Реферат Влияние нефтепродуктов на жизнедеятельность гидробионтов
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2015-10-28Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
Федеральное государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт экономики, управления и природопользования
Кафедра экотоксикологии и микробиологии
КУРСОВАЯ РАБОТА
ВЛИЯНИЕ НЕФТЕПРОДУКТОВ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ РАЧКОВ DAPHNIA MAGNA
Научный руководитель __________ Шашкова Т.Л.
Студент ____________ Смирнова В.В.
Красноярск 2010
СОДЕРЖАНИЕ
Введение. 3
1. Литературный обзор. 6
1.1. Загрязнение пресных водоемов. 6
1.2. Нефтяное загрязнение пресных водоемов. 8
1.3. Исследования влияния нефтепродуктов на водные экосистемы.. 11
1.4. Влияние токсических веществ на жизнедеятельность дафний. 13
1.5. Современные методы анализа загрязнения водной среды. Методы биотестирования 15
1.6. Физиология Daphnia magna. 18
2. Объект и методы исследования.. 20
3. Результаты и их обсуждение. 23
3.1. Оценка токсичности сырой нефти по выживаемости и всплытию дафний. 23
3.2.Оценка токсичности нефтепродуктов по выживаемости и всплытию дафний. 27
3.3. Сравнение токсического действия сырой нефти и нефтепродуктов на дафний. 34
Заключение. 36
Список использованных источников. 37
Введение
Большую опасность для экосистем водных объектов представляют нефтепродукты, являющиеся одними из самых распространенных и токсичных загрязняющих ингредиентов. При поступлении нефтепродуктов в водный объект со временем происходит перераспределение основных форм миграции в сторону преобладания растворенной и эмульгированной форм. Водорастворимая фракция нефти представляет наибольшую токсикологическую опасность для водных экосистем, поскольку она состоит на 90 % из ароматических углеводородов, которые являются наиболее трудноокисляемыми компонентами нефти и оказывают действие на живые организмы как клеточные яды [18].
Значительные количества нефтепродуктов поступают в поверхностные водные объекты (реки и водохранилища) с недостаточно очищенными промышленными сточными водами, а также с рассредоточенным стоком. Самоочищающей способности водных объектов зачастую недостаточно для приведения качества природных вод в состояние, удовлетворяющее нормативам [25]. В этой ситуации важно не только оперативно обнаружить загрязнение, но и определить степень токсического действия на живые организмы, обитающие в водной среде.
Необходимость решения этой проблемы в условиях непрерывного увеличения антропогенной нагрузки и темпов использования водных ресурсов определяют возможность разработки методов оценки токсичности вод, дающих надёжную информацию об экологическом состояние водных объектов. Одной из актуальных задач является создание системы оперативного контроля, разработка и применение экспрессных методов оценки качества воды. Такую оценку можно получить с помощью стандартных методик биотестирования по определению токсичности воды для гидробионтов [21].
Одна из наиболее часто используемых методик основана на определении смертности дафний в исследуемой водной среде, по сравнению с контрольной культурой в пробах, не содержащих токсических веществ – контроль [7].
Дафниевый тест имеет преимущества перед другими биотестами благодаря высокой чувствительности к ядам различной природы, а сравнительно короткая продолжительность жизни рачков способствует лучшему отражению «моментальных» концентраций нефтепродуктов в окружающей водной среде, что невозможно выявить при использовании высших водных животных с большой продолжительностью жизни [27].
На кафедре экотоксикологии и микробиологии был разработан новый оперативный метод определения токсичности вод по выживаемости рачков дафний, при выполнении которого соблюдаются определенные требования по созданию одинаковых кислородных, световых и температурных условий для тест – организмов. Для этого разработаны устройства УЭР-03 и климатостат Р2 для экспонирования тест-организмов во время биотестирования. Первое устройство создает активный газообмен между воздушной и водной средами, а так же равные световые температурные условия для всех анализируемых проб, климатостат Р2, в свою очередь, поддерживает условия на уровне, необходимом для нормальной жизнедеятельности дафний [31].
Основной особенностью этого метода является непрерывное снабжение воды кислородом воздуха, это может повлиять на результаты токсичности нефтепродуктов, характерной особенностью которых является образование маслянистой пленки на поверхности воды, препятствующей доступу воздуха. В связи с этим представляло интерес оценить действие нефтепродуктов в условиях, создаваемых устройством для экспонирования рачков [5].
Так же одним из методов определения токсичности воды разработали Стом Д.И. и др. В своих работах, они параллельно с выживаемостью рачков оценивали и реакцию всплытия тест – организмов. Опыты показали, что поведенческая реакция всплытия дафний в поверхностный слой наблюдалась в значительно более низких концентрациях, чем 50% гибель, что позволило сделать вывод, о том, что это новая высокочувствительная тест-реакция ракообразных отряда Cladocera на нефтепродукты [26].
Возможно всплытие тест – организмов к поверхности раствора и является более чувствительной реакцией рачков к присутствию нефтепродуктов, но стоит заметить, что не на все нефтепродукты проявляется данная реакция. При отсутствие, так называемой, поверхностной маслянистой пленки всплытие рачков не происходит и при максимальных концентрациях, тогда как выживаемость значительно снижаться.
Таким образом, целью данной работы являлось изучение чувствительности рачков Daphnia magna к нефтепродуктам при экспонировании тест-организмов в условиях вращения.
В рамках этой цели были поставлены следующие задачи:
1.Оценить влияние сырой нефти на выживаемость и всплытие рачков и сопоставить эти показатели с количеством кислорода в данных растворах.
2. Оценить токсичность нефтепродуктов (бензинов АИ 80, АИ 92,АИ 95 и дизельного топлива) по выживаемости и всплытию рачков и сопоставить эти показатели с количеством кислорода в данных растворах.
3. Сравнить токсическое действие нефтепродуктов и сырой нефти на выживаемость и всплытие рачков дафний.
1. Литературный обзор
1.1. Загрязнение пресных водоемов
Загрязнение водной среды есть внесение в нее не свойственных ей живых или неживых компонентов или структурных изменений, прерывающих круговорот веществ, их ассимиляцию, поток энергии, вследствие чего данная система разрушается или снижается ее продуктивность.
Ингредиенты загрязнения – это тысячи химических соединений, особенно металлы или их оксиды, а также токсические вещества. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в практике в настоящее время используется до 500 тысяч химических соединений. При этом около 40 тыс. соединений обладают весьма вредными для живых организмов свойствами, а 12 тыс. – токсичны. [6].
Непосредственными объектами загрязнения (акцепторами загрязняющих веществ) служат основные элементы экотопа: атмосфера, вода, почва. Косвенными объектами загрязнения являются составляющие биоценоза – растения, животные, микроорганизмы.
Существует несколько типов загрязнения пресных водоемов:
1. Атмосферные воды, несущие массы вымываемых из воздуха поллютантов промышленного происхождения. При стекании по склонам атмосферные и талые воды дополнительно увлекают с собой массы веществ. Особенно опасны стоки с городских улиц, промышленных площадок, несущие массы нефтепродуктов, мусора, фенолов, кислот.
2. Городские сточные воды, включающие преимущественно бытовые стоки, содержащие детергенты, микроорганизмы, в том числе патогенные. Ежегодно в целом по стране образуется около 100 км³ таких вод.
3. Сельскохозяйственные воды. Загрязнение этими водами обусловлено, во-первых, тем, что повышение урожайности и продуктивности земель неизбежно связано с применением ядохимикатов, используемых для подавления вредителей, болезней растений, сорняков. Эти ядохимикаты непосредственно попадают на поверхность почвы или смываются на большие расстояния, неизбежно оказываясь в водных объектах.
4. Промышленные сточные воды, образующиеся в самых разнообразных отраслях производства, среди которых наиболее активно потребляют воду черная и цветная металлургия, химическая, лесохимическая и нефтеперерабатывающая отрасли промышленности [18].
Следует отметить, что загрязнение водных систем представляет большую опасность, чем загрязнение атмосферы. Это обусловлено тем, что процессы генерации или самоочищения протекают в водной среде гораздо медленнее, чем в воздушной. Источники загрязнения водоемов более разнообразны и менее предсказуемы. Естественно, процессы, осуществляющиеся в водной среде и подвергающиеся загрязнению, более чувствительны сами по себе и имеют большее значение для обеспечения жизни на Земле, чем те, которые протекают в атмосфере [23].
Особая опасность накопления тяжелых металлов в том, что в отличие от токсикантов, имеющих органическую природу и в большей или меньшей степени разлагающихся в природных водах, ионы тяжелых металлов сохраняются постоянно при любых условиях [28].
В результате чего снижение количества фильтраторов в водоеме приведет к нарушению питательных цепей и к тому же сильно скажется на процессах самоочищения водоемов, что, в свою очередь, может привести к загрязнению воды органическими веществами[9].
Аккумуляция стойких токсикантов планктоном, даже если они не отражаются непосредственно на самих планктонах, способствует передачи их следующим звеньям пищевых цепей при выедании планктона рыбами и развития интоксикации рыб, а через рыбу токсиканты могут передаваться человеку. При систематическом накоплении стойких токсикантов возникает кумулятивный токсикоз, который рано или поздно приводит к гибели пораженных особей [28].
Таким образом, загрязнение пресных водоемов многообразно и носит комплексный характер, поэтому для его оценки необходимо применять методы биологического контроля.
1.2. Нефтяное загрязнение пресных водоемов
В наше время, когда хорошо развита промышленность, экологическая проблема стала более серьезной. Невозможность контролировать все выбросы современных заводов, ставит под угрозу водные экосистемы.
Источники поступления углеводородов в водные объекты можно разделить на:
1) антропогенные (поступление в результате хозяйственной деятельности):
а) первичные (поступление с недостаточно очищенными сточными водами, с диффузным стоком, в результате аварий);
б) вторичные (поступление с атмосферными осадками, "выход" из донных отложений);
2) природные (естественное содержание углеводородов в воде).
Значительные количества нефтепродуктов поступают в поверхностные водные объекты со сточными водами предприятий нефтедобывающей, нефтеперерабатывающей, химической, металлургической и других отраслей промышленности. Особенностью промышленных сбросов является их локальный характер, приводящий иногда к созданию высоких концентраций нефти и нефтепродуктов на ограниченном участке акватории [21].
Также к источникам загрязнения относятся системы отопления, работающие на нефти, операции обслуживания автомобилей (мойки, стоянки, автозаправочные станции, станции техобслуживания), несанкционированные свалки отходов, загрязненных нефтепродуктами (опила, песка, шламов, ветоши), гаражи, хранилища нефтепродуктов.
Существенный вклад в поступление нефтепродуктов в водные объекты вносят дождевые и талые воды с территорий населенных пунктов. Но помимо организованного и рассредоточенного стока, неотъемлемой частью на сегодняшний день являются промышленные и транспортные аварии. Возникновение аварийных ситуаций и ситуаций чрезвычайного характера, связанных с загрязнением окружающей среды, на потенциально опасных объектах могут быть обусловлены как опасными природными явлениями (геологическими, метеорологическими, гидрологическими), так и причинами, носящими техногенный характер (нарушение технологии и правил эксплуатации объектов, ошибки в проектировании и строительстве и т.п.). Экологические катастрофы могут вызываться также комплексом иных факторов [23].
Рассматривая вопрос загрязнения водной среды углеводородами, необходимо кратко остановиться на материалах, характеризующих их естественное содержание в природных водах. Исследования показали, что накопление углеводородов в поверхностном слое воды может происходить в результате непосредственного синтеза, например, сульфатредуцирующими бактериями, которые используют молекулярный водород в качестве единственного источника энергии, а углекислый газ или карбонаты - в качестве источника углерода [25].
Нефть является сложной смесью парафиновых, циклопарафиновых, ароматических углеводородов с простыми и разветвленными цепями. Помимо этих основных составляющих, она содержит соединения серы и азота, органические кислоты, микроэлементы. Нефти могут также содержать нафтеновые кислоты и фенольные соединения, хлороформенные битумоиды, в составе которых имеются такие экологически особо опасные соединения, как полиароматические углеводороды. Приконтурные воды за счет высокой восстановительной способности углеводородов обогащаются органическими кислотами, бензолом, толуолом, фенолом и другими органическими веществами. В них также отмечаются заметные аномалии по содержанию серы, фосфора, тяжелых металлов. Загрязнение приконтурными водами способно сильно изменять химический состав подземных вод.
Нефтяные компоненты при поступлении в поверхностные воды находятся в различных формах (масляная, растворенная, эмульгированная, адсорбированная). В начальный период 60-70 % поступившей нефти содержится в водной массе в растворенном, эмульгированном, адсорбированном состоянии. Обычно эмульгированных компонентов в 2 раза больше растворенных. Последние состоят на 80-90 % из ароматических углеводородов (бензол, толуол, этилбензол, ксилол и др.), обладающих высокой токсичностью в связи с повышенной способностью к растворению в воде [22].
Поступившая в поверхностные воды нефть вступает в общую цепь сложных и мало исследованных по длительности процессов (испарение, растворение, эмульгирование, окисление, образование агрегатов, седиментация, биодеградация). Эти процессы зависят как от состава и количества нефти в водной среде, так и от условий в водоемах (наличия в воде коллоидов, взвешенных частиц, планктона, температуры, солнечного освещения и т.д.). Известно, что во всех формах миграции происходит накопление устойчивых к биологическому разложению компонентов (смол, асфальтенов, парафинов и др.), причем максимум нефтепродуктов концентрируется в донных отложениях. При хроническом загрязнении водотоков углеводороды накапливаются в донных отложениях на участках с замедленным течением, где активно проходят процессы илонакопления. Размыв загрязненных донных отложений вызывает вторичное загрязнение вод и их перенос далее вниз по течению реки, что зависит от диаметра частиц и скоростей речного потока [18]. В стоячих водоемах, загрязнение донных отложений нефтью приурочено, как правило, к прибрежным, наиболее биологически продуктивным зонам. При крупных авариях, когда водоем полностью покрыт нефтью и не приняты оперативные меры по ее сбору, донные отложения покрываются слоем нефти и наблюдается полная деградация донных сообществ. К факторам, существенно сдерживающим скорость деградации нефти, относятся низкая прозрачность воды, сдерживающая фотоокисление (особенно в половодье), а также пониженная температура воды и дефицит кислорода, приводящий в зимний период к заморам. Установлено, что при отсутствии ультрафиолетового излучения скорость химической деструкции нефти снижается почти в 2 раза, а со снижением температуры на 10° – в 2-4 раза. Пониженная температура существенно снижает и биохимические процессы, связанные с деструкцией и трансформацией различных веществ. В анаэробных условиях или дефиците кислорода происходит не окисление, а сульфатредукция и метанообразование. При этом в воде накапливаются токсичные для гидробионтов вещества (меркаптаны, сероводород и др.). Наиболее экологически опасными являются хорошо растворимые, трудно окисляемые нефтяные углеводороды – водорастворимая фракция может содержать до 90 % токсичных ароматических соединений. В нижних горизонтах локализуется сверхмедленно окисляемая фракция, обогащенная полиароматическими углеводородами [7].
Важная роль в распределении нефтепродуктов в водотоках принадлежит физическим процессам сорбция нефти взвесью и ее осаждение. По мере удаления от источников загрязнения концентрация нефтепродуктов во взвеси снижается, что обусловлено испарением их летучих компонентов, а также биохимическим окислением. Опытами установлено, что
Влияние нефти, нефтепродуктов и их составляющих частей не ограничивается определенной территорией или одним видом живых организмов. При попадании в окружающую среду они оказывают действие на биоразнообразие водоема и на всю экосистему в целом.
1.3. Исследования влияния нефтепродуктов на водные экосистемы
При попадании нефти и нефтепродуктов в водную экосистему, в первую очередь происходит воздействие на донные микроорганизмы, которые являются наиболее чувствительными к токсикантам, чем более крупные обитатели водоемов.
Л.С. Кравцовой и др. исследовалось влияние водорастворимых битумов в донных отложениях на распределение гидробионтов. Максимальные значения численности и биомассы олигохет, хирономид и моллюсков отмечены при содержании водорастворимых битумов 40 мг/кг грунта. При более высоких концентрациях (82 мг/кг) происходило уменьшение количественных показателей, как отдельных групп, так и зообентоса в целом. Однако, влияние водорастворимых битумов на группы зообентоса неоднозначно. Так, концентрации 40 мг/кг, вероятно, создают оптимальные условия для развития микрофлоры, повышающей пищевую ценность детрита, что способствует обилию гидробионтов. При дальнейшем возрастании содержания водорастворимых битумов наблюдается снижение численности как у моллюсков, так и хирономид; у олигохет эта тенденция выражена слабо. Аналогичные закономерности прослежены и другими исследователями. При загрязнении донных отложений дизельным топливом смертность личинок хирономид (на примере Chironomus riparins) достоверно была выше контрольной при содержании нефтепродуктов 220…320 мг/кг.
Нефть разных месторождений по-разному влияет на донных беспозвоночных, прежде всего это связано с различным фракционным составом углеводородов. Нефть с высоким содержанием нафтеновых кислот, смол и серы была самой ядовитой для гидробионтов. Нефть не является специфическим токсикантом, поражающим какую-либо одну систему, а вызывает несогласованные изменения в содержании белка, свободных нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Помимо микробиальных деструкторов нефти, донные организмы также участвуют в преобразовании нефти в донных осадках. Многие исследователи уже давно отмечали, что гидробионты способны накапливать в своем организме нефтепродукты. Так, полихеты способствуют преобразованию нефти в грунте [18]. Эксперимент показал, что ароматические структуры органического вещества фекалий нереисов из опыта приобретали иной характер, чем исходных. Полихеты перерабатывали нефтепродукты, а именно тяжелые фракции.
Проходя через организм мидий, углеводороды нефти претерпевают более глубокие качественные и количественные изменения по сравнению с трансформацией нефти в морской воде. Накопление углеводородов мидиями зависит от нескольких факторов: степени их исходного загрязнения углеводородами нефти; физиологического состояния, связанного с отсутствием (недостатком) питательных веществ; химического спектра углеводородов в нефтепродуктах. Моллюски способны продолжительное время сохранять в своем теле нефть [22].
Донные беспозвоночные подвержены влиянию нефти и нефтепродуктов, которое выражается в изменении количественных и качественных характеристик донных сообществ, его структуре, причем это влияние зависит от качественного состава нефти или нефтепродуктов, их концентрации и периодичности загрязнения. Важная роль отводится донным организмам в процессах самоочищения водных объектов от данных загрязнителей [22].
То есть характер токсического действия нефти и нефтепродуктов на все живые организмы водоема носит различный характер, в зависимости от химического состава и концентрации токсиканта, и вида живого организма, а именно от возраста, массы тела и продолжительности жизненного цикла.
1.4. Влияние токсических веществ на жизнедеятельность дафний
Влияние токсикантов на зоопланктон осуществляется как прямо путем адсорбции на поверхности тела и поглощения фильтрацией, так и косвенно, при питании бактерио- и фитопланктоном, накопившим токсиканты. Поступая в зоопланктонные организмы, токсиканты частично аккумулируются в их тканях, а частично подвергаются метаболизации и детоксикации [3].
Если они не вызывают острого отравления и гибели животных, то при накоплении в организме могут вызывать либо хроническую интоксикацию, выражающеюся в изменение ритма и скорости движения, отказе от пищи, нарушение информационных связей и дезорганизации поведения, снижении интенсивности обмена и темпа роста, либо сказываются на последующих поколениях вследствие проникновения в хромосомный аппарат, в тонкие генные структуры, вплоть до молекул ДНК, где токсиканты вмешиваются в самые интимные процессы воспроизводства живого на молекулярном уровне и дезорганизуют его. Аккумуляция токсикантов в гонадах приводит к снижению выживаемости молоди, к рождению уродливых или мутантных особей, что, в конечном счете, снижает численность популяции, а, следовательно, и продуктивность беспозвоночных – зоопланктонов [32].
Снижение количества фильтраторов в водоеме приведет к нарушению питательных цепей и к тому же сильно скажется на процессах самоочищения водоемов, что, в свою очередь, может привести к загрязнению воды органическими веществами.
На показателях токсикологических реакций планктона сказывается эффект фазности. Различают 4 фазы: безразличие, стимуляция, депрессия и смерть[27].
Внешне констатируемое «безразличие» не является действительным показателем отсутствия реакции: «безразличие» на организменном уровне может скрывать глубокие внутриклеточные и молекулярные процессы, медленно накапливающиеся изменения в клетках, их органеллах, хромосомах, ДНК и других микроструктур. Стимуляция же, т.е. интенсификация жизнедеятельности, является первой фазой интоксикации. При длительном воздействии или повышение концентрации токсиканта развивается депрессия, т.е. угнетение жизнедеятельности, которое в конечном итоге может привести к смерти. [27].
Интенсивность действия загрязнителей зависит от изменения факторов внешней среды, а так же от систематического и физиологического, в том числе возрастного, состояния [15].
Так, например, дафнии в более раннем возрасте интенсивней потребляют пищу, и, следовательно, более интенсивно накапливают в своем организме токсиканты.
Чувствительность и устойчивость водных организмов к токсикантам тесно связано с их оксифильностью, а проблема токсичности тесно связано с уровнями «кислородных порогов» и интенсивностью потребления кислорода (ИПК, СПК) при различных условиях. Таким образом, одним из основных показателей токсического эффекта являются, в общем, кислородный обмен [3].
Освещение может стимулировать или угнетать обмен в зависимости от интенсивности света и размера дафний [5].
Большое влияние на токсичность ядов и загрязнителей оказывают температурные колебания. Резкое возрастание токсичности отмечено в пределах 15-250С. В пределах 5-250С изменения температуры могут влиять на время гибели и порог устойчивости животных, снижая величину минимальной летальной концентрации, т. е. токсическое действие многих веществ может проявляться только при повышенных температурах [29].
Таким образом, природные экологические факторы могут изменять – усиливать или ослаблять воздействие токсикантов на водные организмы. У каждой экологической группы гидробионтов существуют свои оптимальные зоны абиотических факторов, зоны комфорта. Опытным путем можно легко установить предпочитаемую оптимальную зону для каждого гидробионта, в пределах которой организм, как правило, более устойчив и к чужеродным к нему факторам [15].
1.5. Современные методы анализа загрязнения водной среды.
Методы биотестирования
В данное время существует множество методов анализа водной среды. Самые распространенные из них – химические. Для этих методов подготовлены и отработаны многочисленные методики, позволяющие определять содержание веществ в пробе. Однако, из-за огромного числа видов самих загрязняющих веществ, источников их выбросов, а так же сложности и высокой стоимости анализов, организовывать постоянные химические экспертизы только средствами аналитической химии практически невозможно. Это невозможно еще и по тому, что химико-аналитический контроль исключает комбинированный характер действия загрязнителей, когда влияние каждого из них может дополнять, усиливать или подавлять друг друга. В этом случае наряду с химическими методами оценки загрязнения окружающей среды производиться так же на основе результатов биологического анализа [20].
Гидробиологической науке и одному из ее разделов – водной токсикологии – принадлежит ведущая роль в обосновании мероприятий , направленных на охрану чистой водной среды. Серьезный научный фундамент водоохранных мер немыслим без получения информации о степени загрязнения водной среды, оценки существующей и потенциальной опасности от поступающих в водоем токсических веществ. Живые организмы способны воспринимать более низкие концентрации веществ, чем любой аналитический датчик, в связи с чем биота может быть подвержена токсическим воздействиям, не регистрируемым техническими средствами контроля [27].
В связи с этим сформировалась концепция токсикологического биотестирования, то есть использования биологических объектов в качесве средства выявления суммарного содержания токсических компонентов в водной среде. Биотестирование, в широком понимании, представляет собой методический прием, основанный на оценке действия фактора среды, в том числе и токсического на организм, его отдельную функцию или систему организмов. Биотестирование с применением гидробионтов может быть использовано для:
· Оценки токсичности загрязненных природных вод;
· Контроля токсичности вод;
· Ускоренной оценки токсичности экстрактов, смывов и сред для санитарно – гигиенических целей
· Первичного исследования перед проведением химического анализа в лабораторных условиях [16].
Цель биотестирования – выявление на гидробионтов степени и характеристики токсичности воды, загрязненной биологически опасными веществами и оценка возможной опасности этой воды для водных и других организмов [30]. Важным требованием, предъявленным к биотестированию, является экспрессность. Обеспечить сокращение процедуры биотестирования можно, применяя тест-объекты, более чувствительные к загрязняющим веществам [10].
В качестве объектов для биотестирования применяются разнообразные тест-организмы - подопытные биологические объекты, подвергающиеся воздействию определенных доз или концентраций ядов, вызывающих у ни тот или иной токсический эффект, который регистрируется и оценивается в эксперименте [3].Это могут быть бактерии, водоросли, беспозвоночные, а так же позвоночные животные. Каждый из объектов имеет свои специфические преимущества и заслуживает внимания, поскольку ни один организм не может служить универсальным тест-объектом, одинаково чувствительным ко всем загрязняющим веществам [21]. Для гарантированного выявления присутствия в природных водах токсического агента известного химического состава должен использоваться набор объектов, представляющих различные группы водного сообщества. Оптимальной может быть система, включающая в качестве тест-объектов по одному виду водных растений, беспозвоночных и рыб (всего 3-5 видов), состояние которых оценивается по параметрам, относящихся к разным уровням интегральности [27].
Различают острые и хронические биотесты. Первые рассчитаны на получение экспресс – информации о токсичности исследуемого вещества для данного тест – организма, вторые – на выявления долговременного эффекта действия токсикантов, в частности малых и ультра малых концентраций. Острые опыты проводятся в различные сроки: от нескольких минут до 96 часов. В результате проведенных опытов учитывается величина выживаемости, т.е. статистически достоверный процент выживаемых или гибнущих особей за определенное время при определенной концентрации вещества [4].
Острые опыты позволяют достаточно оперативно выяснить, оказывает ли данное вещество на исследуемую тест-функцию у данного тест-организма. На их основе можно установить интенсивность угнетения тест-функции за определенное время и развития этого процесса во времени, определить широту спектра действия токсиканта или наличие у него избирательной токсичности отдельных видов [16].
Таким образом, биологические методы тестирования являются группой высокочувствительных методов анализа и выгодно отличаются своей простотой, сравнительной неприхотливостью к лабораторным условиям, дешевизной и универсальностью.
1.6. Физиология Daphnia magna
Действие токсических веществ в определенной степени зависит от особенностей жизнедеятельности тест-организма, его жизненного цикла, морфологии и физиологии.
Короткий биологический цикл развития позволяет проследить рост и развитие дафний на всех жизненных стадиях. При благоприятных условиях в лаборатории дафнии большую часть года размножаются партеногенетическим способом. При недостатке пищи, перенаселенности, изменении температурных условий и уменьшении светового дня в популяции дафний появляются самцы и они переходят к половому размножению [7].
Дафнии – типичные пресноводные формы. Приуроченность к жизни в пресной воде связано с очень слабой способностью этих рачков регулировать внутреннее осмотическое давление. Дафнии весьма устойчивы к понижению концентрации солей крови и могут жить достаточно долго в дистиллированной воде, не получая пищи. [7]. Кроме того, рачки дафний устойчивы к изменениям кислородного режима [27].
Помимо прочих факторов оказывающих заметное влияние на поведение и жизнедеятельность дафний, можно выделить освещение. Свет дафниям необходим для нормального протекания некоторых процессов обмена веществ. Так, например, синтез каротиноидов, входящих в состав тела рачков и их яиц, происходит лишь на свету. Известно, что отношение дафний к свету может быть изменено под влиянием температуры. Положительное отношение к свету проявляют рачки при высокой температуре и значительном освещение или при низкой температуре и затемнении. В тех случаях, когда имеется сочетание света с низкой температурой или темноты с высокой температурой, дафнии становятся отрицательно фототоксичными [8].
Дафнии являются фильтраторами. Отцеживание взвешенных в воде частиц осуществляется при помощи туловищных ножек, которые, полностью утратив роль органов движения, строго дифференцированы для несения определенных функций. [27].
Вместе с тем дафнии являются одним из лучших тест – организмов, жизнь их не долгая и разведение синхронных культур в лабораторных условиях, не составляет труда. Так же дафнии, при жизни в пресной воде, хорошо реагируют на различные примеси в природных водоемах или в лабораторных растворах и в связи с этим широко используются в биотестировании [10].
Таким образом для опытов в качестве тест – организмов были выбраны ветвистоусые рачки вида Daphnia
magna
. В экспериментах нам предстояло оценить целесообразность использования методов оценки токсичности воды по выживаемости и реакции всплытия рачков, в зависимости от концентрации нефти и нефтепродуктов. В качестве токсикантов, было решено взять сырую нефть, дизельное топливо и бензин марок АИ80, АИ92 и АИ 95.
2. Объект и методы исследования
В качестве тест-объектов в работе использовались ветвистоусые рачки вида Daphnia
magna. Их систематическое положение следующее:
Тип Arthropoda
П/тип Branchiopoda
Отряд Phillopoda
П/отряд Cladocera
Семейство Daphniida
Оценка действия нефтепродуктов на выживаемость дафний проводилась согласно методике определения токсичности водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов, питьевой, сточной, природной воды по смертности тест-объекта Daphnia magna Straus [31].
Эксперименты по определению чувствительности дафний к нефтепродуктам в зависимости от концентрации и времени экспонирования производились в сравнении с контрольными пробами.
Для экспериментов готовились растворы с различными концентрациями токсикантов, представленными в таблице 1.
Для приготовления суспензии в 200 мл отстоянной водопроводной воды добавляли 2 мл токсиканта, для получения максимальной концентрации 10 мл/л, и тщательно перемешали в течение одного часа, в качестве устройства для перемешивания использовалось устройство для выращивания водоросли хлореллы КВ-05, с отключенным светом и затем интенсивно встряхивали руками около 5 минут.
Для приготовления водорастворимой фракции, перемешивали в течении 3 часов в КВ-05, затем переливали водную эмульсию в делительный цилиндр, отстаивали в течении 20 минут и сливали через кран слой водного раствора, находящийся под маслянистой пленкой, которая в итоге оставалась в цилиндре.
Таблица 1 - Концентрации токсикантов в тестируемых растворах.
| токсикант | Концентрация, мл/л | ||||
| нефть | 10 | 1 | 0,1 | 0,01 | 0,001 |
| Дизельное топливо | 10 | 1 | 0,1 | 0,01 | 0,001 |
| Бензин АИ 80 | 10 | 1 | 0,1 | 0,01 | 0,001 |
| Бензин АИ 92 | 10 | 1 | 0,1 | 0,01 | 0,001 |
| Бензин АИ 95 | 10 | 1 | 0,1 | 0,01 | 0,001 |
| Водорастворимая фракция нефти | 10 | 1 | 0,1 | 0,01 | 0,001 |
| Водорастворимая фракция ДТ | 10 | 1 | 0,1 | 0,01 | 0,001 |
Затем проводили ряд десятикратных разбавлений по схеме указанной на рисунке 1.
Рисунок 1 - Схема десятикратного разбавления суспензии токсиканта.
Далее в стеклянные флаконы наливали по 50 мл испытуемых растворов, по три флакона на каждую концентрацию и три флакона в качестве контроля, т.е. в эксперименте было задействовано 18 флаконов. Затем в каждый флакон помещали по десять особей рачков Daphnia magna. Для проведения биотестирования использовались особи в возрасте 24 часа, для чего предварительно осуществлялось синхронизированное выращивание культуры рачков одинакового возраста.
Флаконы с пробами воды и тест-организмами экспонировались в устройстве для экспонирования рачков УЭР-03 в течение двух суток, в климатостате Р2. Для экспонирования дафний использовался отдельный климатостат, для того что бы маточная и синхронизированная культуры не пострадали от токсического действия паров нефтепродуктов.
Показания смертности и всплытия снимались через 48 часов после помещения тест – организмов в испытуемые растворы. Количество кислорода измерялось сразу после приготовления суспензий и через 48 часов.
Обработка результатов производилась в пакете Microsoft Office Excel 2007.
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Оценка токсичности сырой нефти по выживаемости и всплытию дафний
Для решения первой задачи была приготовлена водная эмульсия сырой нефти, с концентрациями в диапазоне от 10 до 0,001 мл/л. Рачки экспонировались в течении 48 часов, после чего подсчитывалось количество живых и всплывших особей. Количество кислорода измерялось в начале постановки эксперимента и через 48 часов. Результаты представлены на рисунках 2-3.
Рисунок 2 - Выживаемость и всплытие рачков Daphnia magna в зависимости от концентрации сырой нефти в водной эмульсии.
Рисунок 3 - Количество кислорода в зависимости от концентрации сырой нефти в водной эмульсии.
При исследовании токсичности водных эмульсий сырой нефти (рис. 2) было выявлено, что максимальная концентрация (10 мл/л) вызывала 100% смертность тест-организмов. Концентрация, вызывающая смертность 50 % тест-организмов находилась в диапазоне от 0,01 мл/л до 0,1 мл/л, а в наименьшей исследуемой концентрации токсиканта (0,001 мл/л) наблюдалась смертность дафний на уровне 35%.
При этом всплытие всех дафний наблюдалось даже при минимальной концентрации нефти в растворе.
Количество кислорода (рис. 3) в водной эмульсии нефти с ростом ее концентрации монотонно снижалось. Так же четко видно, что во всех исследованных пробах кислород снижался не больше, чем на 20 %, а разница содержания кислорода в начале постановки эксперимента и через 48 часов меняется незначительно. Из литературных источников известно, что такое изменение концентрации кислорода в воде не может быть губительным для дафний или вызывать их массовое всплытие к поверхности раствора. Летальный уровень содержания кислорода в воде для рачков составляет в среднем менее 35 % [30] .Это позволяет нам сделать предположение, что скорей всего всплытие происходит из-за залипания дафний в поверхностной маслянистой пленке, в результате чего дафнии лишаются возможности двигаться и дышать.
Рисунок 4 - Выживаемость и всплытие рачков Daphnia magna в зависимости от степени разведения водорастворимой фракции нефти.
Рисунок 5 - Количество кислорода в зависимости от степени разведения водорастворимой фракции нефти.
Для того, чтобы исключить действие маслянистой пленки на дафний, было решено провести опыт с водорастворимой фракцией нефти.
Результаты проведенных экспериментов показали, что в водорастворимой фракции нефти только при минимальном разведении выживаемость (рис. 4) снижалась на 15%, в сравнении с контролем, и только в этой концентрации наблюдалось незначительное всплытие тест-организмов. При больших разведениях достоверных изменений выживаемости и всплытия рачков относительно контроля зарегистрировано не было.
При этом количество кислорода во всех разведениях водорастворимой фракции нефти снижалось не менее, чем на 5% и практически не изменялось к концу эксперимента.
Таким образом, можно сделать вывод, что причиной гибели рачков при загрязнении водной среды сырой нефтью в большей степени является их залипание в поверхностной маслянистой пленке (физическое воздействие), а не токсичность составляющих ее компонентов.
3.2.Оценка токсичности нефтепродуктов по выживаемости и всплытию дафний
В следующей серии экспериментов перед нами стояла задача исследовать токсическое действие нефтепродуктов, а именно бензина марок АИ 80, АИ 92, АИ 95 и дизельного топлива на выживаемость и всплытие тест-организмов. Как и в предыдущих опытах, количество кислорода измеряли в момент постановки эксперимента и через 48 часов. Результаты представлены на рисунках 6-13.
После проведения экспериментов с бензином различных марок видно, что с ростом концентрации токсиканта выживаемость рачков монотонно снижается. При минимальной концентрации (0,001 мл/л) в бензине марок АИ 80 и АИ 92, смертность не превышает 10 %, в то время как при такой же концентрации в бензине марки АИ 95, наблюдается смертность более 50% тест – организмов. Бензин АИ 92 и АИ 95 при максимально взятой нами концентрации (10 мл/л) вызывает 100% смертность рачков, в отличие от бензина марки АИ 80, который при той же концентрации, поддерживает выживаемость рачков на уровне 7%.
Всплытие тест – организмов к поверхности раствора ни в одном из бензинов и ни в одной из взятых концентрации не наблюдается.
Количество кислорода с увеличением концентрации токсиканта и временем экспонирования снизилось не более чем на 10%.
Рисунок 6 - Выживаемость и всплытие рачков в зависимости от концентрации бензина АИ 80.
Рисунок 7 - Количество кислорода в зависимости от концентрации бензина АИ 80.
Рисунок 8 - Выживаемость и всплытие рачков в зависимости от концентрации бензина АИ 92.
Рисунок 9 - Количество кислорода в зависимости от концентрации бензина АИ 92.
Рисунок 10 - Выживаемость и всплытие рачков в зависимости от концентрации бензина АИ 95.
Рисунок 11 - Количество кислорода в зависимости от концентрации бензина АИ 95.
Рисунок 12 - Выживаемость и всплытие рачков в зависимости от концентрации дизельного топлива.
Рисунок 13 - Количество кислорода в зависимости от концентрации дизельного топлива.
При оценки результатов видно, что в водных эмульсиях бензина всплытия рачков не происходит, в то время как при минимальных концентрациях дизельного топлива наблюдается 100% всплытие тест-организмов. Так же нами было отмечено, что в растворах дизельного топлива, так же как и в водной эмульсии нефти образовывалась поверхностная маслянистая пленка.
Количество кислорода в пробах водной эмульсии дизельного топлива снижается по сравнению с растворами бензина. Однако, и по сравнению с водной эмульсией нефти концентрация кислорода снизилась на 15%, это может быть вызвано, тем, что в растворе происходят химические реакции с использованием кислорода. В связи с этим наблюдением было решено исследовать токсичность водорастворимой фракции дизельного топлива. Результаты представлены на рисунках 14-15.
Рисунок 14 - Выживаемость и всплытие рачков в зависимости от степени разведения водорастворимой фракции дизельного топлива.
Рисунок 15 - Количество кислорода в зависимости от степени разведения водорастворимой фракции дизельного топлива.
По представленным результатам мы можем сделать вывод, что бензин имеет отличный от нефти и дизельного топлива характер действия т.к. не образуют поверхностной маслянистой пленки и залипания рачков не происходит. То есть бензин действует на организмы непосредственно своим химическим составом, в то время как нефть воздействует не на химическом уровне, а на физиологическом.
3.3. Сравнение токсического действия сырой нефти и нефтепродуктов на дафний
Для проведения сравнения токсичности серой нефти и нефтепродуктов полученные нами результаты представлены в виде общей таблицы.
Таблица 2 - Влияние сырой нефти и нефтепродуктов на выживаемость, всплытие рачков и изменение концентрации кислорода.
| Концентрация, мл/л | Выживаемость, % | Всплытие, % | Кислород,% Через 48 часов |
| Сырая нефть | |||
| 0,001 | 73,3 | 100 | 96,7 |
| 0,01 | 46,7 | 100 | 93,7 |
| 0,1 | 16,7 | 100 | 89,7 |
| 1 | 0 | 100 | 82,7 |
| 10 | 0 | 100 | 79,3 |
| Дизельное топливо | |||
| 0,001 | 86,7 | 100 | 88 |
| 0,01 | 73,3 | 100 | 81,7 |
| 0,1 | 26,7 | 100 | 74,3 |
| 1 | 13,3 | 100 | 68,7 |
| 10 | 0 | 100 | 61,7 |
| Бензин АИ 95 | |||
| 0,001 | 36,6 | 0 | 97,7 |
| 0,01 | 26,6 | 0 | 96,3 |
| 0,1 | 13,3 | 0 | 96 |
| 1 | 6,6 | 0 | 94,7 |
| 10 | 0 | 0 | 93, 7 |
| Концентрация, мл/л | Выживаемость, % | Всплытие, % | Кислород,% Через 48 часов |
| Водорастворимая фракция дизельного топлива | |||
| 0,001 | 100 | 0 | 97,3 |
| 0,01 | 96,7 | 3,3 | 95,3 |
| 0,1 | 83,3 | 3,3 | 94,3 |
| 1 | 53,3 | 3,3 | 93 |
| 10 | 20 | 6,7 | 91 |
| Водорастворимая фракция нефти | |||
| 0,001 | 100 | 0 | 99 |
| 0,01 | 100 | 0 | 97,7 |
| 0,1 | 100 | 0 | 97,3 |
| 1 | 80 | 0 | 96,7 |
| 10 | 80 | 2,7 | 96,7 |
Из таблицы №2 видно, что наибольшая смертность организмов наблюдается в водной эмульсии нефти, но сказать о, том, что сырая нефть является наиболее токсичной, мы не можем, т.к. нами было выявлено, что нефть, дизельное топливо и бензин имеют различный характер воздействия на тест – организмы. Большая смертность организмов в водных эмульсиях нефти, вызвана образованием толстой маслянистой пленки на поверхности раствора, в которой происходит залипание рачков, обездвижение и затруднение доступа к кислороду, в то время, как бензин, не образуя пленки, воздействует на организм непосредственно своим химическим составом. Дизельное топливо, которое так же образует поверхностную пленку и тем, самым способствуя снижению кислорода, в водной эмульсии оказывает менее токсичное воздействие, но при удалении из эмульсии водонерастворимой фракции является более токсичным, в сравнение с водорастворимой фракцией нефти.
Таким образом, можно сделать вывод, что сырая нефть является токсичной, только при наличии водорастворимой фракции, которая и образует поверхностную маслянистую пленку.
Заключение
По результатам проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. С ростом концентрации сырой нефти, выживаемость рачков снижается, 100% всплытие тест – организмов происходит даже при минимальной концентрации, в то время, как концентрация кислорода снижается не более чем на 25%.
2. С ростом концентрации нефтепродуктов выживаемость рачков монотонно снижается, всплытие рачков наблюдается только в водных эмульсиях дизельного топлива, где так же и концентрация кислорода снижается до 60%.
3. Сырая нефть, дизельное топливо и бензин имеют различный характер действия на организмы, бензин марки АИ 95 является наиболее токсичным.
Список использованных источников
1. Акулева, К.А. Методика количественной оценки эффекта действия токсических веществ на массовые виды планктонных ракообразных на уровнях особи и популяции / К.А. Акулева, Л.П. Брагинский, И.Л. Буртная., Ю.Ю. Горбань // Методики биологических исследований по водной токсикологии: сб. науч. тр. / М.: Наука, 1986. – 193с.
2. Брагинский, Л.П., Пресноводный планктон в токсической среде [Текст] науч.изд. /И.Н. Величко, Л.П. Брагинский - Киев: из-во Наукова думка, 1987 - 237с.
3. Брагинский, Л.П. К методики токсикологического эксперимента с тяжелыми металлами на гидробионтах [Текст] науч. изд./Л.П., Брагинский, П.Н. Линник - М. 2003 – 58с.
4. Гиляров А.М. Зоология беспозвоночных [Текст]: Т.3 Биология ветвистоусых ракообразных \ А.М. Гиляров. - М. 1998 – 371с.
5. Григорьев, Ю.С.; Методика определения токсичности водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов, питьевой, сточной, природной воды по смертности тест - объекта Daphnia magna Straus (ПНД Ф 14.1:2:4.12-06 16.1:2.3.3.9-06) [Текст] науч. изд./ Ю.С. Григорьев, Шашкова Т.Л. - М. 2006 - 44 с.
6. Донченко, В.К., Экологическая экспертиза [Текст] учеб. / В.К. Донченко, В.М. Питулько, В.В. Растоскуев, Н.Д. Сорокин, С.А. Фролова. – М. 2004. – 480 с.
7. Жмур, Н.С.; Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и плодовитости дафний [Текст] науч. изд. / Н.С. Жмур – М.: из-во АКВАРОС, 2001 – 208с.
8. .Жмур, Н.С., Государственный контроль токсичности вод методами биотестирования в России [Текст] учеб. / Н.С. Жмур - М.: из-во Международный дом Содружества, 2000 – 163с.
9. Ивлева И.В.; Биологические основы и методы массового культивирования кормовых беспозвоночных [Текст] науч. изд. / И.В. Ивлева - М.: 1948 – 190с.
10. Исуев, А.Р; Опыты на дафниях / А.Р Исуев // Лабораторный практикум по курсу ихтиотоксикология науч.тр. / ДГУ, 1998 – 23с.
11. . Карпевич, А.Ф.; Реакции гидробионтов на загрязнения [Текст] учеб. / А.Ф. Карпевич - М.: из-во Наука, 1983 – 74с.
12. Киселева И.А.; Планктон морей и континентальных водоемов[Текст] учеб. / И.А. Киселева - М.: 1980 – 148с.
13. . Кульский, Л.А., Справочник по свойствам, методам анализа и очистки воды [Текст] науч. изд./ Л.А. Кульский, И.Т. Гороновский, А.М. Когановский, М.А. Шевченко - Киев: из-во Наукова думка, 1980 165с.
14. Кульский, Л.А., Чистая вода и перспектива ее сохранения [Текст] науч. изд. / Л.А. Кульский, В.В.Даль - Киев: 1978 - 273с.
15. Лебедева, Г.Д.; Экологический подход к оценки устойчивости пресноводных гидробионтов [Текст] учеб. / Г.Д. Лебедева – Ярославль: ЯрГУ, 1989 – 337с.
16. Лесников, Л.А.; Методики биологических исследований по водной токсикологии [Текст] науч. изд./ Л. А. Лесников - М.: из-во Наука, 1971 – 34с.
17. Лесников, Л.А.; Основные задачи, возможности и ограничения биотестирования [Текст] учеб. / Л.А. Лесников - Волгоград, 1983 – 91с.
18. Лосев, К.С., Проблемы экологии России [Текст] учеб. / К.С. Лосева, В.Г. Горшков, К.Я. Кондратьев и др. - М. 1993 – 211с.
19. Лукьяненко, В.И.; Теоретические основы биотестирования [Текст] науч. изд. / В.И. Лукьяненко - М., 1983 170с.
20. Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90. – М, 1990 - 47с.
21. Мухленов, И.П.,; Основы химической технологии [Текст] учеб. / И.П. Муленов, В.Д. Тамбовцева, А.Е. Горнштейн – М., из-во Высшая школа, 1975 – 331с.
22. Миронов, О.Г.; Взаимодействие морских организмов с нефтяными углеводородами [Текст] науч. изд./ О.Г.Миронов - Л. 1985 – 69с.
23. Протасов, В.Ф. Экология, здоровье и охрана окружающей среды в России [Текст] учеб. / В.Ф. Протасов - М., 2001 – 58с.
24. Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов / РЭФИА, НИА – Природа – М., 2002 – 204с.
25. Сапрыкина, А. Ю.; Технология снижения содержания нефтепродуктов в воде малых и средник рек [Текст] науч. изд./ А.Ю. Сапрыкина – М., 2005 – 169с.
26. Стом, Д.И. Токсикологическая оценка нефтезагрязненных вод с помощью ракообразных / Д.И, Стом, А.Э. Балаян, Д.И. Саксонов, Д.В. Лозовой // , Сиб. экол. ж. 10, № 5., 2003 - 565-567с.
27. Строганов, Н.С.; Методика определения токсичности водной среды/ Н.С. Строганов // Сб. Методики биологических исследований по водной токсикологии - М., из-во Наука 1978.
28. Филенко Е.Ф., Реакции гидробионтов на загрязнения [Текст] учеб. / Е.Ф. Филенко, Е.Ф. Исакова - М., из-во Наука, 1983 – 264с.
29. Флеров Б.А. Эколого-физические аспекты токсикологии пресноводных животных [Текст] науч. изд./ Б.А. Флеров - Л., из-во Наука, 1989 – 43с.
30. Чалов И.В. Оценка качества природных и сточных вод методами биотестирования с использованием ветвистоусых ракообразных [Текст] науч. изд./ И.В. Чалов, А.В. Крылов – Российская Академия Наук - Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Попанина.
31. Черных С.И. Распределение Daphnia magna в условиях температурного, кислородного, и светового градиента/С.И. Черных// – Зоология. -1964 -№5-Сю 24 - 26.
32. Черкашин С.А Отдельные аспекты влияния углеводородов нефти на рыб и ракообразных/ С. А. Черкашин// - Вестник ДВО РАН.- 2005 - № 3 – С.35 – 37.
33. Шашкова Т.Л., Ю.С. Григорьев, О.А. Березина Влияние условия среды на чувствительность рачков Daphnia magna к токсикантам. / Шашкова Т.Л., Ю.С. Григорьев, О.А. Березина // - Вестник КрасГУ, -2006 - №5/1-С.81-85.
34. Environmental Monitoring and Assessment. – Netherlands.: Kluwer Academic Publishers, 2001. p. 105 – 116.
35. Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. Fifth Editions. – Pennsylvaniya Avenue, NW
