Российский Государственный Аграрный Университет МСХА им. Тимирязева

Кафедра микробиологии
Реферат

Вирусы огурца
                                                                          Выполнил: Злобин Илья

                                                                       Проверила: Годова Г.В.                                                                                                                                                                                       
                                                                 
Москва 2008

Содержание

1. Вирус обыкновенной огуречной мозаики.

1). Общая характеристика.

2). Описание и свойства вирусных частиц.

3). Пути распространения и вредоносость.

4). Диагностика вируса.

2. Вирус некроза огурца.

1). Общая характеристика.

2). Описание и свойства вирусных частиц.

3). Пути распространения и вредоносость.

4). Диагностика вируса.

3. Вирус пятнистости листьев огурца.

1). Общая характеристика.

2). Описание и свойства вирусных частиц.

3). Пути распространения и вредоносость.

4). Диагностика вируса.

4. Вирус некроза табака.

1). Общая характеристика.

2). Описание и свойства вирусных частиц.

3). Пути распространения и вредоносость.

4). Диагностика вируса.

5. Спутничный вирус.

1). Общая характеристика.

2). Описание и свойства вирусных частиц.

3). Пути распространения и вредоносость.

4). Диагностика вируса.

6. Вирус зеленой крапчатой мозаики огурца.       

1). Общая характеристика.

2). Описание и свойства вирусных частиц.

3). Пути распространения и вредоносость.

4). Диагностика вируса.
1. Вирус обыкновенной огуречной мозаики.
1). Общая характеристика.

Другое название – вирус огуречной мозаики 1 (Cucumis virus 1). Относится к группе кукумовирусов вместе с такими вирусами, как вирус аспермии томатов, вирус карликовости земляного ореха и т.д.  Распространен по всему миру, большей частью в тропическом и умеренном климате.

ВОМ-1 имеет самый широкий круг хозяев среди всех растительных вирусов, включающий более 1200 видов растений из более чем 100 семейств двудольных и однодольных растений. Вирус поражает тыквенные, примулу, шпинат, гречиху посевную, томаты, перец, клевер, люпин, люцерну, фиалку, сою, бананы, виноград и т.д. Имеет множество штаммов, которые различаются по вызываемым симптомам поражения, кругу хозяев, способам передачи, физико-химическим свойствам, нуклеотидной последовательности и серологически. Большая часть штаммов имеет ограниченное географическое распространение. Среди наиболее известных штаммов вируса следующие: 6; О; Y; Q; S; D; Ix; M; B; LS; WL; Fny; Tfn; NTg.

По сходству в аминокислотном составе белков оболочки и в нуклеотидной последовательности РНК штаммы делятся на две подгруппы: подгруппу I и подгруппу II. Подгруппа I может быть также разделена на подгруппы IA и IB. Подгруппы IA и II, по всей видимости, имеют общее происхождение.

Для сохранения культур вируса широко применяется Nicotiana tabacum и N.glutinosa; для очистки – N.tabacum и N.clevelandii.
2). Описание и свойства вирусных частиц.

      Вирус РНК-содержащий, имеет трехкомпонентный геном. РНК вируса одноцепочечная, упакована в три разных частицы. Все частицы имеют одинаковую величину и при центрифугировании осаждаются с одинаковой скоростью. Частицы легко разрушаются в нейтральных растворах хлоридов высокой концентрации. Плавучая плотность 1.36 г/см³ в CsCl после фиксации частиц формальдегидом, 1.34 г/см³ в RbCl. Масса вирусных частиц (дальтон) 5.0×10⁶. Коэффициент диффузии 1.29-1.35 при использовании лазерного светорассеяния. Изоэлектрическая точка 4.75. Удельный объем частиц 0.701. Подвижность при электрофорезе зависит от конкретного штамма: например, для штамма S она составляет               8×10^-5см²сек^-1вольт^-1 в 0.1М фосфатном буфере, рН 7.0.

Вирусные частицы имеют правильную икосаэдрическую форму, 30.5 нм в диаметре. Частицы устойчивы в растворе молибдата аммония. Частицы содержат 180 белковых субъединиц, объединенных в 12 пентамеров и 20 гексамеров. Трехмерная структура вирусных частиц была определена методом рентгеноструктурного анализа. РНК компактно упакована внутри протеиновой оболочки. Структура частиц в основном стабилизируется электростатическим взаимодействием РНК и белка друг с другом, которое имеет место между отрицательно заряженными фосфатными группами РНК и положительно заряженными остатками аргинина на N-конце полипептидных цепей белков оболочки. Частицы могут быть легко разложены на составляющие их компоненты и обратно объединены в биологически активные частицы.

РНК вируса одноцепочечная, составляет около 18% веса частицы. Соотношение Г:А:Ц:У составляет 24:23:23:30. Существует 6 различных видов вирусной РНК с молекулярной массой 1.07×10⁶; 0.95×10⁶; 0.69×10⁶;  0.25×10⁶; 0.11×10⁶; 0.01×10⁶. Из шести вышеназванных видов первые четыре преобладают. Для обладания инфекционностью нужны только 3 первых вида, четвертый вид является матрицей для синтеза белков оболочки, будучи производным третьего вида. Первый и второй виды инкапсулированы раздельно, в то время как третий и четвертый виды упакованы вместе в составе одной и той же частицы. Есть данные о существовании частиц, содержащих 3 молекулы РНК четвертого вида. Таким образом, вирусные препараты содержат как минимум 3 разных вида частиц.

Сходство в нуклеотидной последовательности между изолятами вируса составляет от 90 до 98% внутри подгруппы I и 98% внутри подгруппы II; сходство между изолятами из разных подгрупп составляет от 65 до 70%.

Также вирусные частицы могут содержать небольшие одноцепочечные молекулы спутничной РНК, которая не нужна для репликации ВОМ, но зависящей от репликации, упаковывания и передачи РНК ВОМ. Спутничная РНК может влиять на уровень репликации РНК вируса. В присутствии спутничной РНК до 90% двухцепочечной РНК, присутствующей в зараженном растении, может соответствовать спутничной РНК, в зависимости от вида хозяина, с определенным снижением уровня РНК1 и РНК2. Определены нуклеотидные последовательности и детально изучена структура более чем 40 видов спутничной РНК.

Капсид вируса состоит из 180 одинаковых белковых субъединиц с молекулярной массой 24500 (определено методом электрофореза в полиакриламидном геле). Белок оболочки может быть отделен путем разрушения вирусных частиц и осаждения РНК 2М LiCl. Последовательность аминокислотных оснований изменяется в пределах    2-3% внутри подгруппы II, 2-15% внутри подгруппы II и 25% между подгруппами I и II. Белок имеет гидрофильный, богатый аргинином N-конец. Вирусный белок 3а присутствует в плазмодесмах между всеми типами клеток листа. Белок 2b присутствует в ядре, а белки 1а и 2а ассоциированы с мембраной. Движение вирусных частиц происходит через плазмодесму и направляется белком 3а с вовлечением в процесс белков оболочки, однако конфигурация вирионов не очень важна для передвижений частиц из клетки в клетку. Белок оболочки необходим для дальнего передвижения частиц.

 

Вирусные частицы относительно нестойки, в т.ч. в растительном соке. Температура инактивации (10 мин.) составляет 55-70⁰С. Предельное разведение сока составляет 1:1000. Инфекционность может быть утеряна в течение нескольких (менее 10) дней. Инфекционность ингибируется листовыми экстрактами всех исследованных растений и уничтожается обработкой рибонуклеазами. Культура вируса может быть сохранена в замороженных клетках инфицированных растений; очищенные вирионы могут быть сохранены в 5мМ борате натрия, 1.5мМ этилендиаминтетрауксусной кислоте, 50%-ном растворе глицерина при      -20⁰С; очищенная вирусная РНК – при -20⁰С.
3). Пути распространения и вредоносность.

Вирус характеризуется природной очаговостью. Природными резерваторами вируса являются зараженные многолетние растения: осот полевой, люцерна, гулявник, пастушья сумка, бодяк, барвинок малый и т.д.

Вирус передается тремя путями: с тлями, с семенами и повиликой.

Передача тлями.

Вирус передается неперсистентно более чем 80 видами тлей из 33 родов. Myzus persicae и Aphis gossypii являются наиболее важными переносчиками. Эффективность передачи зависит от штамма вируса, вида тли, вида растения-источника инфекции и вида заражаемого растения. Вирус передается любой из возрастных стадий тлей в течение 5-10 секунд кормления. Способность к передаче уменьшается после кормления в течение 2 минут и обычно теряется в пределах двух часов. Известны изоляты вируса, потерявшие способность к передаче тлями. Различия в способности к передаче разнообразных изолятов различными видами тлей определяется различиями в строении белков оболочки.
Передача с семенами.

Известна передача вируса через семена более чем 20 видов растений, при этом эффективность передачи может варьировать от долей процента до 50%. Вирус может присутствовать в зародыше, эндосперме и в семенных покровах, а также в пыльце. Передача вируса с семенами сорняков имеет большое эпидемиологическое значение.

Вредоносность.

Вирус наносит большой экономический ущерб, вызывая заболевания  значительного количества важных сельскохозяйственных культур. Вызывает мозаику огурца, дыни и других тыквенных, скручивание листьев шпината, мозаику, папоротниковидность листьев и системный некроз томата, мозаику и кольцевую пятнистость перца, мозаику и задержку роста клевера, люпина и люцерны, задержку роста сои, мозаику, инфекционный хлороз и сердцевинную гниль банана, а также мозаику и карликовость у многих других видов однодольных и двудольных растений. В присутствии спутничной РНК вызывает системный некроз томата, отмеченный во Франции, Италии, Испании и Японии.

4). Диагностика вируса.

Физические, биологические и антигенные свойства различных кукумовирусов частично совпадают, что затрудняет надежное определение вируса и его различных изолятов. Для диагностики вируса применяют следующие методы: растений-индикаторов, электронно-микроскопический, включений, серологический, ПЦР-диагностика.

Метод растений-индикаторов.

Не очень надежен в данном случае, т.к. спектр хозяев вируса очень широк, а симптомы могут быть неспецифическими. Разнообразие симптомов зависит от вида растения-хозяина и от штамма вируса.

На Cucumis sativus вирус вызывает весьма многообразные признаки поражения. На молодых листьях появляются небольшие кольца, затем развивается типичная мозаика. У больных растений укорачиваются междоузлия, рост замедляется. В некоторых случаях вирус вызывает увядание растений. Плоды – мозаичные, с выпуклыми участками, что создает впечатление бородавчатости.

На Beta vulgaris вирус вызывает местные крупные хлоротичные поражения, системной инфекции нет.

На Сhenopodium amaranticolor и C.quinoa вирус вызывает хлоротичные или некротические местные поражения, редко – системную инфекцию. При этом C.quinoa в природе вирусом не поражается.

На различных видах тыквенных вирус вызывает системную мозаику и карликовость разной степени тяжести.

На Lycopersicon esculentum вирус вызывает мозаику и карликовость с нитевидными листьями, часто – папоротниковидность листьев.

На Phaseolus aureus и P.vulgaris вирус вызывает небольшие темно-красные некротические поражения на инокулированных листьях.

На Vigna unguiculata вирус вызывает крупные (изоляты подгруппы I) или мелкие (изоляты подгруппы II) коричневые поражения на инокулированных листьях. Только некоторые изоляты подгруппы I вызывают слабую системную мозаику.

Nicotiana tabacum и N.glutinosa дают специфическую реакцию на вирус.

На N.tabacum вирус вызывает мозаику и карликовость различной степени тяжести, что зависит от штамма вируса. Некоторые штаммы вызывают тяжелый хлороз. На инокулированных листьях большинство изолятов подгруппы I не вызывает симптомов поражения, но большинство изолятов подгруппы II вызывают образование гравировки.

На N.glutinosa вирус вызывает системную мозаику и деформацию листьев.

Электронно-микроскопический метод.

Т.к. ВОМ имеет нестойкие вирионы, то для приготовления препаратов вируса необходимо применять различные дополнительные приемы, способствующие стабилизации вирусных частиц. Для ВОМ необходимо использовать только негативное контрастирование. Может быть использована следующая методика: кусочки листьев фиксируются в 5-10%  растворе формалина 2-3ч., после чего промываются в дистиллированной воде. Затем свежесрезанный край листа погружается в каплю 2%-ной фосфорновольфрамовой кислоты на 2-3сек.

Большую роль в приготовлении качественных препаратов вируса играет очистка препаратов. Инфицированные листья измельчаются в равном объеме 0.5М цитрата натрия, рН 6.5, содержащего 0.5% тиогликолевой кислоты. Однородная смесь смешивается с одним объемом хлороформа и центрифугируется при 12000g в течение 10 минут. Вирус осаждается из водной фазы путем добавления полиэтиленгликоля (молекулярная масса 8000), аккуратно размешивается в течение 30-45 минут при 0-4⁰С и центрифугируется при 7000g в течение 20 мин.. Осадок снова растворяется в 50мМ цитрате натрия рН 7.0, содержащем 2% Тритона X-100, и размешивается в течение 30 мин. перед центрифугированием при 19000g в течение 15 мин. Дополнительная очистка достигается использованием циклов дифференциального центрифугирования и/или центрифугирования в 2-25% растворе сахарозы. Очищенные препараты вирусных частиц растворяются в 50мМ цитрате натрия, рН 7.0, или в 50мМ цитрате натрия с 5мМ боратом натрия, рН 9.2. Для новых штаммов, которые не могут быть очищены этим методом, используется альтернативный метод с применением фосфатного буфера для экстракции, избегая применения органических растворителей. Большинство штаммов, однако, агрегируют в фосфатных буферах.

Недостатком данного метода диагностики является то, что вирусы по размеру и внешнему виду сходны с рибосомами, что делает сложным определение вируса в клеточных препаратах. Впрочем, этот недостаток преодолим, т.к. рибосому могут быть разложены без последствий для вирусных частиц.


Метод включений.

Вирусные частицы содержатся практически во всех тканях зараженного растения. В клетке они разбросаны по всей цитоплазме, могут обнаруживаться также в ядре и вакуолях, но отсутствуют в митохондриях, хлоропластах и плазмодесмах. Агрегаты частиц, окруженные мембраной, присутствуют в ситовидных элементах флоэмы. Частицы также могут агрегировать в прозрачные структуры, находящиеся в вакуолях, где они могут быть обнаружены световой микроскопией. В поздней стадии инфекции в цитоплазме могут быть обнаружены трубковидные структуры, состоящие из цистерн диктиосом и содержащие частицы, похожие на вирусные. Небольшие мембранные впячивания иногда связаны с мембраной тонопласта.

Серологическая диагностика.

Вирус малоиммуногеничен. Наиболее часто используется ЭЛИЗА-тест в «сэндвич»-варианте, т.к. данный вариант показывает наибольшую штаммовую специфичность. В качестве фермента-маркера используется либо щелочная фосфатаза, либо пероксидаза хрена (более чувствительна). Одним из вариантов проведения теста является следующий: очищенный препарат вируса вводят кроликам в область шейных лимфоузлов подкожно в несколько точек, вводя 0.3-0.5 мг вируса с равным объемом адьюванта Фрейнда дважды с интервалом 30-40 сут. Кровь берется через 7-11 сут. после последней инъекции. Титр сыворотки, полученной таким образом, составляет 1:1024. Сыворотка реагирует с очищенными препаратами ВОМ и соком зараженного растения, но не реагирует с другими вирусами и соком здорового растения. Иммуноглобулиновая фракция из антисыворотки осаждается добавлением равного объема полиэтиленгликоля (молекулярная масса 6000). Полученный осадок растворяют в 0.01М фосфатном буфере,    рН 7.4, содержащем 0.1М NaCl, в течение 18 ч. при 4⁰С. Растворенные иммуноглобулины сорбируются на поверхности полистироловых микроплат в течение 18 ч. при 4⁰С. Затем добавляют 200 мкл раствора антигена в буфере с добавлением 0.05%-ного Tween-20 и инкубируют 1 ч. при 37⁰С. После этого добавляют 200 мкл растворенного в буфере конъюгата (комплекс иммуноглобулинов с пероксидазой хрена) и инкубируют 1 ч. при 37⁰С. Затем в лунки микроплат вносят субстрат – смесь 5-аминоациловой кислоты с Н₂О₂ и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Оптимальная концентрация иммуноглобулина составляет 1-5 мкг/мл, а конъюгата – 1250 нг/мл. Оптическую плотность  продукта определяют на фотометре при 490 нм. Метод позволяет обнаружить вирус в концентрации до 10 нг/мл, определять вирус в экстрактах из листьев огурца при разведении до 10^-4, из плодов томатов – до 10^-3, из завязей и плодов огурца (там концентрация вируса меньше) – до 10^-2.

ПЦР-диагностика.

Для точной диагностики ВОМ именно ПЦР-диагностика кажется наиболее приемлемой. ПЦР (полимеразная цепная реакция) позволяет избирательно амплифицировать интересующий участок ДНК в миллионы раз за несколько часов, используя в качестве стартового материала сложные смеси ДНК и РНК, являясь фактически реакцией клонирования in vitro. Сущность метода состоит в том, что заранее выбранный участок ДНК служит матрицей для синтеза большого количества копий ДНК. Специфичность метода обеспечивается с помощью пары синтетических олигонуклеотидных праймеров, комплементарных концевым группам нуклеотидов участков с интересующей нас последовательностью. С помощью вектора, способного распознавать комплементарные структуры, из анализируемых сложных смесей захватываются родственные фрагменты ДНК, которые в присутствии ДНК-полимеразы на матрице одноцепочечной ДНК копируются и накапливаются в концентрациях в десятки миллионов раз больших (до микрограммовых количеств), чем их содержалось в исходной смеси. Размеры фрагментов при этом могут составлять от 100 до нескольких тысяч нуклеотидных пар. Это достигается тем, что в каждом цикле (а их может быть 25-30) вновь образующиеся цепи ДНК служат матрицей для синтеза в последующем. При этом примеси – не ограниченные праймерами копии  ДНК – способны за то же время образовать лишь 25-30 таких копий, т.к. синтез идет только с исходных родительских цепей.

Для ВОМ, генетическим материалом которого служит РНК, необходимо сначала применить ревертазу для обратной транскрипции ДНК с РНК, а затем подвергнуть образовавшиеся комплементарные ДНК стандартной амплификации.

Метод очень чувствителен и позволяет определять весьма незначительные количества ДНК патогенов в самых различных материалах.

Применительно к ВОМ ПЦР-диагностика была использована для определения изолятов в подгруппах, а также для различения ВОМ от вирусов аспермии томатов и карликовости земляного ореха. Метод перспективен для различения ВОМ от вируса мозаики люцерны, имеющего схожий с ВОМ круг хозяев и состав генома.
 

  
 

  
 


2. Вирус некроза огурца.
1). Общая характеристика.

Относится к группе томбасвирусов вместе с такими вирусами, как вирус кустистой карликовости томата и вирус крапчатой морщинистости артишока. Территория распространения вируса ограничена Канадой.

Вирус содержится в почве, переносится хитридиевым грибом Olpidium cucurbitacearum и легко передается путем механической инокуляции широкому кругу растений. В естественных условиях обнаружен только на парниковых растениях огурца.

Вирус способен поражать некоторые растения из семейств Amaranthiceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cucurbitaceae, Leguminosae и Solanaceae путем механической инокуляции соком зараженных растений, при этом инфицированными остаются обычно только листья, на которых через 2-5 дней после инокуляции появляются темно-желтые или некротические местные поражения. Инфекция приобретает системный характер только в Cucumus sativus и, реже, в Vigna sinensis и Zinnia elegans; инфекция не приобретает полностью системный характер в других представителях  Cucurbitaceae. Для сохранения культуры вируса широко используются некоторые сорта огурца.
2). Описание и свойства вирусных частиц.

В очищенных препаратах методом дифференциального центрифугирования выявлен один компонент вируса, в необработанных препаратах также обнаружен добавочный компонент, коэффициент седиментации которого составляет 1/3 от коэффициента основных частиц.

Молекулярная масса частиц 8.6×10⁶, коэффициент диффузии            1.2×10^-7см²сек^-1, коэффициент седиментации частиц 133S, изоэлектрическая точка рН 3.9.

Частицы вируса изометрические, 31 нм в диаметре, имеют угловатые очертания.

Частицы содержат 16% РНК и 18% белка. РНК вируса одноцепочечная. Каждая субъединица белка вируса содержит 391 аминокислотный остаток. Аминокислотный состав: аланин41; аргинин17; аспарагин46; глутамин24; глицин32; гистидин3; изолейцин20; лейцин33; лизин16; метионин1; фенилаланин20; пролин23; серин32; треонин31; триптофан7; тирозин12; валин33.

При комнатной температуре вирус сохраняется в соке в течение двух месяцев. После выдерживания вируса в течение одного года в замороженном соке  или сухих листьях отмечено очень слабое уменьшение инфекционности. Вирус осаждается 40%-ным раствором сульфата аммония. На инфекционность вируса в очищенных экстрактах не влияет изменение рН от 4 до 8.
3). Пути распространения и симптоматика.

Основным способом передачи вируса в природе является передача через почву с зооспорами хитридиевого гриба Olpidium cucurbitacearum. Вирус не переносится внутри покоящихся спор гриба; не содержащие вируса зооспоры выходят как из покоящихся спор, так и из зооспорангиев, образовавшихся в инфицированных вирусом корнях. Также вирус может передаваться при механической инокуляции.

    Вирус поражает парниковые растения огурца, вызывая образование некротических пятен, тяжелую форму бесформенности листьев и карликовость.
4). Диагностика вируса.

Для диагностики используется 2 метода: индикаторный и серологический.

Индикаторная диагностика.

На Cucumus sativus вирус вызывает образование некротических поражений, развивающихся на инокулированных листьях за 3-4 дня и увеличивающихся до 3-5 мм; листья засыхают и умирают. Симптомы системного поражения могут включать: хлоротичные или рыжевато-коричневые области с четкими некротическими центрами, которые обычно выпадают из листа, оставляя в листовой пластинке червоточины различных размеров; тяжелая деформация листьев, иногда с темно-зелеными энациями; мелкоплодность, иногда плоды с зеленой мозаикой. Симптомы летом слабо выражены или неясны.

На Comphrena globosa вирус вызывает образование беспорядочно расположенных сереющих местных поражений с краснеющими краями, развивающихся за 3-5 дней.

На Chenopodium amaranticolor вирус вызывает образование некротических поражений 0.5-1 мм в диаметре, развивающихся за 2-5 дней, края листьев краснеют по мере роста листьев. Тяжело инфицированные листья засыхают и отпадают.

На Nicotiana tabacum вирус вызывает образование сереющих некротических пятен до 4 мм в диаметре.

Серологическая диагностика.

Очистка препаратов.

Следующий метод дает высокоинфективные препараты: смешать 100 г свежих или замороженных листьев с 200 мл 0.67М фосфата натрия в качестве буфера,  рН 7.0, и 50 мл 0.1М аскорбиновой кислоты, профильтровать сок через марлю и центрифугировать при низкой скорости (12500g). Далее препарат очищается добавлением 0.1 объема хлороформа, подвергается закислению до рН 5.3 и  дифференциальному центрифугированию либо смешивается с 40%-ным сульфатом аммония и подвергается центрифугированию. Применением центрифугирования в градиенте плотности сахарозы достигается дополнительная очистка препарата.

Очищенные препараты используются для получения антисывороток. Обычно производится внутримышечная инъекция кроликам, при этом легко получается антисыворотка с предельным разведением более                             1/1000. Полученная антисыворотка используется для диагностических целей.

Для диагностики вируса из всех методов серологической диагностики наиболее применима реакция двойной диффузии в геле. Для постановки реакции в тонком слое агара на стеклянных пластинках вырезаются лунки: центральная и на расстоянии 1-1.5 см от нее несколько лунок, расположенных радиально. В центральную помещается антисыворотка, в остальные – вирусный препарат либо сок больных растений. Растворы антигена и антител диффундируют навстречу друг другу, и в случае наличия в исследуемом образце вируса, на который приготовлена антисыворотка, наблюдается видимая полоса преципитации. Вирус некроза огурца дает одну полосу преципитации рядом с лункой с антигеном.

Именно серологическая диагностика позволяет надежно отличать вирус некроза огурца от вируса некроза табака. Оба вируса имеют схожий круг хозяев и дают на зараженных растениях схожие симптомы, но серологически не родственны. Еще одним преимуществом данного вида диагностики является возможность обнаружения вируса даже в сыром соке.

3. Вирус пятнистости листьев огурца.
1). Общая характеристика.

Относится к группе томбасвирусов. Распространен в Германии, Греции, Великобритании и Иордании. Легко передается с соком, с семенами и через почву. 

Вирус имеет 2 штамма: собственно вирус пятнистости листьев огурца и вирус штриховатости плодов огурца. Оба штамма тесно связаны серологически, формируя «шпору» в реакции двойной диффузии в геле. Штамм пятнистости листьев заражает Cucumus sativus и широкий круг хозяев из 5 семейств двудольных, штамм штриховатости плодов поражает растения из 7 семейств. При этом в природе вирус найден только на Cucumus sativus. Для размножения вируса используются Cucumus sativus и Nicotiana megalosiphon.
2). Описание и свойства вирусных частиц.

Вирус имеет РНК-содержащие изометрические частицы диаметром 28 нм. Частицы седиментируются как один компонент. Коэффициент седиментации составляет 127S для штамма пятнистости листьев и 132S для штамма штриховатости плодов. Плавучая плотность в CsCl 1.342 г/см³ для штамма пятнистости листьев и 1.35 г/см³ для штамма штриховатости плодов.

РНК вируса одноцепочечная, составляет 20% веса частицы, имеет массу 1.65×10⁶. Для штамма штриховатости плодов масса РНК равна 1.45×10⁶ и составляет 20% от веса частицы.

Вирус содержит 1 вид белка. Для штамма пятнистости листьев его молекулярная масса составляет 44000, а для штамма штриховатости     плодов – 47000.

В сыром соке огурца инфекционность вируса теряется после разведения от 10^-6 до 10^-7, нагревания в течение 10 мин. при температуре от 80 до 85⁰С или выдерживания в течение 20 дней при 22⁰С.
3). Пути распространения и вредоносность.

Вирус распространяется в основном через семена, эффективность передачи составляет ок.1%.

Пораженные вирусом растения страдают тяжелой карликовостью и мозаикой.
4). Диагностика вируса.

Существует огромное количество растительных вирусов, по структуре схожих с вирусом пятнистости листьев огурца. Среди них вирусы крапчатости гвоздики, мозаики сыти, разрыва цветков пеларгонии, морщинистости репы и др. Поэтому возникают определенные трудности при диагностике вируса.

 Применяется 3 вида диагностики: индикаторный, включений, серологический.

     Индикаторный метод.

На Cucumus sativus вирус вызывает местные некротические поражения на семядолях. Затем на молодых листьях появляются прозрачные пятна неправильных очертаний от светло-зеленого до желтого цвета, с коричневыми некротическими центрами. Пораженные растения страдают карликовостью. Системный некроз обычно отсутствует.

На Celosia argentea вирус вызывает красно-коричневые некротические пятна спустя 5-7 дней после механической инокуляции. Системной инфекции нет.

На Chenopodium quinoa вирус вызывает местные некротические пятна спустя 5-7 дней после инокуляции. Системной реакции нет.


Метод включений.

Вирусные частицы легко обнаруживаются в омертвевших участках инокулированных листьев Cucumus sativus и Сhenopodium quinoa. В пораженных системно листьях огурца в клетках вирусные частицы случайным образом разбросаны в цитоплазме в виде мелких гроздевидных структур. Большинство клеточных органелл, по-видимому, не испытывают влияния вируса, но иногда митохондрии принимают необычную форму, а аппарат Гольджи разрастается и образует много мелких пузырьков, содержащих тонкие нити.

Серологическая диагностика.

Очистка препаратов.

Применяется 2 разных метода очистки вирусных препаратов.

Первый метод: 100 г. инокулированных семядолей C.sativus, спустя 7-9 дней после инокуляции, гомогенизируются в 200 мл. 0.03М фосфатного буфера, рН 5. Сок эмульгируют со смесью (1:1) хлороформа и n-бутанола и очищают путем низкоскоростного центрифугирования. Вирус концентрируется путем двух циклов дифференциального центрифугирования с растворением получаемого осадка в буфере. Далее идет очистка препарата путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и растворение полученного остатка в буфере. Из 1 кг листового материала может быть получено около 6 мг вируса.

Второй метод: листья Nicotiana megalosiphon или C.sativus, взятые спустя 5-7 дней после инокуляции, гомогенизируются в 0.1М фосфатном буфере,  рН 7.2, содержащем 0.1% тиогликолевой кислоты. Суспензия профильтровывается через ткань. Затем следуют 2 цикла дифференциального центрифугирования (12000g в течение 15 мин. и 78000g в течение 2.5 ч.), осадок снова растворяется путем высокоскоростного центрифугирования в 0.02М фосфатном буфере, рН 7.2. Затем идет центрифугирование при 24000 об\мин.

Вирус в очищенных препаратах сильно иммуногеничен при введении кроликам: легко получается антисыворотка с предельным разведением 1/1024. Для диагностики вируса могут быть применены любые типы серологических тестов. При реакции диффузии в геле получается одна полоса преципитации.

Штамм пятнистости листьев не реагирует с антисывороткой к следующим изометрическим однокомпонентным вирусам: пятнистости гвоздики, некроза огурца, некротической пятнистости дыни, кустистой карликовости томата и некроза табака. Штамм штриховатости плодов не реагирует с антисывороткой к вирусам пятнистости гвоздики, кустистой карликовости томата, некроза табака, некроза огурца, скручивания листьев пеларгонии и мозаики свиных бобов.
 

  
 




4. Вирус некроза табака.
1). Общая характеристика.

Относится к группе вируса некроза табака. Распространен по всему миру. Поражает растения на орошаемых полях и в парниках с непростерилизованной почвой. В природе переносится грибом Olpidium brassicae, в экспериментальных условиях легко переносится механически.

Поражает как минимум 88 видов из 37 семейств однодольных и двудольных, обычно вызывая некротические поражения и редко поражая системно. Нередко поражает растения вместе с т.н. сателлитным вирусом, который размножается только в растениях, также инфицированных вирусом некроза табака. В основном вирус находится в корнях пораженных растений. Существует много штаммов данного вируса, отличающиеся по кругу хозяев и вызываемым симптомам, серологической специфичности и способности активировать различные штаммы сателитного вируса. Определены штаммы A, B, C, D, E и S; AC36, AC38Ю, AC39, AC43 и штамм «урбана». Штаммы вируса могут быть разделены серологически на 2 группы. Группа A содержит штаммы A, B, C и S; группа D содержит штаммы D, E, AC43, AC36, а также штаммы, полученные из груши, винограда и цитрусов. Группы, формируемые на основе серологических тестов, не соответствуют ни группам, формируемым на основе различий в вызываемых симптомах, ни группам, формируемым на основе способности различных штаммов вируса некроза табака поддерживать различные штаммы спутничного вируса. Так, некоторые штаммы группы D поддерживают только штаммы спутничного вируса SV₁ и  SV₂, в то время как другие поддерживают только штамм SV_с; все штаммы группы А поддерживают SV₁ и  SV₂, но не SV_с.

Также открыты штаммы, которые, судя по всему, существуют в виде свободной РНК.

Для размножения вируса используются Nicotiana tabacum, Phaseolus vulgaris и Nicotiana clevelandii (для некоторых штаммов). Для получения хорошего урожая вируса необходимо инокулировать с абразивом каждый лист заражаемого растения, т.к. системная инфекция развивается редко.
2). Описание и свойства вирусных частиц.

Вирус РНК-содержащий. Очищенные препараты содержат один тип частиц. Коэффициент седиментации при предельном разведении 188±2.5 S. Молекулярная масса 7×10⁶. Изоэлектрическая точка рН 4.5, штамм В осаждается при рН 4.5 в присутствии солей. Подвижность при электрофорезе -7.4×10^-5 и -3×10^-5см²с^-1вольт^-1 для штаммов В и А в 0.066М фосфатном буфере, рН 7.0. Плавучая плотность в СsCl 1.399. Все штаммы вируса, кроме штамма В, легко кристаллизуются. Вирусные частицы изометрические, 26 нм в диаметре. Они могут быть окрашены методом негативного контрастирования, кроме штамма В, который разрушается при окрашивании, даже будучи предварительно зафиксирован в 2%-ном растворе формальдегида в течение 30 мин. РНК вируса одноцепочечная, молекулярная масса РНК 1.3-1.6×10⁶, составляет около 20% от веса частицы. Оценки нуклеотидного состава сильно варьируют: G24; A26-29; U24-27; C22-23. Белок составляет около 80% веса частицы. Частицы содержат один вид белка. Оценки молекулярной массы варьируют: 22600 (197 аминокислотных остатков) или 33500 (312 остатков).

Вирионы весьма устойчивы. В соке инфицированных растений табака температура инактивации составляет от 85 до 95⁰С в зависимости от штамма вируса. При 20⁰С сок сохраняет инфекционность в течение многих дней, а при   -20⁰С – в течение нескольких лет.
3). Пути распространения и вредоносность.

В природе вирус распространяется с зооспорами хитридиевого гриба Olpidium brassicae. Вирус быстро приобретается зооспорами, добавленными к суспензии вируса, и проникает в корень в тот же момент, как и гриб. Успешность передачи зависит от наличия подходящей комбинации штамма вируса, рода гриба и вида растения-хозяина. Вирус не выживает в покоящихся спорах гриба.

Вирус вызывает такие болезни растений, как некроз огурца, некроз тюльпана и болезнь «АВС» клубней картофеля. Также вирус может быть выделен из грушевых деревьев, пораженных трещинами в коре, из винограда и цитрусовых.
4). Диагностика вируса.

Методы диагностики: индикаторный, серологический.

Индикаторный метод.

На Phaseolus vulgaris вирус может вызывать различные симптомы поражения в зависимости от штамма. Штаммы группы D дают отдельные местные поражения, тогда как  штаммы группы A дают местные поражения, распространяющиеся вдоль боковых жилок. Некоторые штаммы не вызывают заболевания. Системную инфекцию дает только один штамм. В присутствии сателлитного вируса концентрация вируса некроза табака и размер поражений в большинстве случаев уменьшаются.

На Сhenopodium amaranticolor вирус дает местные некротические поражения.

На Cucumus sativus вирус вызывает образование на листьях некротических пятен и полос, которые часто располагаются вдоль жилок листа. Нередко пятна охватывают весь лист, в результате чего он отмирает. Поражение надземной части растения происходит не всегда, а лишь при определенных, еще до конца не выясненных условиях. Во многих же случаях инфекция локализуется в корнях огурцов, не проникая в надземные органы растения.

На Phaseolus aureus вирус вызывает образование местных поражений на корнях.
Серологическая диагностика.

Очистка препаратов.

Для большинства штаммов вируса используется следующая методика: замороженные листья или листовая мякоть размораживаются и смешиваются с водой. После низкоскоростного центрифугирования вирус осаждается из очищенного сока путем добавления сульфата аммония (0.25г/мл), растворения осадка в соответствующем объеме воды, осаждения вируса в ультрацентрифуге и растворения осадка в воде. Циклы повторяются, пока препарат не станет прозрачным (обычно 3 цикла). Препарат может быть позже разделен путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Вирус умеренно иммуногеничен. Антисыворотка, взятая спустя 10 дней после единственной внутривенной инъекции вируса (2 мг), более специфична, чем антисыворотка, полученная после длительной иммунизации путем внутримышечных инъекций. Вирус хорошо реагирует в реакциях преципитации в пробирке, где дает гранулярный осадок, и в тестах иммунодиффузии в геле, где дает одну полосу преципитации. Вирус некроза табака не имеет серологического родства со спутничным вирусом.


5. Спутничный вирус.
1). Общая характеристика.

Относится к группе одноцепочечных РНК-содержащих спутничных вирусов. Распространен в Европе и Северной Америке в ассоциации с вирусом некроза табака, но встречается менее часто и поражает растения менее охотно, чем вирус некроза табака. Круг хозяев такой же, как у вируса некроза табака. Размножается только в растениях, зараженных вирусом некроза табака.

Описано три штамма из Англии (SV₁, SV₂ и SV_с) и три из Северной Америки (SV_А, SV_В и SV_с).

Для размножения вируса могут быть использованы Nicotiana tabacum, N.clevelandii или Phaseolus vulgaris, в зависимости от используемого штамма вируса некроза табака. Например, P.vulgaris может использоваться для штаммов SV₁ и SV₂.
2). Описание и свойства вирусных частиц.

 Является самым маленьким РНК-содержащим вирусом из всех известных. Очищенные препараты содержат один тип изометрических частиц диаметром 17 нм. Коэффициент седиментации при предельном разведении равен 50S, штамм SV₁ образует агрегаты с коэффициентами 169, 231 и 332S. Масса частиц равна 1.97×10⁶. Коэффициент диффузии 2.04×10^-7см²/с. Изоэлектрическая точка рН 7.0. Объем частицы 0.71. Электрофоретическая подвижность 1×10^-5 см²с^-1вольт^-1 в 0.066М фосфатном буфере, рН 5.3. Частицы кристаллизуются в различной формы кристаллы – ромбические, прямоугольные или гексагональные платки или планочки, в зависимости от штамма вируса и условий кристаллизации.

РНК вируса одноцепочечная, молекулярная масса ок.0.4×10⁶, составляет ок.20% веса частицы. Оценки нуклеотидного состава сильно варьируют: G22-24; A28-29; C20-22; U25-29.  Вирусные частицы состоят из  60 белковых субъединиц. Судя по всему, частицы содержат один вид белка. Молекулярная масса субъединицы ок. 2.3×10⁶. Субъединицы содержат 208 или 209 аминокислотных остатков.

Возможно, причиной зависимости размножения спутничного вируса от вируса некроза табака является то, что РНК вируса слишком мала,  чтобы кодировать все белки, необходимые для репликации.

По всей видимости, вирус размножается во всех тканях, зараженных вирусом некроза табака. В клетке находится в непосредственной близости с частицами вируса некроза табака.

Температура инактивации составляет 95⁰С. Вирус очень устойчив при  20⁰С и сохраняет инфекционность в течение многих лет при -4⁰С.
3). Пути передачи и вредоносность.

Передается с зооспорами хитридиевого гриба Olpidium brassicae.
4). Диагностика вируса.

Для диагностики вируса используются следующие методы: индикаторный, серологический.

Индикаторный метод.

Для диагностики вируса используются Phaseolus vulgaris и Nicotiana tabacum. После инокуляции соком, содержащим спутничный вирус и вирус некроза табака, на листьях растений появляются местные некротические поражения, но они меньше и развиваются медленнее, чем при поражении только вирусом некроза табака. Концентрация спутничного вируса в соке может быть оценена по соотношению образующихся небольших поражений, однако это различие не всегда легко определить, и для точной диагностики сок инфицированных растений должен быть подвергнут электронной микроскопии или серологическим тестам.

Серологическая диагностика.

Очистка препаратов.

Замороженные листья или листовая мякоть оттаиваются и смешиваются с водой. После низкоскоростного центрифугирования спутничный вирус отделяется от вируса некроза табака и растительных частиц путем многократной преципитации с сульфатом аммония (0.25г/мл), с растворением осадка в воде или 0.2М ацетате натрия, рН 4.5. Количество вируса может составлять 50-100 мг на литр сока. Окончательно вирусы разделяются электрофорезом или центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Спутничный вирус легко кристаллизуется из концентрированных препаратов (даже смешанных); будучи осажденными в ультрацентрифуге, такие кристаллы трудно растворяются; это одна из причин использования солевого метода вместо ультрацентрифугирования для очистки вируса.

Очищенные препараты умеренно иммуногеничны. В капельных реакциях преципитации вирус дает зернистый осадок, а в реакции двойной диффузии в геле – одиночную полосу преципитации.




     6. Вирус зеленой крапчатой мозаики огурца.  

 

1). Общая характеристика.

Относится к группе тобамовирусов. Распространен в Европе, Индии и Японии. Поражает тыквенные в защищенном грунте. Легко передается с соком, через прикосновения к растениям в ходе возделывания, а также через семена и почву. Поражает сравнительно узкий круг хозяев, в основном из семейства Тыквенные.

Вирус имеет несколько штаммов, различающихся серологически и по реакции видов-индикаторов. Штамм зеленой мозаики огурца распространен в Европе и Великобритании. Поражает в основном тыквенные, дает немногочисленные местные поражения на Сhenopodium amaranticolor только в определенных условиях. На ВЗМО проявляет специфическую реакцию арбуз. На дыне ВЗМО дает слабо выраженную мозаику. Штамм белой мозаики огурца (2А) распространен в Европе и Великобритании, схожие изоляты обнаружены в Индии. Вызывает симптомы поражения на огурце и местные поражения на С.amaranticolor. Арбузный штамм распространен в Японии. Вызывает местные поражения на С.amaranticolor. Японский огуречный штамм распространен в Японии, вызывает тяжелые искривления плодов огурца и местные поражения на Datura stramonium. Штамм из Йодо обнаружен на огурце в Йодо (Япония). Вызывает искривления плодов огурца, местные поражения на                    С.amaranticolor, D.stramonium и Petunia hybrida. Индийский штамм (2С) обнаружен на бутылочной тыкве в Индии, вызывает пузыристость листьев и задержку роста; вызывает местные поражения на С.amaranticolor и бессимптомную инфекцию на инокулированных листьях D.stramonium. Арбузный штамм серологически довольно близок к двум огуречным штамма из Великобритании и к штамму из Индии; эти штаммы менее близки к японскому огуречному штамму, к штамму из Йодо и к вирусу табачной мозаики, и очень отдаленно схожи с вирусом мозаики томата и другими тобамовирусами. Японский огуречный штамм и штамм из Йодо находятся в тесном родстве друг с другом.

Для сохранения культуры вируса используется Cucumus sativus, лучше всего вирус сохраняется в листьях и соке при -20⁰С.
2). Описание и свойства вирусных частиц.

Вирус РНК-содержащий. Очищенные препараты осаждаются как главный компонент и меньшие компоненты (возможно, димеры и тримеры). Коэффициент седиментации (главного компонента) 185S. Изоэлектрическая точка рН 4.98. Вирусные частицы имеют правильную палочковидную форму с незакругленными концами, 300 нм в длину и 18 нм в диаметре. Структура вируса спиральная, с радиусом центрального канала 20 А. Спираль содержит 49 белковых субъединиц на 3 оборота. РНК вируса одноцепочечная, с содержанием нуклеотидов (в моль): G25; A26; C19; U30. РНК составляет 6% веса частицы. Белок составляет 94% веса частицы. Вирусные частицы содержит в своем составе 15 аминокислот, в среднем 160 остатков на субъединицу белка оболочки. Молекулярная масса белка 17200. Между штаммами вируса имеются различия в аминокислотном составе. Так, три европейских штамма с огурца очень сходны с арбузным штаммом, а штамм белой мозаики несколько отличается от них; между японским огуречным и арбузным штаммами отмечены существенные (11 заместителей) различия между 91 и 122 аминокислотными остатками.

Вирус очень устойчив; в огуречном соке штамм ВЗМО теряет инфекционность в течение 10 мин. при 90⁰С, штамм из Йодо и арбузный штамм – при 90-100⁰С, а индийский штамм – при 86-88⁰С. Предельное разведение варьирует в зависимости от штамма от 10^-6 (ВЗМО) до 10^-7 (арбузный штамм). Инфекционность сохраняется в течение нескольких месяцев при комнатной температуре и нескольких лет при 0⁰С.
3). Пути распространения и вредоносность.

Вирус передается несколькими путями: контактным способом, через почву либо питательный раствор, с семенами и повиликами.

Передача контактным способом.

Вирус способен передаваться через листовой контакт, через руки и инструменты при возделывании.

Передача через почву или питательный раствор.

Вирус передается через почву, содержащую дебрис зараженных растений; при гидропонном способе выращивания огурцов вирус способен очень быстро распространяться с непрерывно циркулирующим питательным раствором.

Передача с семенами.

У огурца эффективность передачи вируса с семенами составляет до 8% в течение первого месяца после сбора семян, падая до 1% после                  5-месячного хранения семян. Передача с семенами также имеет место у бутылочной тыквы, и вплоть до 5% у арбуза.

Передача повиликами.

Вирус передается Cuscuta subinclusa, C.lupiliformis и C.campestris, а штамм белой мозаики - C.campestris.

Вредоносность.

Вирус наносит серьезный ущерб сельскому хозяйству. Особенно вредоносны штаммы зеленой и белой мозаики, поражающие огурцы. Для зеленой мозаики кол-во заболевших растений огурца в грунтовых теплицах под стеклом и пленкой обычно составляет 20%, а при гидропонном способе выращивания может достигать 100%. При масштабном заражении урожай может снижаться на 15%. Штамм белой мозаики поражает огурцы значительно реже, чем штамм зеленой мозаики, и в основном при перегреве теплиц. В обычные годы количество заболевших растений обычно составляет 0-3%, сухим и жарким летом оно повышается до 7-10%, а при перегреве теплиц может достигать 35-40%. Болезнь для растений протекает значительно тяжелее, чем зеленая мозаика, и может снижать урожай на 50%.
4). Диагностика вируса.

Применяются 5 видов диагностики: индикаторный, электронно-микроскопический, серологический, включений и химический.

Индикаторный метод.

На Cucumus sativus штамм зеленой мозаики вызывает крапчатость, пузыристость и искривление листьев. На листьях наблюдается чередование темно-зеленых и светло-зеленых участков. Больные растения отстают в росте, выход плодов сильно снижается ввиду опадения завязей, плоды обычно крапчатые. При поражении штаммом белой мозаики на листьях появляются яркие желтоватые или белые пятна звездчатой формы. Иногда почти вся листовая пластинка обесцвечивается, становится белой, зелеными остаются только жилки. Карликовость слабо выражена. Плоды при поражении белой мозаикой также неравномерно окрашены, на них развивается характерная белая пятнистость. Некоторые штаммы вируса вызывают тяжелую мозаику и искривление плодов. Некоторые азиатские штаммы не вызывают симптомов поражения на листьях, но снижают урожай. Для вируса характерна следующая отличительная черта: при резком повышении температуры до 32-35⁰С у пораженных растений наблюдается обесцвечивание листовой пластинки.

На Citrullus vulgaris арбузный штамм вызывает легкую мозаику листьев и карликовость, но в определенный период развития растения инфекция может вызывать тяжелое внутреннее обесцвечивание и распад плодов. На ВЗМО Citrullus vulgaris проявляет специфическую реакцию. Некоторые сорта реагируют с некротической реакцией, другие – без нее. Иногда листья сильно деформированы. Некроз листьев наступает на 18-й день после заражения.

На Сhenopodium amaranticolor индийский С, Йодо и арбузный штаммы вызывают мелкие, наполовину омертвевшие местные поражения. Европейские огуречные штаммы обычно не вызывают реакции.

На Datura stramonium образование рассеянных хлоротичных местных поражений спустя одну неделю после инокуляции вызывают штамм из Йодо и японский огуречный штамм. Системной реакции нет.

Индикаторный метод не очень надежен, т.к. схожие симптомы могут вызываться и другими вирусами, и для точной диагностики необходимо применение других методов.

Электронно-микроскопический.

Препараты обычно готовятся непосредственно из частей зараженного растения. Есть несколько способов приготовления препаратов вируса. При использовании метода погружения край листа отрезают и место среза погружают на 1-2 с. в каплю дистиллированной воды, нанесенную на сетку с пленкой-подложкой. После высыхания капли препарат контрастируют металлом. При использовании метода разбавленной суспензии кусочек листа (1 см², или 10-30 мг.) тщательно растирают в фарфоровой ступке до получения однородной массы. Затем, продолжая растирать гомогенат, добавляют небольшими порциями 10-20 мл. дистиллированной воды. Получается однородная разбавленная взвесь. Капля взвеси наносится на сетку и после высыхания напыляется металлом.

Вирус присутствует во всех тканях, включая пыльцу, и иногда в зародышах. В клетках вирус может вызывать цитологические аномалии, например ячеистость митохондрий, которые также могут быть обнаружены путем  микроскопирования.

Метод включений.

Вирус образует веретеновидные паракристаллы и включения в виде круглых пластинок. Образование  включений можно вызвать искусственным путем. При обработке клеток эпидермиса и волосков листьев больных растений 1.2н раствором соляной кислоты в них образуются игловидные паракристаллы.

Химический метод.

Метод основан на отличиях в метаболизме больных и здоровых растений, которые могут быть обнаружены с помощью качественных (обычно колориметрических) химических реакций. Для анализа на ВЗМО зрелый плод (семенник) очищают от кожуры и растирают в ступке. Из полученной кашицеобразной массы отжимают через двойной слой марли сок и кипятят его в течение одной минуты. Отфильтровывают сок через бумажный фильтр и прибавляют к нему 3%-ный CuSO₄ (на три части сока одну часть сульфата меди). Сок из больных плодов через несколько минут становится желтовато-зеленым (или голубым, если для анализа были взяты незрелые плоды). Сок из здоровых растений будет зеленым.

Серологическая диагностика.

Очистка препаратов.

Вирус легко выделяется из пораженных системно растений огурца. Существует 2 метода очистки вируса. Первый метод: растения собираются спустя 3 недели после заражения, измельчаются в 0.1М фосфатном буфере, рН 7.0 (2мл на 1 г ткани) и подвергаются 2-3 циклам дифференциального центрифугирования. Адсорбированные пигменты удаляются путем гомогенизации препарата вируса в 0.1М фосфатном буфере, рН 7.0, с равным объемом смеси n-бутанола и хлороформа в течение 2-3 мин. при комнатной температуре. Водный слой, содержащий вирусные частицы, отделяется путем центрифугирования при 900g и проходит еще 2 цикла дифференциального центрифугирования. Осадок растворяется в дистиллированной воде. Второй метод: растения собираются спустя 3-4 недели после заражения, листья вымораживаются в течение нескольких часов, затем измельчаются в 0.05М фосфатном буфере рН 7.6 (4 мл на 1г. ткани), содержащем 0.1% объема тиогликолевой кислоты. Взвесь фильтруется через ткань. Добавляется n-бутанол капельно (9.3мл/100мл. сока), и смесь встряхивается в течение 45 мин. при комнатной температуре. Центрифугируется при 10000g в течение 30 мин.. Вирус осаждается из надосадочной жидкости добавлением 2%-ного NaCl и затем 4%-ного полиэтиленгликоля (m_r=6000), смесь выдерживается 0.5-1 ч. при 4⁰С и центрифугируется в течение 10 мин. при 10000g. Осадок растворяется в дистиллированной воде (1 мл на 25 г. первоначальной ткани), и нерастворимая часть устраняется (5 мин. при 10000g). Добавляют 1-1.5 мл. препарата в колонну (85×1.5 см.) пористых стеклянных бусинок (размер пор 70 нм), и элюируют с 0.04М фосфатным буфером, рН 7.0. Вирус элюирует в пустой объем, хорошо отделяется от лишнего материала и может быть позже концентрирован преципитацией с 2.5 объемами этанола.

Вирус обладает высокой иммуногеной способностью; антисыворотка, приготовленная путем одной внутривенной и двух внутримышечных инъекций (с адъювантом), имеет титр 1/4096. При преципитации в пробирках осадок хлопьевидный или нитевидный. Антисыворотка также хорошо реагирует в тестах микропреципитации и иммунодиффузии с использованием свежеприготовленного агарового геля; дает одну главную и иногда одну меньшую полосы преципитации. Очищенные препараты, смешанные с равным объемом глицерола, при хранении при 2⁰С практически не теряют серологической активности по меньшей мере 6 лет.
  
 

   

    


Информационные источники.

1). Власов, Ларина. Сельскохозяйственная вирусология;

2). Келдыш, Помазков. Вирусы, вироиды и микоплазмы растений;

3). Иорданова. Новое заболевание огурцов – кольцевая пятнистость;

4). Леонтьева, Кошелева, Коновалова. Полевая мозаика огурцов;

5). Медведская. Вирозы тепличных растений;

а также материалы с сайта www.dpvweb.net .