваринам дослідної групи на 7 добу після перещеплення пухлини в дозі 1,2 мг/кг внутрішньочеревинно через день – всього п’ять ін’єкцій. Тваринам контрольної групи за аналогічною схемою вводили стерильний фізіологічний розчин. Пухлини дослідної групи використовували для приготування суспензії клітин, які перещеплювали тваринам другого пасажу. В експериментах з карциномою Герена було проведено 12 послідовних перещеплень, в експериментах з карциномою легені Льюїс – 27. Вивчення кінетики росту пухлин та визначення показників системи протеолізу проводили у тварин контрольних груп.
Дослідження на щурах з кариномою Герена були проведені на 2 групах тварин: 1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному Герена (Guerin carcinoma, (GC));
2 група – тварини, яким було перещеплено карциному Герена, попередньо проведену через 12 пасажів на щурах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (GC/R).
В серії досліджень на мишах з кариномою легені Льюїс використовували 4 групи тварин:
1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному легені Льюїс (Lewis lung carcinoma, LLC).
2 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 9 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC- 9).
3 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 19 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-19).
4 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 27 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-27).
Таким чином, в експериментах з карциномою легені Льюїс були використані пухлинні підштами, отримані на різних етапах формування резистентності: LLC-9 (початковий етап), LLC-19 (проміжний етап), LLC-27 (кінцевий етап). В експериментах з карциномою Герена був використаний пухлинний підштам, отриманий на кінцевому етапі формування резистентності до цисплатину (GC/R).
Аналіз кінетики пухлинного росту проводили для кожної тварини за допомогою математичної моделі Вейбула росту гетерогенних пухлин (Weibull W, Sweden S., 1951). Кінетичні параметри росту пухлини визначали для кожної тварини контрольної групи за кінетичними кривими росту, які розраховували методом нелінійної регресії з використанням програми “Microcal Origin 7.0”.
Параметр “а” відображає швидкість росту цілісної пухлини в експоненційній фазі росту. Параметр “tlag” – латентний період росту первинної пухлини. Для аналізу динаміки змін кількості метастазів карциноми легені Льюїс використовували параметр “в” – швидкість метастазування, який характеризує темпи утворення метастатичних вузлів.
Визначення показників системи протеолізу проводили в плазмі крові тварин та пухлинній тканині. Для отримання плазми крові в якості антикоагулянта був використаний 3,8% розчин цитрату натрію в пропорції 9:1. Гомогенат пухлини готували на 0,05М трис-НСl буфері (рН 7,4).
ПРА плазми крові (мкмоль арг/хв на л плазми) чи тканини пухлини (мкмоль арг/хв на г білка) визначали за розщепленням аргінінвмісного лужного білка протамінсульфату спектрофотометричним методом К.М. Веремеєнка (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Принцип методу ґрунтується на визначенні пептидів, що містять аргінін, які відщеплюються від протамінсульфату протеолітичними ферментами пухлинної тканини чи плазми крові, що дозволяє визначати сумарну активність нейтральних серинових протеїназ. Вміст б1-ІП у плазмі крові (г/л) та тканині пухлини (мкг/мг тканини) визначали за здатністю останнього пригнічувати гідроліз трипсином синтетичного субстрата N- бензоїл -DL-аргінін-p-нітроаніліда (БАПНА).
Вміст б2М в плазмі крові (г/л) визначали за здатністю інгібітора утворювати з трипсином активний комплекс, який розщеплює синтетичний субстрат БАПНА, але є нечутливим до інгібітора з бобів сої (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Вміст білка в досліджуваних зразках визначали за методом Lowry O.H. та співавт. (1951).
Усі отримані кількісні результати досліджень підлягали статистичній обробці загальноприйнятими методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням пакету прикладних програм “Microsoft Excel 7.0”. Із сукупності даних розраховували середнє арифметичне варіаційного ряду (М), похибку середнього арифметичного (m), критерій Ст’юдента (t), рівень значущості (р). Різницю вважали статистично достовірною при рівні значимості р<0,05. Ступінь кореляційного зв’язку між окремими показниками визначали з використанням комп’ютерної програми “STATISTICA 6.0” методом непараметричної рангової кореляції Спірмена (rho). Актуальність проблеми. Проблема формування лікарської резистентності до цитостатиків є, без сумніву, надзвичайно актуальною і навіть ключовою в клінічній практиці, оскільки саме цей феномен у багатьох випадках визначає неефективність хіміотерапії і ставить під загрозу життя онкологічних хворих.
На сьогодні відомо, що резистентність пухлинних клітин до цитостатиків є багатофакторним явищем і пов’язана з рядом особливостей клітин на рівні цитоплазматичної мембрани, внутрішньоклітинних систем детоксикації, систем репарації (Liang X.J. et al., 2004; Longley D.B. et al., 2005; Чехун В.Ф. и соавт., 2006; Chekhun V.F. et al., 2007). Однією з відомих причин виникнення лікарської резистентності може бути порушення сигнальних шляхів розвитку апоптозу (Biliran H.Jr. et al., 2005; Choi H.K. et al., 2005; Ohmichi M. et al., 2005). Слід зазначити, що серед численних факторів регуляції апоптозу, викликаного дією протипухлинних препаратів, значну роль відіграють серинові протеїнази – представники окремого класу протеолітичних ферментів. Зокрема, на сьогодні встановлена участь серинових протеїназ у регуляції апоптозу, індукованого дією цисплатину – протипухлинного препарату, який широко застосовується в клінічній практиці (Kim R. et al., 2001; Wu C.H. et al., 2002; Downing S. et al., 2003; Chien J. et al., 2006; Alfano D. et al., 2006). За цих обставин логічно припустити участь серинових протеїназ та їх інгібіторів і в формуванні резистентності до цисплатину, тим більше, що дані ферменти та їх інгібітори відіграють суттєву роль у механізмах, які асоціюються зі зниженням накопичення цитостатику в пухлинній клітині (Dong Y. et al., 1997).
Слід зазначити, що в літературі вже є інформація про зв’язок між зміною рівня експресії серинових протеїназ та розвитком резистентності пухлинних клітин до цисплатину (Dong Y. et al., 1997; Osmak M. et al., 1999; Alfano D. et al., 2006), хоча цей зв’язок виявлений лише в системах іn vitro. Що стосується ситуації in vivo, то тут проблема залишається відкритою, і її висвітлення є, безумовно, актуальним; не менш важливим за цих умов є вивчення рівня інгібіторів протеолітичних ферментів, оскільки нормальне функціонування системи протеолізу знаходиться під контролем ендогенних інгібіторів протеолітичних ферментів.
Серед основних природних інгібіторів серинових протеїназ особливий інтерес викликають б1-інгібітор протеїназ (б1-ІП) і б2-макроглобулін (б2М), які є важливою складовою частиною антипротеолітичного потенціалу плазми крові (Hibbets К. et al., 1999; Нероев В.В. и соавт., 2007). Інтегральним показником, який дозволяє визначати ендогенну активність серинових протеїназ плазми крові/пухлинної тканини і дає уявлення про протеолітичний потенціал біологічного об’єкту, є рівень сумарної протеолітичної активності – ПРА (Веремеенко К.Н. и соавт., 2000). Враховуючи те, що співвідношення рівнів ПРА з рівнями б1-ІП і б2М свідчить про стан динамічної рівноваги між протеїназами та їх інгібіторами в плазмі крові чи пухлинній тканині, не виключено, що співставлення рівнів ПРА/б1-ІП і ПРА/б2М в динаміці росту пухлин з різним ступенем чутливості до цитостатику може бути важливим критерієм розвитку лікарської резистентності в умовах іn vivo. Саме цій проблемі – дослідженню змін протеїназно-інгібіторного балансу при рості пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину, присвячена дана робота.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відповідності з планом науково-дослідної роботи інституту за темами: “Вивчення біологічних особливостей пухлинного процесу при формуванні фенотипу лікарської резистентності” (2000–2004 рр., державний реєстраційний № 0101U000670), “Роль гомоцистеїну в процесах формування лікарської резистентності пухлин до дії цитотоксичних препаратів” (2004–2007 рр., державний реєстраційний № 0104U006131).
Мета дослідження. Дослідити зміни протеолітичної активності та вмісту основних інгібіторів протеїназ (плазма крові та пухлинна тканина) при рості експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину.
Задачі дослідження.
1. Вивчити кінетику росту резистентної до цисплатину карциноми Герена.
2. Дослідити динаміку змін ПРА, вмісту б1-ІП та б2М в плазмі крові щурів при рості резистентної до цисплатину карциноми Герена.
3. Вивчити кінетику росту та інтенсивність метастазування карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
4. Дослідити динаміку змін ПРА, вмісту б1-ІП та б2М в плазмі крові мишей при рості карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
5. Дослідити динаміку змін ПРА та вмісту б1-ІП у тканині карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
6. Вивчити зміни протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині при рості карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
7. Проаналізувати кореляційні залежності між зміною рівнів ПРА, вмісту б1-ІП і б2М та кінетикою росту експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину.
Об’єкт дослідження – миші лінії С57BL/6 з перещепленою карциномою легені Льюїс (вихідного та резистентних до цисплатину підштамів); щури лінії Вістар з перещепленою карциномою Герена (вихідного та резистентного до цисплатину штамів).
Предмет дослідження – індукована резистентність до цисплатину, протеолітична активність та вміст основних інгібіторів протеїназ (б1-ІП та б2М), кінетика росту пухлин, метастазування.
Методи дослідження – використання експериментальних модельних систем пухлинного росту, біохімічні, статистичні.
Наукова новизна. Вперше експериментально доведено, що формування резистентності карциноми Герена та карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики пухлинного росту: пролонгацією латентного періоду росту пухлини та підвищенням швидкості її росту в експоненційній фазі. Встановлено, що зміна кінетики росту пухлин асоціюється з підвищенням рівнів ПРА і б1-ІП та зниженням рівня б2М в плазмі крові.
Вперше виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом резистентної карциноми Герена та рівнями ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001) і б1-ІП (rho = 0,67; p = 0,000002) в плазмі крові. Пряма кореляційна залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) і б1-ІП (rho = 0,65; p = 0,001) в плазмі крові виявлена також при рості карциноми легені Льюїс за умов розвитку резистентності до дії цисплатину. Аналогічний кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) і б1-ІП (rho = 0,76; p = 0,0001) був виявлений безпосередньо і в пухлинній тканині.
Вперше за співвідношенням рівнів ПРА/б1-ІП та ПРА/б2М в плазмі крові тварин з різними за чутливістю до цисплатину пухлинами виявлено, що розвиток резистентності карциноми Герена та карциноми легені Льюїс до цитостатику супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в напрямку підвищення рівня ПРА. Показано, що при рості резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс (LLC-27) в пухлинній тканині значно підвищується рівень ПРА та знижується рівень б1-ІП у порівнянні з такими у вихідній пухлині. Виявлено асоціативний зв’язок між змінами протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині при розвитку резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину.
Практичне значення результатів дослідження. Особливості протеїназно-інгібіторного балансу, виявлені в динаміці росту пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину в плазмі крові та пухлинній тканині, можуть бути використані для подальшої розробки методів оцінки чутливості злоякісних пухлин до дії даного цитостатику. Одержані дані можуть також бути підґрунтям для пошуку шляхів профілактики метастазування через вплив на систему протеолізу.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто поставлена мета роботи, сформульовані основні завдання і налагоджені методи дослідження. Автором зібрана та проаналізована сучасна наукова література за темою дисертації, самостійно виконані наукові дослідження, проведено аналіз первинного матеріалу, статистичну обробку отриманих даних. Автором проведено теоретичне узагальнення результатів роботи, сформульовані основні положення і висновки дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені та обговорені на: VI конференції молодих онкологів України (Київ, 2003); ІІ науково-практичній конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології” (Київ, 2005); ІІІ з’їзді онкологів та радіологів СНД (Мінськ, Білорусія, 2004); 18 European association for cancer research (Інсбрук, Австрія, 2004); International Student Congress of Medical Sciences (Гронінген, Нідерланди, 2005); всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів”, (Київ, 2006); International Medical Students’ Congress in Novi Sad (Сербія, 2006); 17 European Student’s Conference (Берлін, Німеччина, 2006); IV з’їзді онкологів та радіологів СНД (Баку, Азербайджанська Республіка, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 3 статті у провідних фахових журналах, рекомендованих ВАК України та 9 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних з’їздів та конференцій. Отримано 1 патент на винахід в Україні.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 148 сторінках друкованого тексту, складається із вступу, огляду літератури, 6-ти розділів, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел. Робота ілюстрована 11 таблицями та 36 рисунками. Список цитованої літератури налічує 215 першоджерел, у тому числі 195 зарубіжних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали та методи дослідження. В дослідженнях використано 478 мишей-самців лінії С57Bl/6 та 140 щурів-самців лінії Вістар, які були отримані з розплідника віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Утримання тварин та робота з ними проводилися у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил виконання робіт з експериментальними тваринами.
Штами карциноми Герена та карциноми легені Льюїс були отримані з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Перещеплення експериментальних пухлин здійснювали загальноприйнятим методом. Вироблення резистентності пухлин до цисплатину досягали шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин, які одержували від тварин, котрим було проведено курс ін’єкцій цитостатику.
Після перещеплення суспензії пухлинних клітин тварини були поділені на дві групи: контрольну і дослідну. Цисплатин (“Ebewe”, Австрія) вводили тваринам дослідної групи на 7 добу після перещеплення пухлини в дозі 1,2 мг/кг внутрішньочеревинно через день – всього п’ять ін’єкцій. Тваринам контрольної групи за аналогічною схемою вводили стерильний фізіологічний розчин. Пухлини дослідної групи використовували для приготування суспензії клітин, які перещеплювали тваринам другого пасажу. В експериментах з карциномою Герена було проведено 12 послідовних перещеплень, в експериментах з карциномою легені Льюїс – 27. Вивчення кінетики росту пухлин та визначення показників системи протеолізу проводили у тварин контрольних груп.
Дослідження на щурах з кариномою Герена були проведені на 2 групах тварин: 1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному Герена (Guerin carcinoma, (GC));
2 група – тварини, яким було перещеплено карциному Герена, попередньо проведену через 12 пасажів на щурах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (GC/R).
В серії досліджень на мишах з кариномою легені Льюїс використовували 4 групи тварин:
1 група – тварини, яким було перещеплено вихідну карциному легені Льюїс (Lewis lung carcinoma, LLC).
2 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 9 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC- 9).
3 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 19 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-19).
4 група – тварини, яким було перещеплено карциному легені Льюїс, попередньо проведену через 27 пасажів на мишах, котрим проводили послідовні введення цисплатину (LLC-27).
Таким чином, в експериментах з карциномою легені Льюїс були використані пухлинні підштами, отримані на різних етапах формування резистентності: LLC-9 (початковий етап), LLC-19 (проміжний етап), LLC-27 (кінцевий етап). В експериментах з карциномою Герена був використаний пухлинний підштам, отриманий на кінцевому етапі формування резистентності до цисплатину (GC/R).
Аналіз кінетики пухлинного росту проводили для кожної тварини за допомогою математичної моделі Вейбула росту гетерогенних пухлин (Weibull W, Sweden S., 1951). Кінетичні параметри росту пухлини визначали для кожної тварини контрольної групи за кінетичними кривими росту, які розраховували методом нелінійної регресії з використанням програми “Microcal Origin 7.0”.
Параметр “а” відображає швидкість росту цілісної пухлини в експоненційній фазі росту. Параметр “tlag” – латентний період росту первинної пухлини. Для аналізу динаміки змін кількості метастазів карциноми легені Льюїс використовували параметр “в” – швидкість метастазування, який характеризує темпи утворення метастатичних вузлів.
Визначення показників системи протеолізу проводили в плазмі крові тварин та пухлинній тканині. Для отримання плазми крові в якості антикоагулянта був використаний 3,8% розчин цитрату натрію в пропорції 9:1. Гомогенат пухлини готували на 0,05М трис-НСl буфері (рН 7,4).
ПРА плазми крові (мкмоль арг/хв на л плазми) чи тканини пухлини (мкмоль арг/хв на г білка) визначали за розщепленням аргінінвмісного лужного білка протамінсульфату спектрофотометричним методом К.М. Веремеєнка (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Принцип методу ґрунтується на визначенні пептидів, що містять аргінін, які відщеплюються від протамінсульфату протеолітичними ферментами пухлинної тканини чи плазми крові, що дозволяє визначати сумарну активність нейтральних серинових протеїназ. Вміст б1-ІП у плазмі крові (г/л) та тканині пухлини (мкг/мг тканини) визначали за здатністю останнього пригнічувати гідроліз трипсином синтетичного субстрата N- бензоїл -DL-аргінін-p-нітроаніліда (БАПНА).
Вміст б2М в плазмі крові (г/л) визначали за здатністю інгібітора утворювати з трипсином активний комплекс, який розщеплює синтетичний субстрат БАПНА, але є нечутливим до інгібітора з бобів сої (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988). Вміст білка в досліджуваних зразках визначали за методом Lowry O.H. та співавт. (1951).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
На першому етапі дослідження доцільно було переконатися, чи дійсно отримані шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин підштами карциноми Герена та карциноми легені Льюїс є резистентними до цисплатину. Дослідження показали, що у мишей із карциномою легені Льюїс по мірі зростання курсів введення цисплатину відмічали поступове зменшення впливу цитостатика на ріст первинної пухлини та її метастазування (табл. 1).
Таблиця 1
Протипухлинний та антиметастатичний ефект цисплатину при рості карциноми легені Льюїс (28 доба після перещеплення пухлини)
| Групи тварин | Діаметр первинної пухлини (мм) (n=10) | Гальмування росту первинної пухлини (%) | Середня кількість метастазів на тварину (n=10) | Зменшення кількості легеневих метастазів (%) | |
| LLC | контроль | 14,0 ± 0,3 | - | 24,2 ± 2,1 | - |
| цисплатин | 7,6 ± 0,5# | 46 | 8,6 ± 0,9# | 64,5 | |
| LLC-9 | контроль | 14,5 ± 0,6 | - | 20,2 ± 1,4 | - |
| цисплатин | 10,7 ± 0,6*, # | 26 | 10,8 ± 0,6# | 46 | |
| LLC-19 | контроль | 13,5 ± 0,5 | - | 27,6 ± 2,7 | - |
| цисплатин | 11,5 ± 0,8* | 15 | 20,4 ± 1,3# | 26 | |
| LLC-27 | контроль | 13,9 ± 0,5 | - | 29,8 ± 1,4* | - |
| цисплатин | 13,5 ± 0,6* | 3 | 26,4 ± 2,2 | 11 | |
* – P<0,05 у порівнянні з вихідною пухлиною;
# – P<0,05 у порівнянні з відповідним контролем.
Карцинома Герена після 12 послідовних курсів введення цисплатину також практично втратила чутливість до цитостатика: відсоток гальмування росту пухлини складав 4,2% (р>0,05), тоді як аналогічний показник в групі тварин з вихідною пухлиною досягав 95% (р<0,01).
Кінетика росту карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину. Зниження чутливості пухлин до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики їх росту. Зокрема, для резистентної до цисплатину карциноми Герена характерною є пролонгація латентного періоду росту пухлини в 3,3 рази та підвищення швидкості її росту в 2,0 рази в експоненційній фазі порівняно з вихідною пухлиною (р<0,05).
Кінетика росту резистентних до цисплатину підштамів карциноми легені Льюїс також мала суттєві відмінності порівняно з такою у вихідній пухлині (рис.1).
Аналіз кінетичних параметрів росту карциноми легені Льюїс свідчить, що для пухлин з середнім і високим ступенем резистентності до цисплатину (LLC-19 та LLC-27) характерним є пролонгація латентного періоду їх росту (в 2,0 рази) та підвищення швидкості росту в експоненційній фазі (в 3,4 та 3,7 рази, відповідно). Цікаво, що для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) такі зміни не характерні.
Незважаючи на тривалу пролонгацію латентного періоду росту пухлин LLC-19 та LLC-27, швидкість їх росту в експоненційній фазі є значно вищою порівняно з пухлиною LLC, що, на нашу думку, нівелює ефект затримки латентного періоду росту даних пухлин та призводить до швидкого наростання пухлинної маси.
Таким чином, при співставленні кінетики росту підштамів карциноми Герена та карциноми легені Льюїс, які були отримані на кінцевих строках формування резистентності до цисплатину (GC/R та LLC-27), виявлено, що для обох експериментальних пухлин характерним є пролонгація латентного періоду росту та підвищення швидкості росту пухлин в експоненційній фазі.
Формування резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжувалося також зміною інтенсивності її метастазування: статистична обробка результатів виявила підвищення середньої кількості метастазів на термінальній фазі росту пухлини LLC-27 (p<0,05) порівняно з вихідною пухлиною (табл. 1). Аналіз динаміки змін швидкості метастазування при зниженні чутливості карциноми легені Льюїс до цисплатину свідчить про його неоднонаправлені зміни: від зростання (на 18,2%; p<0,05) до зниження (на 20,9%; p<0,001).
Таким чином, кінетика росту та інтенсивність метастазування карциноми легені Льюїс визначається ступенем її резистентності: для пухлин з середнім і високим ступенем резистентності (LLC-19 та LLC-27) характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 1,9 та 2,0 рази, відповідно), підвищення швидкості росту в експоненційній фазі (в 3,3 та 3,7 рази, відповідно) та зростання інтенсивності метастазування (пухлина LLC-27). Для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) такі зміни не є характерними.
Протеолітична активність та вміст основних інгібіторів протеїназ у плазмі крові тварин при рості пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину. Визначення рівнів ПРА, б1-ІП і б2М в плазмі крові щурів з вихідною та резистентною до цисплатину карциномою Герена проводили у динаміці росту пухлини: на 9, 18, 21, 25 добу після перещеплення.
В плазмі крові щурів із резистентною до цисплатину карциномою Герена в латентний період її росту виявлено зниження рівня ПРА на 32,2% порівняно з аналогічним показником у плазмі крові тварин із вихідною пухлиною (табл. 2). В експоненційній фазі росту (період з 18 по 21 добу включно) резистентної пухлини відмічено значне зростання рівня ПРА в плазмі крові (в 2,4 та 2,3 рази, відповідно; p<0,05) порівняно з таким у плазмі крові тварин із вихідною пухлиною. Аналогічні зміни продовжували відмічати на термінальній фазі росту пухлин: величина ПРА в плазмі крові тварин з резистентною пухлиною в 2,2 рази перевищувала таку в плазмі крові тварин з вихідною пухлиною (p<0,05).
Таблиця 2
ПРА (мкмоль арг/хв на л) у плазмі крові щурів при рості карциноми Герена з індукованою резистентністю до цисплатину
| Пухлина | 0 доба | 9 доба | 18 доба | 21 доба | 25 доба |
| GC | 139,0±5,0 | 121,0±6,0 | 99,0±3,0* | 108,0±4,0* | 151,0±9,0 |
| GC/R | 139,0±5,0 | 82,0±8,0*, # | 233,0±19,0*, # | 249,0±24,0*, # | 329,0±15,0*, # |
GC – вихідна карцинома Герена, GC/R – резистентна до цисплатину карцинома Герена;
* – Р<0,05 у порівнянні з інтактним контролем;
# – Р<0,05 у порівнянні з відповідним показником у групі з вихідною пухлиною.
Таким чином, аналіз отриманих даних свідчить, що характерною особливістю резистентної до цисплатину карциноми Герена є суттєве підвищення рівня ПРА в експоненційній та термінальній фазах росту пухлини порівняно з аналогічним показником в групі тварин з вихідною пухлиною (p<0,05).
Зміни протеолітичного потенціалу плазми крові щурів з резистентною до цисплатину карциномою Герена супроводжуються також суттєвими змінами рівнів основних інгібіторів протеїназ, які визначають антипротеолітичний потенціал. Зокрема, в експоненційній фазі росту резистентної карциноми Герена в плазмі крові тварин було виявлено підвищення рівня б1-ІП (в середньому на 28,5%) порівняно з таким у тварин з вихідною пухлиною (p<0,05).
При співставленні рівнів ПРА та б1-ІП в експоненційній фазі росту вихідної та резистентної до цисплатину карциноми Герена виявлено однонаправлений характер змін даних показників: зі зниженням величини ПРА з деяким запізненням у часі відмічали також і зниження рівня б1-ІП у плазмі крові тварин із вихідною пухлиною; підвищення рівня ПРА супроводжувалось паралельним зростанням вмісту інгібітора в плазмі крові тварин з резистентною пухлиною. На думку дослідників (Акбашева О.Е. и соавт., 1999), зростання рівня б1-ІП можна розглядати як адекватну реакцію організму на підвищення ПРА, спрямовану проти деструкції тканин та поширеності пухлинного процесу. Зрозуміло, що для нейтралізації високого рівня ПРА в плазмі крові щурів з резистентною пухлиною, необхідним є підвищення вмісту інгібітора, що і спостерігається в експерименті. З іншого боку, підвищення рівня б1-ІП як білка гострої фази запалення є несприятливим фактором перебігу захворювання і тому характеризує резистентну пухлину як більш агресивнішу.
Динаміка змін б2М – універсального інгібітора протеолітичних ферментів, в плазмі крові тварин з вихідною та резистентною до цисплатину карциномою Герена має однонаправлений характер, який проявляється в зниженні рівня інгібітора. Однак, було встановлено, що зниження ступеня чутливості пухлини до цитостатика супроводжується статистично достовірним зниженням рівня б2М в латентний період росту (на 16,7%) та в експоненційній фазі росту пухлини (на 18,0%).
Визначення протеїназно-інгібіторного балансу проводили шляхом обчислення співвідношення рівнів ПРА/б1-ІП та ПРА/б2М. Величину даного співвідношення в плазмі крові щурів із групи інтактного контролю приймали за одиницю і обчислювали на основі процентного співвідношення, яке для кожного з показників у групі контролю дорівнювало 100% (табл. 3).
Результати дослідження показали, що характерною особливістю резистентної до цисплатину карциноми Герена є зміни в направленості протеїназно-інгібіторного балансу в експоненційній та термінальній фазах росту пухлини (табл. 3). Зокрема, в плазмі крові щурів із вихідною карциномою Герена зниження величини ПРА/б1-ІП відносно рівня інтактного контролю асоціюється з пригніченням протеолізу, очевидно, за рахунок інгібування активності протеолітичних ферментів. На противагу наведеним даним, величина співвідношення рівнів ПРА/б1-ІП в експоненційній та термінальній фазах росту резистентної пухлини в 2,0 рази (p<0,05) перевищує таку в групі тварин з вихідною пухлиною, що фактично свідчить про порушення динамічної рівноваги між протеолітичними ферментами та їх інгібітором у бік підвищення сумарної активності серинових протеїназ при розвитку резистентності карциноми Герена до цисплатину. Слід також зазначити, що величина співвідношення рівнів ПРА/б1-ІП вказує на те, що рівень б1-ІП в плазмі крові щурів з резистентною пухлиною є недостатнім для нейтралізації наявної ПРА.
Величина співвідношення рівнів ПРА/б2М також була значно вищою в плазмі крові щурів із резистентою до цисплатину карциномою Герена (табл.3), що свідчить про суттєве порушення рівноваги “фермент-інгібітор” при розвитку резистентності карциноми Герена до цисплатину.
Експоненційна фаза росту резистентної до цисплатину карциноми Герена характеризувалася значним підвищенням співвідношення рівнів б1-ІП/б2М в плазмі крові порівняно з відповідним показником у групі тварин із вихідною пухлиною (табл. 3), що свідчить про істотне порушення антипротеолітичного балансу при розвитку резистентності пухлини до цисплатину.
Підсумовуючи результати проведеного фрагменту роботи, можна констатувати, що при розвитку резистентності карциноми Герена до цисплатину найбільш суттєві відмінності в кінетиці пухлинного росту та характері змін протеїназно-інгібіторного балансу були виявлені в експоненційній фазі росту пухлин.
Наступним завданням роботи було дослідження динаміки змін показників системи протеолізу в плазмі крові мишей з різними за чутливістю до цисплатину підштамами карциноми легені Льюїс. Визначення рівнів ПРА, б1-ІП і б2М в плазмі крові мишей різних груп проводили на 10, 15, 20, 25, 28 добу після перещеплення пухлини.
При зниженні чутливості пухлини до цитостатика суттєві зміни рівнів ПРА були виявлені в латентний період та експоненційній фазі росту пухлини (табл. 4).
В латентний період росту пухлини LLC-9 (як і пухлини LLC) не відмічали вірогідних змін ПРА (р>0,05) порівняно з відповідним показником інтактного контролю, тоді як для пухлин з більш низьким ступенем чутливості до цисплатину (LLC-19 і LLC-27) характерним було суттєве підвищення рівня ПРА (в 1,6 та 2,0 рази, відповідно, р<0,05). При зниженні чутливості до цисплатину карциноми легені Льюїс в експоненційній фазі її росту також відмічали зростання ПРА в плазмі крові (р<0,05). Крім того, було показано, що зміна рівнів ПРА в плазмі крові мишей із карциномою легені Льюїс в експоненційній фазі росту (на 25 добу) визначається ступенем резистентності пухлини до цисплатину: для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) характерним є незначне підвищення ПРА (в 1,4 рази), для пухлин з середнім (LLC-19) та високим (LLC-27) ступенем резистентності – значне підвищення ПРА (в 2,1 та 4,1 рази, відповідно).
Таким чином, аналіз одержаних даних свідчить про підвищення величини ПРА в плазмі крові мишей із карциномою легені Льюїс при розвитку резистентності до цисплатину: зі збільшенням ступеня резистентності пухлини до цитостатика відмічається підвищення ПРА в латентний період та експоненційній фазі росту.
Співставлення рівня б1-ІП в експоненційній фазі росту різних за чутливістю до цисплатину підштамів карциноми легені Льюїс свідчить, що зниження чутливості пухлини до цитостатика супроводжується суттєвим підвищенням рівня б1-ІП в плазмі крові тварин. Зокрема, вміст інгібітора в плазмі крові тварин із пухлиною LLC-27 на 60% перевищував значення інтактного контролю (р<0,05), тоді як для пухлин LLC і LLC-9 таких змін не виявлено. Різниця між рівнем даного інгібітора в плазмі крові тварин з пухлиною LLC та з пухлиною LLC-27 складала 58,5% (р<0,05). Відмічено асоціативний зв’язок між зростанням рівня б1-ІП в експоненційній фазі росту пухлини LLC-27 та підвищенням інтенсивності її метастазування.
Співвідношення рівнів ПРА/б1-ІП, величина якого зростає зі збільшенням ступеня резистентності карциноми легені Льюїс, вказує на те, що, незважаючи на високий рівень б1-ІП по відношенню до інтактного контролю, в плазмі крові мишей з пухлинами LLC-19 та LLC-27 спостерігається відносний дефіцит б1-ІП, тобто концентрації інгібітора недостатньо для нейтралізації наявної активності протеолітичних ферментів (табл. 5). Необхідно також зазначити, що найбільш суттєві зміни співвідношення рівнів ПРА/б1-ІП відмічаються при рості пухлини LLC-27, для якої характерним була найвища інтенсивність метастазування. Високий метастатичний потенціал пухлини LLC-27 порівняно з пухлиною LLC свідчить про підвищення її інвазивності, реалізація якої вимагає високої активності протеолітичних ферментів.
В плазмі крові мишей всіх груп на різних етапах спостереження за ростом пухлин виявлено зниження рівня б2М у порівнянні з відповідним показником у інтактних тварин. Встановлено, що підвищення ступеня резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується зниженням рівня б2М в латентний період росту пухлини. Зокрема, вміст інгібітора в плазмі крові тварин із пухлинами LLC-19 і LLC-27 знижувався відповідно на 23,3% та 30,8% у порівнянні з інтактним контролем (р<0,05). Для пухлин LLC і LLC-9 таких змін не виявлено. Вміст інгібітора в плазмі крові тварин із пухлиною LLC-27 був зниженим на 27,2% порівняно з таким у плазмі крові тварин з пухлиною LLC (р<0,05).
Зниження чутливості карциноми карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжувалось також порушенням співвідношення між рівнями ПРА та б2М в плазмі крові в бік підвищення ПРА та дефіциту інгібітора. Порушення даної рівноваги було найбільш виражене в плазмі крові мишей з пухлинами LLC-19 та LLC-27 (табл. 5).
Таким чином, співвідношення “фермент-інгібітор” при розвитку резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину свідчить про зниження рівнів б1-ІП та б2М відносно рівня активності протеолітичних ферментів.
ПРА та вміст б1-ІП у тканині карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину. Загальновідомо, що одним з можливих джерел надходження протеолітичних ферментів та їх інгібіторів у кровоносне русло може бути синтез їх злоякісними клітинами з подальшою секрецією в позаклітинний простір. За цих обставин цікаво було співставити зміни рівнів ПРА і б1-ІП в пухлинній тканині та плазмі крові мишей з вихідною та резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс.
Результати проведених досліджень свідчать, що на всіх етапах спостереження рівень ПРА в тканині пухлини LLC-27 значно перевищував такий у пухлині LLC. Так, зокрема, на 15 добу рівень ПРА в тканині пухлини LLC-27 в 61,8 рази перевищував такий у тканині пухлини LLC (р<0,001). Протягом подальших періодів спостереження за пухлинним ростом відмічали значно менше, але все ще достатньо суттєве підвищення ПРА в резистентній карциномі легені Льюїс: на 20 добу рівень ПРА в резистентній пухлині перевищував такий у вихідній у 8,6 разів (р<0,001), а на 25 добу – у 4,2 рази (р<0,001). Цілком очевидно, що такі зміни ПРА можна розглядати як одну з причин підвищення інтенсивності метастазування пухлини LLС-27, оскільки посилення протеолізу обумовлює підвищення інвазивних властивостей злоякісних клітин, а також їх міграційну здатність. В той же час, вміст б1-ІП в тканині пухлин LLС-27 був значно нижчим (на 49,5%) у порівнянні з таким у тканині пухлин LLC (р<0,001).
Співставлення рівнів ПРА і б1-ІП в тканині пухлини і плазмі крові на окремих етапах пухлинного росту, на нашу думку, може бути достатньо інформативним для розуміння ролі системи протеолізу в пухлинній прогресії. Така думка виглядає переконливою завдяки співставленню рівня ПРА і вмісту б1-ІП на 25 добу після перещеплення пухлин (період масової появи метастазів у легенях тварин). Показово, що саме в цей період у тварин з вихідною карциномою легені Льюїс спостерігається підвищення рівнів ПРА і б1-ІП у тканині пухлини, і навпаки, зниження рівнів ПРА та б1-ІП у плазмі крові. Що стосується змін ПРА і рівня б1-ІП у тварин з резистентними пухлинами, то тут і в тканині пухлини, і в плазмі крові, має місце суттєве наростання ПРА і рівня б1-ІП.
Таким чином, порівняння динаміки змін показників системи протеолізу в організмі мишей з вихідною і резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс свідчить, що і в тканині пухлини LLC-27, і в плазмі крові мишей з відповідною пухлиною, рівні ПРА є значно вищими порівняно з такими при рості вихідної пухлини LLC. Таке наростання ПРА в пухлинах LLC-27 призводить до зміщення протеїназно-інгібіторного балансу в бік посилення протеолізу та дефіциту основних інгібіторів протеїназ, що, в свою чергу, обумовлює підвищення інтенсивності метастазування даних пухлин.
В підтримку цього твердження свідчить також величина співвідношення рівнів ПРА/б1-ІП у пухлинній тканині (табл. 6).
Відповідно, можна констатувати, що розвиток резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується зміщенням протеїназно-інгібіторного балансу в тканині пухлини у бік підвищення ПРА. Як було зазначено вище, аналогічні зміни спостерігаються і в плазмі крові тварин. Тому можна припустити, що значні відмінності протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові тварин з пухлинами LLC та LLC-27 обумовлені порушенням рівноваги між протеїназами та їх інгібіторами безпосередньо в тканині пухлини.
Кореляційні залежності між зміною рівнів ПРА, б1-ІП і б2М та кінетикою росту експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину. Аналіз кореляційних зв’язків між пухлинним процесом (динаміка змін об’єму пухлини) та динамікою змін показників системи протеолізу показав відсутність кореляційних залежностей між об’ємом пухлини та ПРА чи рівнями б1-ІП і б2М в плазмі крові щурів з вихідною карциномою Герена. Натомість, в плазмі крові щурів з резистентною до цисплатину карциномою Герена виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом пухлини та ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001), між об’ємом пухлини і рівнем б1-ІП (r = 0,67; p = 0,000002). Пряма кореляційна залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) і б1-ІП
(rho = 0,65; p = 0,001) в плазмі крові виявлена також при рості карциноми легені Льюїс при розвитку резистентності до цисплатину. В пухлинній тканині також встановлено кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) і б1-ІП (rho = 0,76; p = 0,0001).
ВИСНОВКИ
На експериментальних моделях карциноми Герена та карциноми легені Льюїс встановлено, що формування резистентності пухлин до цисплатину асоціюється зі змінами кінетики їх росту та супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині.
1. Виявлено, що для резистентної до цисплатину карциноми Герена характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 3,3 рази) та підвищення швидкості її росту в експоненційній фазі (в 2,0 рази) порівняно з вихідною пухлиною.
2. Встановлено, що в експоненційній фазі росту резистентної до цисплатину карциноми Герена в плазмі крові щурів зростають рівні ПРА (в 2,4 рази) і б1-ІП (на 28,5%) та дещо знижується (на 18,0%) рівень б2М порівняно з такими у тварин з вихідною пухлиною.
3. Встановлено, що кінетика росту та інтенсивність метастазування резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс визначається ступенем її резистентності: для пухлин з середнім і високим ступенем резистентності (LLC-19 та LLC-27) характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 2,0 рази), підвищення швидкості росту в експоненційній фазі (в 3,4 і 3,7 рази, відповідно) та підвищення інтенсивності метастазування (LLC-27). Для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) такі зміни не є характерними.
4. Встановлено, що в експоненційній фазі росту резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс зміна рівнів ПРА в плазмі крові визначається ступенем резистентності: для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) характерним є незначне підвищення ПРА (в 1,4 рази), для пухлин з середнім (LLC-19) та високим (LLC-27) ступенем резистентності – значне підвищення ПРА (в 2,1 та 4,1 рази, відповідно). Розвиток резистентності пухлини до цитостатику супроводжується підвищенням рівня б1-ІП (на 58,5% для пухлини LLC-27) в експоненційній фазі її росту та зниженням рівня б2М в латентний період росту (на 27,2% для пухлини LLC-27).
5. Показано, що при рості резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс (LLC-27) в пухлинній тканині значно підвищується рівень ПРА (в 4,2 – 61,8 рази) у порівнянні з таким у вихідній пухлині, а вміст б1-ІП, навпаки, знижується (на 49,5%).
6. Встановлено, що розвиток резистентності до цисплатину карциноми Герена та карциноми легені Льюїс супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині в бік підвищення рівня ПРА.
7. В плазмі крові щурів з резистентною до цисплатину карциномою Герена, на відміну від вихідної пухлини, виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,7) і б1-ІП (rho = 0,67). Визначено також пряму кореляційну залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42) і б1-ІП (rho = 0,65) в плазмі крові мишей з резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс (LLC-27). Аналогічний кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5) і б1-ІП (rho = 0,76) був виявлений безпосередньо і в пухлинній тканині.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Yurchenko O.V., Todor I.N., Tryndyak V.P., Tregubova N.A., Kovtonyuk O.V., Solyanik G.I., Kulik G.I., Chekhun V.F. Resistance of Guerin’s carcinoma cells to cisplatine: biochemical and morphological aspects // Exp. Oncol. – 2003. – Vol.25, № 1. – P. 64 – 68. (Особистий внесок здобувача: підібрано і проаналізовано наукову літературу за темою статті, здійснено аналіз та математичну обробку результатів дослідження, підготовлено роботу до друку).
2. Chekhun V.F., Kovtonyuk O.V., Todor I.N., Kulik G.I. Total proteolytic activity and levels of the main proteinases inhibitors in blood plasma of mice bearing Lewis lung carcinoma upon development of resistance to cisplatin // Exp. Oncol. – 2005. – Vol.27, №4. – P. 286 – 289. (Особистий внесок здобувача: проведено експериментальну частину роботи, самостійно визначено показники протеолітичної системи, вивчено кінетику росту пухлин, проведено статистичну обробку результатів, проаналізовано результати дослідження та підготовлено публікацію до друку).
3. Тодор И.Н., Кузьменко А.П., Трегубова Н.А., Трындяк В.П., Ковтонюк О.В., Кунская Л.Н., Стеблянко Т.И., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Лекарственная резистентность опухолей и метастазирование в эксперименте // Укр. мед. альманах. – 2006. – Т. 9, №4. – С.111 – 112. (Особистий внесок здобувача: проведено визначення протеолітичної активності та дослідження кінетики росту первинних пухлин).
4. Патент на винахід України 76922, (51) МПК (2006) G01N 33/50 A61K31/282 (2006.01). Спосіб виявлення чутливості злоякісних пухлин до дії цисплатину // Чехун В.Ф., Ковтонюк О.В., Тодор І.М., Кулик Г.І.. Заявл. 02.06.2005; Опубл. 15.09.2006. – Бюл. №9. – 8 с. (Особистий внесок здобувача: проведено планування схеми експерименту, самостійно визначено протеолітичну активність, проведено дослідження ефективності протипухлинної хіміотерапії, здійснено аналіз та математичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку).
5. Ковтонюк О.В., Призимирська Т.В., Тодор І.М., Кулик Г.І., Чехун В.Ф. Дослідження активності серинових протеїназ та їх інгібіторів в плазмі крові мишей в динаміці розвитку карциноми 3LL з індукованою резистентністю до цисплатини // Тези VI конференції молодих онкологів України “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології”, 4–5 грудня 2003 р. – Київ. – 2003. – С. 24.
6. Тодор И.Н., Трегубова Н.А., Трындяк В.П., Ковтонюк О.В., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Особенности метаболизма и ультраструктуры метастазирующей карциномы легких Льюис при формировании резистентности к цисплатине // Материалы III Съезда онкологов и радиологов СНГ, 25 – 28 Мая 2004. – Минск. – 2004. – Ч. 1. – С.351.
7. Chekhun V.F., Kulik G.I., Todor I.N., Kovtonyuk O.V. Proteolytic activity and antiproteases at metastasis of cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant Lewis lung carcinoma // Abstract Book. 18 European association for cancer research, 3 – 6 July 2004. – Innsbruck, Austria. – 2004. – P. 320.
8. Kovtonyuk O.V., Chekhun V.F.,Todor I.N., Kulyk G.I. Character of changes in the total proteolytic activity and the content of main proteinase inhibitors in blood plasma of C57Bl/6 mice upon the cisplatin resistance development of Lewis lung carcinoma // International Student Congress of Medical Sciences, 15 – 18 June, 2005. – Groningen, The Netherlands. – 2005. – P. 54.
9. Ковтонюк О.В., Тодор І. М., Кулик Г. И., Чехун В.Ф. Протеолітична активність у плазмі крові мишей з карциномою легені Льюїс та щурів з карциномою Герена при формуванні резистентності до цисплатину // Тези ІІ науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології”, 22 грудня 2005 р. – Київ. – 2005. – С. 44.
10. Kovtonyuk O.V., Todor I.N., Kulik G.I., Chekhun V.F. Proteolytic activity and content of alpha-1-proteinase inhibitor upon the growth of mice with Lewis lung carcinoma in the blood plasma and tumor tissue // International Medical Students’ Congress Novi Sad. – Serbia. – 2006. – P. 20.
11. Kovtonyuk O.V., Chekhun V.F., Todor I.N., Kulyk G.I. Proteolytic activity and content of alpha-1-proteinase inhibitor in cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant Lewis lung carcinoma // 17 European Student’s Conference: Abstract Book, 8 – 12 October, 2006, – Berlin, Germany / European Journal of Medical Research. – 2006. – Vol. 11. – P. 123 – 124.
12. Ковтонюк О.В., Чехун В.Ф., Тодор І.М., Кулик Г.І. Протеолітична активність та вміст б1-інгібітору протеїназ в плазмі крові та тканині пухлини мишей при формуванні резистентності карциноми LLC до цисплатину // Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю: “Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів”, 2 – 3 листопада 2006 р., Київ /Онкологія. – 2006. – Т. 5. № 2. – С. 177 – 178.
13. Чехун В.Ф., Ковтонюк О.В., Кулик Г.И., Тодор И.Н. Развитие лекарственной резистентности in vivo и активность компонентов системы протеолиза // Материалы съезда IV съезда онкологов и радиологов СНГ, 2006. – Баку: НЦО Минздрава Азербайджанской Республики, 2006. – С. 50.
АНОТАЦІЯ
Ковтонюк О.В. Зміни протеїназно-інгібіторного балансу при рості злоякісних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 – онкологія. – Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ – 2008.
Дисертаційна робота присвячена вивченню особливостей протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині в динаміці росту карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
В експериментах in vivo було показано, що зниження чутливості злоякісних пухлин до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики пухлинного росту: пролонгацією латентного періоду росту та підвищенням швидкості росту в експоненційній фазі. Встановлено, що зміна кінетики росту пухлин асоціюється з підвищенням сумарної протеолітичної активності (ПРА) і рівня б1-інгібітора протеїназ (б1-ІП) та зниженням рівня б2-макроглобуліну (б2М) в плазмі крові тварин. Виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом резистентних пухлин та рівнями ПРА і б1-ІП в плазмі крові та пухлинній тканині. Cпіввідношення рівнів ПРА/б1-ІП у плазмі крові та пухлинній тканині свідчить про суттєве зміщення протеїназно-інгібіторного балансу в бік підвищення ПРА при розвитку резистентності пухлин до цисплатину.
Показано, що формування резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується підвищенням інтенсивності метастазування на фоні підвищення ПРА в плазмі крові та пухлинній тканині.
Ключові слова: протеїназно-інгібіторний баланс, серинові протеїнази, протеолітична активність, б1-інгібітор протеїназ, б2-макроглобулін, лікарська резистентність, цисплатин, карцинома Герена, карцинома легені Льюїс, кінетика пухлинного росту, метастазування.
АННОТАЦИЯ
Ковтонюк О.В. Изменения протеиназно-ингибиторного баланса при росте злокачественных опухолей с индуцированной резистентностью к цисплатину. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 – онкология. – Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Украины, Киев – 2008.
Диссертационная работа посвящена изучению особенностей протеиназно-ингибиторного баланса в динамике роста карциномы Герена и карциномы легкого Льюис с индуцированной резистентностью к действию противоопухолевого препарата цисплатина. Цель работы состояла в изучении общей протеолитической активности (ПРА) и уровня основных ингибиторов протеолитических ферментов – б1-ингибитора протеиназ (б1-ИП) и б2-макроглобулина (б2М) в плазме крови и опухолевой ткани экспериментальных животных, которым были перевиты подштаммы карциномы Герена и карциномы легкого Льюис с различной чувствительностью к цисплатину.
Эксперименты были проведены на 140 крысах линии Вистар и 478 мышах линии C57Bl/6. Формирование резистентности к цисплатину проводили путем последовательных перевивок клеток опухоли, полученных от животных, которым вводили цитостатик.
В серии экспериментов с карциномой легкого Льюис использовали опухолевые подштаммы, полученные на разных этапах формирования резистентности: LLC-9 (начальный этап), LLC-19 (промежуточный этап), LLC-27 (конечный этап). В экспериментах с карциномой Герена использовали опухолевый подштамм, полученный на конечном этапе формирования резистентности к цисплатину (GC/R). В качестве контрольных групп использовали животных с исходными (чувствительными к действию цисплатина) опухолями – карциномой Герена (GC) и карциномой легкого Льюис (LLC).
Было показано, что формирование резистентности к цисплатину карциномы Герена и карциномы легкого Льюис сопровождается существенными изменениями кинетики опухолевого роста, проявляющимися в пролонгации латентного периода роста (в 3,3 раза для GC/R; в 2,0 раза для LLC-19 и LLC-27) с последующим увеличением скорости роста в экспоненциальной фазе (в 2,0 раза для GC/R; в 3,3 и 3,7 раза для LLC-19 и LLC-27, соответственно). Установлено, что изменение кинетики роста карциномы Герена и карциномы легкого Льюис при развитии их резистентности к цисплатину сопровождается повышением ПРА и увеличением уровня основного ингибитора протеиназ – б1-ИП в плазме крови. В частности, выявлено прямую корреляционную зависимость между объёмом резистентной карциномы Герена и уровнем ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001), а также объёмом опухоли и уровнем б1-ИП (rho = 0,67; p = 0,000002) в плазме крови. Прямая корреляционная зависимость между объёмом опухоли и уровнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) и б1-ИП (rho = 0,65; p = 0,001) обнаружена также в плазме крови мышей с резистентной к цисплатину карциномой легкого Льюис (LLC-27). Необходимо отметить, что аналогичная корреляционная зависимость между объёмом опухоли и уровнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) и б1-ИП (rho = 0,76; p = 0,0001) была выявлена непосредственно и в опухолевой ткани (LLC-27).
Соотношение уровней ПРА/б1-ИП свидетельствует о существенном смещении равновесия между активностью протеолитических ферментов и уровнем их эндогенного ингибитора (в сторону увеличения ПРА) в условиях развития резистентности карциномы Герена и карциномы легкого Льюис к цисплатину, несмотря на то, что уровень б1-ИП в плазме крови животных с резистентными опухолями значительно превышает такой в плазме крови животных с исходными опухолями. Таким изменениям протеиназно-ингибиторного баланса в плазме крови предшествуют изменения уровней ПРА и б1-ИП в опухолевой ткани. В частности, на модели карциномы легкого Льюис показано, что уровень ПРА в ткани резистентной опухоли (LLC-27) значительно превышал такой в ткани исходной опухоли (LLC), в то время как уровень ингибитора в ткани резистентной опухоли, наоборот, был снижен.
Развитие исходной карциномы легкого Льюис и ее резистентных подштаммов сопровождалось снижением концентрации б2М в плазме крови. Соотношение ПРА/б2М свидетельствует о более выраженом дефиците ингибитора в плазме крови животных с резистентными к цисплатину подштамами опухолей. Подобное изменение протеиназно-ингибиторного баланса ассоциируется с увеличением интенсивности метастазирования карциномы легкого Льюис при снижении ее чувствительности к цисплатину (LLC-27).
Ключевые слова: протеиназно-ингибиторный баланс, сериновые протеиназы, протеолитическая активность, б1-ингибитор протеиназ, б2-макроглобулин, лекарственная резистентность, цисплатин, карцинома Герена, карцинома легкого Льюис, кинетика опухолевого роста, метастазирование.
ANNOTATION
Kovtonyuk O.V. Сhange of the proteinase-antiproteinase balance during growth of malignant tumours with induced cisplatin resistance. – Manuscript.
Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 14.01.07 – Oncology. – R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Scienсes of Ukraine, Kyiv – 2008.
The thesis is devoted to the study of the proteinase-antiproteinase balance in the dynamics of the growth of Guerin carcinoma and Lewis lung carcinoma with induced cisplatin resistance.
The decrease of tumour cisplatin sensitivity in vivo was shown to be accompanied by significant changes of the kinetics of tumour growth: prolonged latent growth period and increase of exponential phase growth rate. The change of the growth kinetics has been found to associate with the elevation of total proteolytic activity (TРА) as well as the level of б1-proteinase inhibitor (alpha1PI) and decrease б2-macroglobuline (alpha2M) level in blood plasma. A direct correlation dependence of the volume of resistant Guerin carcinoma and Lewis lung carcinoma, TPA and alpha1PI levels in blood plasma and tumour tissue is determined. The value of TPA/alpha1PI ratio has shown that the development of tumour cisplatin resistance is accompanied by the imbalance between proteolytic and antiproteolytic activities shifted to the TPA increase in blood plasma and tumour tissue.
The development of Lewis lung carcinoma cisplatin drug resistance is accompanied by the increase of its metastasis together with the elevation of TPA in blood plasma.
Key words: proteinase-antiproteinase balance, serine proteinases, total proteolytic activity, б1-proteinase inhibitor, б2-macroglobuline, drug resistance, cisplatin, Guerin carcinoma, Lewis lung carcinoma, tumour growth kinetics, metastasis.
Співставлення рівнів ПРА і б1-ІП в тканині пухлини і плазмі крові на окремих етапах пухлинного росту, на нашу думку, може бути достатньо інформативним для розуміння ролі системи протеолізу в пухлинній прогресії. Така думка виглядає переконливою завдяки співставленню рівня ПРА і вмісту б1-ІП на 25 добу після перещеплення пухлин (період масової появи метастазів у легенях тварин). Показово, що саме в цей період у тварин з вихідною карциномою легені Льюїс спостерігається підвищення рівнів ПРА і б1-ІП у тканині пухлини, і навпаки, зниження рівнів ПРА та б1-ІП у плазмі крові. Що стосується змін ПРА і рівня б1-ІП у тварин з резистентними пухлинами, то тут і в тканині пухлини, і в плазмі крові, має місце суттєве наростання ПРА і рівня б1-ІП.
Таким чином, порівняння динаміки змін показників системи протеолізу в організмі мишей з вихідною і резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс свідчить, що і в тканині пухлини LLC-27, і в плазмі крові мишей з відповідною пухлиною, рівні ПРА є значно вищими порівняно з такими при рості вихідної пухлини LLC. Таке наростання ПРА в пухлинах LLC-27 призводить до зміщення протеїназно-інгібіторного балансу в бік посилення протеолізу та дефіциту основних інгібіторів протеїназ, що, в свою чергу, обумовлює підвищення інтенсивності метастазування даних пухлин.
В підтримку цього твердження свідчить також величина співвідношення рівнів ПРА/б1-ІП у пухлинній тканині (табл. 6).
Відповідно, можна констатувати, що розвиток резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується зміщенням протеїназно-інгібіторного балансу в тканині пухлини у бік підвищення ПРА. Як було зазначено вище, аналогічні зміни спостерігаються і в плазмі крові тварин. Тому можна припустити, що значні відмінності протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові тварин з пухлинами LLC та LLC-27 обумовлені порушенням рівноваги між протеїназами та їх інгібіторами безпосередньо в тканині пухлини.
Кореляційні залежності між зміною рівнів ПРА, б1-ІП і б2М та кінетикою росту експериментальних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину. Аналіз кореляційних зв’язків між пухлинним процесом (динаміка змін об’єму пухлини) та динамікою змін показників системи протеолізу показав відсутність кореляційних залежностей між об’ємом пухлини та ПРА чи рівнями б1-ІП і б2М в плазмі крові щурів з вихідною карциномою Герена. Натомість, в плазмі крові щурів з резистентною до цисплатину карциномою Герена виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом пухлини та ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001), між об’ємом пухлини і рівнем б1-ІП (r = 0,67; p = 0,000002). Пряма кореляційна залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) і б1-ІП
(rho = 0,65; p = 0,001) в плазмі крові виявлена також при рості карциноми легені Льюїс при розвитку резистентності до цисплатину. В пухлинній тканині також встановлено кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) і б1-ІП (rho = 0,76; p = 0,0001).
ВИСНОВКИ
На експериментальних моделях карциноми Герена та карциноми легені Льюїс встановлено, що формування резистентності пухлин до цисплатину асоціюється зі змінами кінетики їх росту та супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині.
1. Виявлено, що для резистентної до цисплатину карциноми Герена характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 3,3 рази) та підвищення швидкості її росту в експоненційній фазі (в 2,0 рази) порівняно з вихідною пухлиною.
2. Встановлено, що в експоненційній фазі росту резистентної до цисплатину карциноми Герена в плазмі крові щурів зростають рівні ПРА (в 2,4 рази) і б1-ІП (на 28,5%) та дещо знижується (на 18,0%) рівень б2М порівняно з такими у тварин з вихідною пухлиною.
3. Встановлено, що кінетика росту та інтенсивність метастазування резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс визначається ступенем її резистентності: для пухлин з середнім і високим ступенем резистентності (LLC-19 та LLC-27) характерним є пролонгація латентного періоду росту пухлини (в 2,0 рази), підвищення швидкості росту в експоненційній фазі (в 3,4 і 3,7 рази, відповідно) та підвищення інтенсивності метастазування (LLC-27). Для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) такі зміни не є характерними.
4. Встановлено, що в експоненційній фазі росту резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс зміна рівнів ПРА в плазмі крові визначається ступенем резистентності: для пухлин з низьким ступенем резистентності (LLC-9) характерним є незначне підвищення ПРА (в 1,4 рази), для пухлин з середнім (LLC-19) та високим (LLC-27) ступенем резистентності – значне підвищення ПРА (в 2,1 та 4,1 рази, відповідно). Розвиток резистентності пухлини до цитостатику супроводжується підвищенням рівня б1-ІП (на 58,5% для пухлини LLC-27) в експоненційній фазі її росту та зниженням рівня б2М в латентний період росту (на 27,2% для пухлини LLC-27).
5. Показано, що при рості резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс (LLC-27) в пухлинній тканині значно підвищується рівень ПРА (в 4,2 – 61,8 рази) у порівнянні з таким у вихідній пухлині, а вміст б1-ІП, навпаки, знижується (на 49,5%).
6. Встановлено, що розвиток резистентності до цисплатину карциноми Герена та карциноми легені Льюїс супроводжується порушенням протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині в бік підвищення рівня ПРА.
7. В плазмі крові щурів з резистентною до цисплатину карциномою Герена, на відміну від вихідної пухлини, виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,7) і б1-ІП (rho = 0,67). Визначено також пряму кореляційну залежність між об’ємом пухлини та рівнями ПРА (rho = 0,42) і б1-ІП (rho = 0,65) в плазмі крові мишей з резистентною до цисплатину карциномою легені Льюїс (LLC-27). Аналогічний кореляційний зв’язок між об’ємом резистентної до цисплатину карциноми легені Льюїс та рівнями ПРА (rho = 0,5) і б1-ІП (rho = 0,76) був виявлений безпосередньо і в пухлинній тканині.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Yurchenko O.V., Todor I.N., Tryndyak V.P., Tregubova N.A., Kovtonyuk O.V., Solyanik G.I., Kulik G.I., Chekhun V.F. Resistance of Guerin’s carcinoma cells to cisplatine: biochemical and morphological aspects // Exp. Oncol. – 2003. – Vol.25, № 1. – P. 64 – 68. (Особистий внесок здобувача: підібрано і проаналізовано наукову літературу за темою статті, здійснено аналіз та математичну обробку результатів дослідження, підготовлено роботу до друку).
2. Chekhun V.F., Kovtonyuk O.V., Todor I.N., Kulik G.I. Total proteolytic activity and levels of the main proteinases inhibitors in blood plasma of mice bearing Lewis lung carcinoma upon development of resistance to cisplatin // Exp. Oncol. – 2005. – Vol.27, №4. – P. 286 – 289. (Особистий внесок здобувача: проведено експериментальну частину роботи, самостійно визначено показники протеолітичної системи, вивчено кінетику росту пухлин, проведено статистичну обробку результатів, проаналізовано результати дослідження та підготовлено публікацію до друку).
3. Тодор И.Н., Кузьменко А.П., Трегубова Н.А., Трындяк В.П., Ковтонюк О.В., Кунская Л.Н., Стеблянко Т.И., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Лекарственная резистентность опухолей и метастазирование в эксперименте // Укр. мед. альманах. – 2006. – Т. 9, №4. – С.111 – 112. (Особистий внесок здобувача: проведено визначення протеолітичної активності та дослідження кінетики росту первинних пухлин).
4. Патент на винахід України 76922, (51) МПК (2006) G01N 33/50 A61K31/282 (2006.01). Спосіб виявлення чутливості злоякісних пухлин до дії цисплатину // Чехун В.Ф., Ковтонюк О.В., Тодор І.М., Кулик Г.І.. Заявл. 02.06.2005; Опубл. 15.09.2006. – Бюл. №9. – 8 с. (Особистий внесок здобувача: проведено планування схеми експерименту, самостійно визначено протеолітичну активність, проведено дослідження ефективності протипухлинної хіміотерапії, здійснено аналіз та математичну обробку результатів, підготовлено роботу до друку).
5. Ковтонюк О.В., Призимирська Т.В., Тодор І.М., Кулик Г.І., Чехун В.Ф. Дослідження активності серинових протеїназ та їх інгібіторів в плазмі крові мишей в динаміці розвитку карциноми 3LL з індукованою резистентністю до цисплатини // Тези VI конференції молодих онкологів України “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології”, 4–5 грудня 2003 р. – Київ. – 2003. – С. 24.
6. Тодор И.Н., Трегубова Н.А., Трындяк В.П., Ковтонюк О.В., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Особенности метаболизма и ультраструктуры метастазирующей карциномы легких Льюис при формировании резистентности к цисплатине // Материалы III Съезда онкологов и радиологов СНГ, 25 – 28 Мая 2004. – Минск. – 2004. – Ч. 1. – С.351.
7. Chekhun V.F., Kulik G.I., Todor I.N., Kovtonyuk O.V. Proteolytic activity and antiproteases at metastasis of cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant Lewis lung carcinoma // Abstract Book. 18 European association for cancer research, 3 – 6 July 2004. – Innsbruck, Austria. – 2004. – P. 320.
8. Kovtonyuk O.V., Chekhun V.F.,Todor I.N., Kulyk G.I. Character of changes in the total proteolytic activity and the content of main proteinase inhibitors in blood plasma of C57Bl/6 mice upon the cisplatin resistance development of Lewis lung carcinoma // International Student Congress of Medical Sciences, 15 – 18 June, 2005. – Groningen, The Netherlands. – 2005. – P. 54.
9. Ковтонюк О.В., Тодор І. М., Кулик Г. И., Чехун В.Ф. Протеолітична активність у плазмі крові мишей з карциномою легені Льюїс та щурів з карциномою Герена при формуванні резистентності до цисплатину // Тези ІІ науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні проблеми фармакології та токсикології”, 22 грудня 2005 р. – Київ. – 2005. – С. 44.
10. Kovtonyuk O.V., Todor I.N., Kulik G.I., Chekhun V.F. Proteolytic activity and content of alpha-1-proteinase inhibitor upon the growth of mice with Lewis lung carcinoma in the blood plasma and tumor tissue // International Medical Students’ Congress Novi Sad. – Serbia. – 2006. – P. 20.
11. Kovtonyuk O.V., Chekhun V.F., Todor I.N., Kulyk G.I. Proteolytic activity and content of alpha-1-proteinase inhibitor in cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant Lewis lung carcinoma // 17 European Student’s Conference: Abstract Book, 8 – 12 October, 2006, – Berlin, Germany / European Journal of Medical Research. – 2006. – Vol. 11. – P. 123 – 124.
12. Ковтонюк О.В., Чехун В.Ф., Тодор І.М., Кулик Г.І. Протеолітична активність та вміст б1-інгібітору протеїназ в плазмі крові та тканині пухлини мишей при формуванні резистентності карциноми LLC до цисплатину // Матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю: “Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів”, 2 – 3 листопада 2006 р., Київ /Онкологія. – 2006. – Т. 5. № 2. – С. 177 – 178.
13. Чехун В.Ф., Ковтонюк О.В., Кулик Г.И., Тодор И.Н. Развитие лекарственной резистентности in vivo и активность компонентов системы протеолиза // Материалы съезда IV съезда онкологов и радиологов СНГ, 2006. – Баку: НЦО Минздрава Азербайджанской Республики, 2006. – С. 50.
АНОТАЦІЯ
Ковтонюк О.В. Зміни протеїназно-інгібіторного балансу при рості злоякісних пухлин з індукованою резистентністю до цисплатину. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 – онкологія. – Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ – 2008.
Дисертаційна робота присвячена вивченню особливостей протеїназно-інгібіторного балансу в плазмі крові та пухлинній тканині в динаміці росту карциноми Герена та карциноми легені Льюїс з індукованою резистентністю до цисплатину.
В експериментах in vivo було показано, що зниження чутливості злоякісних пухлин до цисплатину супроводжується суттєвими змінами кінетики пухлинного росту: пролонгацією латентного періоду росту та підвищенням швидкості росту в експоненційній фазі. Встановлено, що зміна кінетики росту пухлин асоціюється з підвищенням сумарної протеолітичної активності (ПРА) і рівня б1-інгібітора протеїназ (б1-ІП) та зниженням рівня б2-макроглобуліну (б2М) в плазмі крові тварин. Виявлено пряму кореляційну залежність між об’ємом резистентних пухлин та рівнями ПРА і б1-ІП в плазмі крові та пухлинній тканині. Cпіввідношення рівнів ПРА/б1-ІП у плазмі крові та пухлинній тканині свідчить про суттєве зміщення протеїназно-інгібіторного балансу в бік підвищення ПРА при розвитку резистентності пухлин до цисплатину.
Показано, що формування резистентності карциноми легені Льюїс до цисплатину супроводжується підвищенням інтенсивності метастазування на фоні підвищення ПРА в плазмі крові та пухлинній тканині.
Ключові слова: протеїназно-інгібіторний баланс, серинові протеїнази, протеолітична активність, б1-інгібітор протеїназ, б2-макроглобулін, лікарська резистентність, цисплатин, карцинома Герена, карцинома легені Льюїс, кінетика пухлинного росту, метастазування.
АННОТАЦИЯ
Ковтонюк О.В. Изменения протеиназно-ингибиторного баланса при росте злокачественных опухолей с индуцированной резистентностью к цисплатину. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 – онкология. – Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р. Е. Кавецкого НАН Украины, Киев – 2008.
Диссертационная работа посвящена изучению особенностей протеиназно-ингибиторного баланса в динамике роста карциномы Герена и карциномы легкого Льюис с индуцированной резистентностью к действию противоопухолевого препарата цисплатина. Цель работы состояла в изучении общей протеолитической активности (ПРА) и уровня основных ингибиторов протеолитических ферментов – б1-ингибитора протеиназ (б1-ИП) и б2-макроглобулина (б2М) в плазме крови и опухолевой ткани экспериментальных животных, которым были перевиты подштаммы карциномы Герена и карциномы легкого Льюис с различной чувствительностью к цисплатину.
Эксперименты были проведены на 140 крысах линии Вистар и 478 мышах линии C57Bl/6. Формирование резистентности к цисплатину проводили путем последовательных перевивок клеток опухоли, полученных от животных, которым вводили цитостатик.
В серии экспериментов с карциномой легкого Льюис использовали опухолевые подштаммы, полученные на разных этапах формирования резистентности: LLC-9 (начальный этап), LLC-19 (промежуточный этап), LLC-27 (конечный этап). В экспериментах с карциномой Герена использовали опухолевый подштамм, полученный на конечном этапе формирования резистентности к цисплатину (GC/R). В качестве контрольных групп использовали животных с исходными (чувствительными к действию цисплатина) опухолями – карциномой Герена (GC) и карциномой легкого Льюис (LLC).
Было показано, что формирование резистентности к цисплатину карциномы Герена и карциномы легкого Льюис сопровождается существенными изменениями кинетики опухолевого роста, проявляющимися в пролонгации латентного периода роста (в 3,3 раза для GC/R; в 2,0 раза для LLC-19 и LLC-27) с последующим увеличением скорости роста в экспоненциальной фазе (в 2,0 раза для GC/R; в 3,3 и 3,7 раза для LLC-19 и LLC-27, соответственно). Установлено, что изменение кинетики роста карциномы Герена и карциномы легкого Льюис при развитии их резистентности к цисплатину сопровождается повышением ПРА и увеличением уровня основного ингибитора протеиназ – б1-ИП в плазме крови. В частности, выявлено прямую корреляционную зависимость между объёмом резистентной карциномы Герена и уровнем ПРА (rho = 0,7; p = 0,000001), а также объёмом опухоли и уровнем б1-ИП (rho = 0,67; p = 0,000002) в плазме крови. Прямая корреляционная зависимость между объёмом опухоли и уровнями ПРА (rho = 0,42; p = 0,05) и б1-ИП (rho = 0,65; p = 0,001) обнаружена также в плазме крови мышей с резистентной к цисплатину карциномой легкого Льюис (LLC-27). Необходимо отметить, что аналогичная корреляционная зависимость между объёмом опухоли и уровнями ПРА (rho = 0,5; p = 0,03) и б1-ИП (rho = 0,76; p = 0,0001) была выявлена непосредственно и в опухолевой ткани (LLC-27).
Соотношение уровней ПРА/б1-ИП свидетельствует о существенном смещении равновесия между активностью протеолитических ферментов и уровнем их эндогенного ингибитора (в сторону увеличения ПРА) в условиях развития резистентности карциномы Герена и карциномы легкого Льюис к цисплатину, несмотря на то, что уровень б1-ИП в плазме крови животных с резистентными опухолями значительно превышает такой в плазме крови животных с исходными опухолями. Таким изменениям протеиназно-ингибиторного баланса в плазме крови предшествуют изменения уровней ПРА и б1-ИП в опухолевой ткани. В частности, на модели карциномы легкого Льюис показано, что уровень ПРА в ткани резистентной опухоли (LLC-27) значительно превышал такой в ткани исходной опухоли (LLC), в то время как уровень ингибитора в ткани резистентной опухоли, наоборот, был снижен.
Развитие исходной карциномы легкого Льюис и ее резистентных подштаммов сопровождалось снижением концентрации б2М в плазме крови. Соотношение ПРА/б2М свидетельствует о более выраженом дефиците ингибитора в плазме крови животных с резистентными к цисплатину подштамами опухолей. Подобное изменение протеиназно-ингибиторного баланса ассоциируется с увеличением интенсивности метастазирования карциномы легкого Льюис при снижении ее чувствительности к цисплатину (LLC-27).
Ключевые слова: протеиназно-ингибиторный баланс, сериновые протеиназы, протеолитическая активность, б1-ингибитор протеиназ, б2-макроглобулин, лекарственная резистентность, цисплатин, карцинома Герена, карцинома легкого Льюис, кинетика опухолевого роста, метастазирование.
ANNOTATION
Kovtonyuk O.V. Сhange of the proteinase-antiproteinase balance during growth of malignant tumours with induced cisplatin resistance. – Manuscript.
Dissertation for the candidate of biological science degree in speciality 14.01.07 – Oncology. – R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology, National Academy of Scienсes of Ukraine, Kyiv – 2008.
The thesis is devoted to the study of the proteinase-antiproteinase balance in the dynamics of the growth of Guerin carcinoma and Lewis lung carcinoma with induced cisplatin resistance.
The decrease of tumour cisplatin sensitivity in vivo was shown to be accompanied by significant changes of the kinetics of tumour growth: prolonged latent growth period and increase of exponential phase growth rate. The change of the growth kinetics has been found to associate with the elevation of total proteolytic activity (TРА) as well as the level of б1-proteinase inhibitor (alpha1PI) and decrease б2-macroglobuline (alpha2M) level in blood plasma. A direct correlation dependence of the volume of resistant Guerin carcinoma and Lewis lung carcinoma, TPA and alpha1PI levels in blood plasma and tumour tissue is determined. The value of TPA/alpha1PI ratio has shown that the development of tumour cisplatin resistance is accompanied by the imbalance between proteolytic and antiproteolytic activities shifted to the TPA increase in blood plasma and tumour tissue.
The development of Lewis lung carcinoma cisplatin drug resistance is accompanied by the increase of its metastasis together with the elevation of TPA in blood plasma.
Key words: proteinase-antiproteinase balance, serine proteinases, total proteolytic activity, б1-proteinase inhibitor, б2-macroglobuline, drug resistance, cisplatin, Guerin carcinoma, Lewis lung carcinoma, tumour growth kinetics, metastasis.
