Радіоізотопна сцинтіграфія для оцінки поглинально-видільної функції макрофагально-фагоцитарної системи печінки проводилась на апараті "Гамма-камера МВ 9200" (Угорщина). Радіофармпрепарат Tc99m вводився внутрішньовенно з розрахунку на кілограм маси тіла та проводилась оцінка накопичення препарату в гепатоцитах, що дозволяло диференціювати дифузні та вогнищеві ураження.
З метою вивчення ступеню активності запальних процесів та фіброзу в тканині печінки у хворих з різними генотипами HCV пункційна біопсія печінки (ПБП) з подальшим морфологічним дослідженням біоптатів була проведена 94 хворим з 1-м генотипом HCV, 15 – з 2-м генотипом та 41 пацієнту з 3-м генотипом. ПБП проводилась голками "UNICUT G16" фірми "Bard" (Німеччина) та "Tru-Cut G14" фірми "Allegiance" (США). Отриманий матеріал фіксували в 10% буферному розчині формаліну. Використовували загальногістологічні методики фарбування: гематоксилін-еозин, пікрофуксин за Ван Гізоном. Морфологічні зміни структури печінки оцінювались за шкалою METAVIR.
Статистичну обробку отриманих результатів проводили за загально-прийнятими методами варіаційної статистики на персональному комп'ютері в рамках статистичного пакету програми "Statistica 5,0", "Microsoft Excell" та "Paradox for Windows 5.0". Аналiз ефективностi багатомiрниx заміщень був проведений за процедурою МI системи статистичного аналiзу SAS 9.13. Iндекси прийнятностi початкової та остаточної моделі перебігу XГС отримані за процедурою CLARIS. Тестування можливиx варіантів зміни моделі проводили за методом множників Лагранжа та критерієм Уайльда. В ході тестування основної гіпотези дослідження, а саме відмінності перебігу гепатиту при різних генотипах вірусу, використовувалось моделювання структурних рівнянь (Structural equations modeling – SEM). Оформлення та друк проводили в текстовому редакторі Word.
Результати дослідження та їх обговорення:
Аналіз розподілу генотипів вірусу серед хворих на ХГС в Подільському регіоні показав переважання осіб з 1-м генотипом HCV – 257 (70,2%), тоді як хворих з 3-м генотипом було 80 (21,9%), а з 2-м лише 24 (6,6%). Тільки у 5 (1,3%) пацієнтів одночасно було знайдено два генотипи вірусу – 1-й та 3-й (рис.1).
Серед хворих з різними генотипами HCV переважали чоловіки. Так, при 1-му генотипі їх відсоток становив 58%, при 2-му – 62,5%, а при 3-му генотипі HCV був максимальним – 67,5%.
Було виявлено тенденцію до поступового зростання кількості пацієнтів в старших вікових групах незалежно від генотипу HCV. В молодших вікових групах (15-19 та 20-29 років) при цьому переважали особи з 3-м генотипом вірусу – 11,3% та 47,5% відповідно, тоді як серед пацієнтів старше 50 років достовірно частіше був виявлений 1-й генотип (16,7%).
Показано, що найчастішим фактором інфікування HCV у хворих з 1-м та 2-м генотипами вірусу виявились гемотрансфузії – 29,2% та інші парентеральні маніпуляції (стоматологічні процедури, ендоскопії, ін'єкції) – 26,8% і 45,8%, відповідно. Серед хворих з 3-м генотипом вірусу переважали особи, які вживали ін'єкційні наркотики (26,3%).
В результаті наших спостережень встановлено, що найдовша тривалість ХГС (понад 15 років) спостерігалась у пацієнтів з 1-м генотипом – 23,3%.
В клінічній картині захворювання, при різних генотипах вірусу, домінував астеновегетативний синдром, що проявлявся загальним нездужанням – 56,6%, підвищеною втомлюваністю після звичайних фізичних та психічних навантажень – 80,6%, порушенням нічного сну – 1,4%. Особливо він був виражений у хворих з 1-м генотипом ХГС – 62,6%. Диспептичний синдром спостерігався у значно меншої частини хворих з різними генотипами – 17,5% – 21,4%. Практично у кожного другого хворого на ХГС спостерігались прояви геморагічного синдрому, при 1-му генотипі цей відсоток становив 45,5%. Артралгіі визначались лише у хворих з 1-м та 3-м генотипами HCV (6,6% та 3,8% відповідно). Субіктеричність шкіри та слизових оболонок була виражена у незначної кількості хворих також лише при 1-му та 3-му генотипах – 3,1% та 2,5% відповідно. Гепатомегалія частіше виявлялась у пацієнтів з 1-м генотипом вірусу, як при об'єктивному обстеженні (62,6%), так і при УЗ-дослідженні – 60,7%. Кількість хворих із збільшенням селезінки була значно меншою – 18,3% при 1-му генотипі.
Порушення поглинально-видільної функції печінки у вигляді слабкого накопичення радіофармпрепарату в гепатоцитах (80%) та підсилення його в селезінці (82,6%) було виявлено частіше у пацієнтів з 1-м генотипом HCV, а накопичення препарату в хребті лише у осіб цієї групи.
В нашому дослідженні позапечінкові прояви були виявлені у 26,2% пацієнтів з ХГС, причому такі з них, як цукровий діабет та шкірний васкуліт, зустрічалися лише при 1-му генотипі.
Аналіз змін показників цитолізу встановив, що серед хворих з нормальним рівнем АЛТ переважали пацієнти, інфіковані 1-м генотипом вірусу – 21%. Нами достовірно частіше були отримані високі рівні АЛТ та АСТ в сироватці крові хворих з 3-м генотипом. У хворих з різними генотипами вірусу виявлялись явища холестазу, що проявлялись помірним зростанням рівню загального білірубіну у 43,6% пацієнтів з 1-м генотипом, 37,5% – з 2-м та у 41,2% – з 3-м генотипом HCV. Переважно була збільшеною фракція прямого білірубіну у 75% хворих з 1-м генотипом HCV, 66,7% – з 2-м та 70% – з 3-м генотипом вірусу. Було зареєстровано підвищення фракції непрямого білірубіну у 11,7% хворих з 1-м генотипом HCV, у 8,3% – з 2-м та у 8,7% – з 3-м генотипом вірусу. Серед показників холестазу найчастіше підвищені рівні лужної фосфатази (41,6%) та ГГТ (25,5%) спостерігались у хворих з 1-м генотипом вірусу.
Результати нашого дослідження показали достовірно більш низькі рівні холестерину в сироватці крові у хворих з 3-м генотипом HCV – 3,65± 0,15 ммоль/л. Підвищення рівня ТТГ найчастіше визначалось у хворих з 1-м генотипом HCV – 13,2%. Серед хворих з 2-м генотипом HCV підвищення рівня ТТГ спостерігалось у 7,1%, з 3-м – у 7,9% пацієнтів.
Підвищений рівень б-фетопротеїну визначався у 6,6% хворих з 1-м генотипом HCV, у 7,1% – з 2-м та у 3% – з 3-м генотипом вірусу.
Було встановлено, що більшу частину хворих з високим рівнем вірусного навантаження складали пацієнти з 1-м генотипом вірусу – 68,7%, тоді як подібні показники серед осіб з 2-м та 3-м генотипами виявлялись лише у 40% та 8,3% обстежених відповідно.
Встановлено, що у пацієнтів з різними генотипами реєструвалося достовірне падіння вмісту селену та активності ГПО, і найбільшим воно було у хворих з 1-м генотипом HCV – на 31% та 39% відповідно.
У хворих на ХГС при підвищеній активності трансаміназ мало місце значне виснаження селенової антиоксидантної системи. Вміст селену в сироватці крові пацієнтів падав на 27%, а активність еритроцитарної ГПО – на 33%. Однак і гепатит, що супроводжувався нормальною активністю трансаміназ, проявлявся достовірним зниженням рівня селену (на 18%) та активності ГПО (на 20%). Отримані дані свідчили про залежність частоти відхилень показників оксидативного стресу від референтного інтервалу від генотипу вірусу. Так, рівень селену менше 50 мкг/л та активність ГПО менше 500 мкмоль/хв частіше були виявлені у пацієнтів з 1-м генотипом – 92% та 89% відповідно. Таким чином, хворі з дефіцитом селену (зниженням рівню селену та падінням активності ГПО) реєструвались переважно серед осіб з 1-м генотипом вірусу та групах з високою активністю трансаміназ. Тривалий перебіг ХГС супроводжувався виснаженням селензалежної антиоксидантної системи. Так, рівень селену та активність ГПО у пацієнтів з тривалістю ХГС більше 4-х років були на 11 і 25% меншими, ніж у пацієнтів з тривалістю менше 2-х років.
При гістологічному дослідженні біоптатів печінки у хворих на ХГС з 1-м генотипом вірусу нами були виявлені некродистрофічні, запальні та фібропластичні зміни органу, виразність яких залежала від віку пацієнта, тривалості захворювання. У всіх групах спостережень дистрофічні зміни в печінці були представлені зернистою, гідропічною та жировою дистрофіями. При цьому переважало поєднання білкової та жирової дистрофії. Жирова дистрофія в тканині печінки носила хронічний характер. Вона була частіше представлена вогнищевою великокрапельною дистрофією. Поряд з цим зустрічались також вогнища дрібнокрапельної жирової дистрофії. Як правило, жирова дистрофія переважала при тривалому перебігу захворювання і не залежала від віку пацієнтів.
Показано, що у всіх обстежених хворих відмічалась зерниста дистрофія гепатоцитів. У 60% пацієнтів в гепатоцитах виявлялась гідропічна дистрофія, яка поєднувалась, як з зернистою, так і з жировою дистрофіями. Гепатоцити при цьому зберігали свою форму і розміри. В цитоплазмі клітин печінки формувались дрібні вакуолі, що зливались між собою і гепатоцит набував балонного вигляду. Процес завершувався формуванням коллікваційного некрозу. Навколо дистрофічно змінених гепатоцитів відмічалося скупчення лімфоцитів та макрофагів. Лімфоцити оточували пошкоджені клітини та це явище отримало назву імуноклітинного кілінгу гепатоцитів.
Результати проведених досліджень показали, що виявлені дистрофічні зміни гепатоцитів спостерігалися одночасно у хворих з різними генотипами HCV. При 1-му генотипі вірусу в більшій мірі переважала комбінація гідропічної та жирової дистрофії. При 3-му генотипі HCV в гепатоцитах виявлялась як зерниста білкова, так і жирова дистрофія.
При ХГС незалежно від генотипу вірусу при дослідженні біоптатів печінки в цитоплазмі збережених гепатоцитів спостерігалось накопичення ліпофусцину та гемосидерину. Ліпофусцин виявлявся в гіпертрофованих клітинах печінки. Гемосидерин виявлявся у вигляді дрібних гранул та зерен. Дрібні скупчення гемосидерину локалізувались і в просвіті синусоїдів поблизу клітин Купфера та в перисинусоїдальних зірчастих ретикулоендотеліоцитах (клітинах Іто). Накопичення заліза в печінці переважало у пацієнтів на ХГС з 1-м генотипом вірусу. При цьому гранули гемосидерину виявлялися дифузно у всіх полях зору. В біоптатах печінки хворих з 3-м генотипом відкладення гемосидерину носило вогнищевий характер.
Руйнівні зміни в печінці у хворих на ХГС при різних генотипах вірусу були представлені явищами апоптозу та некрозу, та в тканині печінки формувались різні види некрозів, що були представлені за локалізацією процесу внутрішньо-часточковими, перипортальними та мостовидними формами некрозу.
Оцінка ступеня гістологічної активності запального процесу показала, що при 1-му генотипі HCV індекс гістологічної активності (ІГА) коливався від слабкого (А1) до високого (А3). У вікових групах 20-29 та 40-49 років ІГА мав більш високий рівень – А2-А3. В інших вікових групах ІГА був в межах А1-А2.
При дослідженні біоптатів хворих на ХГС з 3-м генотипом вірусу виявлено, що лімфоїдні агрегати в портальних трактах формували лімфоїдні фолікули. Останні мали чітку межу. Вогнищево лімфоїдні клітини виходили за межі фолікула, руйнували термінальну пластинку і проникали в паренхіму часточки. Лімфоїдні фолікули були представлені двома видами. Перший вид лімфоїдних фолікулів мав зони просвітлення, або світлого центру – так звані гермінативні центри. Другий вид лімфоїдних фолікулів представляв собою скупчення лімфоцитів, макрофагів, ретикулярних клітин та не мав гермінативних центрів. Переважно лімфоїдні фолікули локалізувались поблизу печінкової артерії та жовчної протоки.
Гістологічне дослідження біоптатів печінки у хворих на ХГС з різними генотипами дозволило виявити різновиди фіброзу печінки. У хворих на ХГС з 1-м генотипом HCV в тканині печінки в переважній більшості спостережень діагностували перицелюлярний фіброз печінки, що поєднувався з перисинусоїдальним фіброзом. Портальний фіброз і його різновиди виявлялися часто незалежно від генотипу вірусу.
Кількісна оцінка ступеню фіброзу печінки за шкалою METAVIR показала, що вираженість фіброзу тканини печінки поступово зростала у хворих старших вікових груп (F2-F3), що можна пояснити більш тривалим перебігом захворювання. Проте фіброз F3 виявлявся і у хворих 20 років. Основна маса пацієнтів з наявністю фіброзу печінки F3 спостерігалась у віці 40-50 та старше років. В цих вікових групах зустрічались поодинокі випадки ЦП (F4).
Встановлено, що найбільший відсоток осіб із запальними змінами А1 в тканині печінки, був зареєстрований у хворих з 3-м генотипом (48,8%), тоді як при 1-му генотипі вірусу їх число було вдвічі меншим.
Навпаки, при змінах, що відповідали ступеню активності запалення А3, максимальний відсоток пацієнтів спостерігався при 1-му генотипі та практично втричі перевищував такий при 3-му генотипі. Аналіз розподілу хворих з різними генотипами вірусу в залежності від ступеню фіброзу встановив, що незалежно від генотипу вірусу найбільший відсоток хворих спостерігався при фіброзі F1 – 44,7%, 73,3%, 43,9% при 1-му, 2-му та 3-му генотипах відповідно (табл.3).
Пацієнти з морфологічною картиною ЦП спостерігались лише при 1-му генотипі вірусу (6,4%). За нашими даними, найбільша середня активність та фіброз були притаманні саме хворим з 1-м генотипом вірусу, що пояснює важкість перебігу ХГС саме у цієї групи хворих.
Було встановлено, що достовірно і залежно від важкості морфологічних проявів гепатиту знижувалась концентрація селену та падала активність ГПО. Вже у пацієнтів з ІГА А2 порівняно з хворими з ІГА А1 реєструвалось достовірне зниження вмісту селену, яке поглиблювалося у хворих з більш важкою морфологічною картиною гепатиту. Активність ГПО достовірно відрізнялась у пацієнтів з ІГА А3. Наростання фібротичних змін в печінці йшло паралельно виснаженню селенової антиоксидантної системи. Порівняно з пацієнтами при мінімальних фібротичних змінах (F1) в печінці, вміст селену в плазмі крові у пацієнтів з вираженим фіброзом печінки (F3) знижувався на 15%, а активність еритроцитарної ГПО – на 21%. Між групами пацієнтів із ступенем фіброзу F1 та F2 достовірна різниця була помічена лише щодо активності ГПО, а відмінності в концентрації селену фіксувались лише на рівні тенденції.
Нами було встановлено, що при всіх ступенях активності запального процесу в печінці рівень вірусного навантаження був достовірно вищим у хворих з 1-м генотипом. Однак, не було виявлено взаємозв'язку між ступенем гістологічної активності та рівнем вірусного навантаження. Вірусне навантаження у хворих з F1 та F2 за нашими даними статистично достовірно було вище у хворих з 1-м генотипом вірусу. Крім того, спостерігалось зниження рівня вірусного навантаження із зростанням ступеня фібротичних змін в печінці.
Визначення епідеміологічних, клінічних, лабораторних та морфологічних особливостей ХГС дозволило розробити модель захворювання, що показує зв'язки між складовими його перебігу та дає можливість протестувати гіпотезу однаковості / відмінності перебігу ХГС в залежності від генотипу вірусу.
Остаточна модель ХГС включала 12 ендогенних змінних, з них 11 маніфестних ("вірусне навантаження", "сулемова проба", "протромбіновий індекс", "загальний білок", "альбумін", "холестерин", "активність", "фіброз", "білірубін", "АСТ", "ГГТ") і латентний фактор – Faktor 1, яким ми позначили перебіг захворювання. Також у модель входили 15 екзогенних змінних, з них 3 маніфестні ("тривалість хвороби", "вік інфікування", "шлях інфікування") і 12 змінних залишків (Е1. . Е11, D1), що безпосередньо не вимірювались.
Було встановлено, що більша тривалість хвороби (коеф. =0,3245 t=3,59), старший вік інфікування (коеф. =0,1294 t=2,07), менш небезпечний шлях інфікування (коеф. =-0,2246 t=2,65) достовірно збільшували рівні латентного фактору (перебіг гепатиту) у зв'язку із враженням вірусом. Більше значення в свою чергу мали достовірне зниження значень змінних "фіброз" (коеф. =-0,534 t=2,78), "вірусне навантаження" (коеф. =-1,6258 t=3,85) та "альбумін" через "фіброз" (коеф. =-0,2197 t=2,1) (рис.2).
Як показали результати структурного моделювання, активність гепатиту лише на 1,47% визначалася структурною моделлю, в той час як фіброз на 10,13%. Тобто за заданими змінними модель краще описувала стан фіброзу печінки, ніж активність гепатиту. Велика частка (39,3%) дисперсії перебігу ХГС визначалась змінними "вік інфікування", "тривалість хвороби", "шлях інфікування".
Для 1-го генотипу вірусу отримані значення індексів наведені у табл.4 (модель MG1). У порівнянні з оцінками остаточної моделі, що об'єднувала всі генотипи вірусу (модель MG), модель MG1 характеризувалась більшим значенням оціночної функції (0,8221 проти 0,7286), меншим коефіцієнтом детермінації GFI (0,8826 проти 0,8959) і значенням хі-квадрату всього 39,4618, так як кількість одиниць спостережень з вірусом 1-го генотипу складала 49 (тобто c2=0,8221*48=39,46).