Введение

Организм человека и животных представляет собой целостную систему, в которой можно выделить ряд иерархических уровней организации живой материй: клетки — ткани — морфофункциональные единицы органов — органы — системы органов. Каждый уровень структурной организации имеет морфофункциональные особенности, отличающие его от других уровней.

Гистология (от греч. histos — ткань, logos — учение) — наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей животных организмов.

Ткани представляют собой систему клеток и неклеточных структур, объединившихся и специализировавшихся в процессе эволюции для выполнения важнейших функций в организме. Для каждой из основных тканевых систем характерны присущие именно им особенности строения, развития и жизнедеятельности. Предметом общей гистологии, или собственно учения о тканях, являются общие закономерности, присущие тканевому уровню организации и отличительные особенности конкретных тканей; предметом частной гистологии — закономерности жизнедеятельности и взаимодействия различных тканей в органах на более высоких уровнях организации. Частная гистология служит основой для изучения микроскопического строения морфофункциональных единиц органов и органов в целом.



1.Изготовление препаратов для световой микроскопии

Цитологические (в т.ч. цитогенетические) препараты делятся на временные и постоянные.
1.1 Временные препараты

Подготовка материала для временных препаратов включает фиксацию и окраску.

Фиксация

Фиксация – это процесс быстрой консервации клеточных структур, при котором все физиолого-биохимические процессы останавливаются, а водорастворимые вещества переходят в нерастворимое состояние. Следовательно, фиксация позволяет сохранить внутриклеточные структуры в неизменном виде на длительное время. Однако при фиксации в клетках могут появляться артефакты – новые структуры, которые отсутствуют в живой клетке, например, разнообразные вакуоли. Для предотвращения появления артефактов необходимо использовать специально подобранные химические растворы – фиксаторы, а сама фиксация должна проводиться в определенных условиях. В частности, желательно использовать охлажденные фиксаторы (до 2...3 градусов); для фиксации нужно брать отдельные клетки или кусочки тканей не толще 5 мм; объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 50...100 раз; фиксатор не должен использоваться для длительного хранения материала; фиксатор не должен использоваться повторно.

Рассмотрим состав и применение наиболее широко распространенных фиксаторов.

Формалин
 (формальдегид, или 
муравьиный альдегид). Наиболее простой и широко распространенный фиксатор. Применяется в виде водных растворов с концентрацией 4...10%, при этом за 100% принимается концентрация продажного формалина. Продажный формалин содержит примесь муравьиной кислоты, которую нейтрализуют с помощью углекислого кальция в течение 24 часов. Время фиксации от 1 часа до 24 часов. Для длительного хранения материал переносят в свежий 10%-ный формалин. Чистый формалин используют в том случае, если планируется дальнейшее изучение локализации и активности ферментов. Чаще же формалин включается в рецептуру более сложных фиксаторов.

Спиртовые фиксаторы. Содержат этиловый или метиловый спирт. Водные растворы спиртов в чистом виде (70%, 96% или 100%) используются относительно редко. Чаще применяют 100%-ные спирты, которые смешивают с другими веществами. Нужно иметь в виду, что метиловый спирт (метанол) и его пары – ядовиты!

В качестве универсальных фиксаторов используют различные композиции на основе формалина, спиртов, органических кислот и неорганических веществ.

Уксусный алкоголь
 (ацеталкоголь). Это один из наиболее простых фиксаторов. Состоит из 3 частей абсолютного спирта (этилового,  а лучше – 

метилового) и 1 части ледяной уксусной кислоты. Для приготовления 100%-ного (абсолютного) спирта исходные спирты обезвоживают. Для обезвоживания этилового спирта (этанола) используют безводный сульфат меди, а для обезвоживания метилового спирта (метанола) – используют оксид кальция. Хранят их в герметичной посуде. Нужно иметь в виду, что все абсолютные спирты особенно ядовиты! Для приготовления ледяной уксусной кислоты исходную концентрированную кислоту охлаждают в холодильнике; при этом кислота замерзает, раньше, чем вода. Жидкость сливают, а замерзшую кислоту оттаивают и используют для приготовления фиксатора. Фиксатор готов для употребления через 24 часа. Хранить фиксатор в темном холодном месте. Время фиксации – 2...24 часа. Затем материал переносят в свежий фиксатор, в котором он может храниться до 1 месяца в холодильнике. Для более длительного хранения материал переносят в 70%-ный спирт.

Фиксатор Карнуа. Состав – 1 часть ледяной уксусной кислоты : 6 частей абсолютного спирта : 3 части хлороформа. Это универсальный фиксатор, который обеспечивает быструю фиксацию (в течение 1...2 часов).

Фиксаторы, содержащие пикриновую кислоту, например, смесь Буэна – 15 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты : 5 частей формалина : 1 часть ледяной уксусной кислоты. Этот фиксатор готовят непосредственно перед употреблением. Время фиксации от 1 до 24 часов (иногда несколько суток). Фиксированный материал хранят в 70%-ном спирте.

Фиксаторы, содержащие сулему (хлорид ртути (II) – HgCl₂). Сулема используется в виде насыщенного водного раствора в смеси с ледяной уксусной кислотой (25 : 1), формалином (8,5 : 1) и более сложных композиций (фиксатор «Суза», фиксатор Ценкера и др.). Время фиксации от 1 до 24 часов. Затем сулему удаляют спиртовым раствором йода (6 частей 70%-ного спирта : 1 часть йодной настойки), а йод удаляют 70%-ным спиртом. Фиксированный материал хранят в 70%-ном спирте. Осторожна, сулема ядовита!

Фиксаторы, содержащие осмий (четырехокись осмия, или осмиевая кислота). Дают наилучшие результаты, используются при изготовлении препаратов как для световой, так и электронной микроскопии. Можно использовать 1...2%-ный раствор осмиевой кислоты, но чаще применяют композиции, например, фиксатор Флемминга – 15 частей 2%-ной осмиевой кислоты : 1 часть ледяной уксусной кислоты. Фиксация протекает медленно (от 24 часов до нескольких суток). Осторожно, осмиевая кислота и ее пары ядовиты!

Кроме перечисленных фиксаторов общего назначения, существуют и специальные фиксаторы. Например, фиксатор для митохондрий содержит 4 части 3%-ного р-ра дихромата калия и 1 часть 40%-ного формалина. Фиксатор для хлоропластов содержит 15 частей насыщенного р-ра медного купороса, 1 часть 40%-ного формалина и 5 частей воды.



В ряде случаев вместо химической фиксации применяется быстрое замораживание образцов, например, при температуре жидкого азота (–196⁰) или при температуре сухого льда (–78⁰). Замороженные объекты могут быть обезвожены путем возгонки воды в вакууме при температуре ниже –40⁰ (этот процесс называется лиофилизация).
Окрашивание

Окрашивание позволяет выявлять внутриклеточные структуры, обладающие повышенным сродством к определенным красителям. Красители – это относительно низкомолекулярные органические вещества, обладающие повышенным сродством к определенным химическим компонентам клетки.

Существует множество красителей, которые используются для различных целей. Нужно иметь в виду, что выбор красителя связан с характером фиксации и различными методами предварительной обработки клеток.

Названия красителей могут соответствовать получаемой окраске (рубин, кармин, метиловый синий, метиленовый синий, генциановый фиолетовый, метиловый зеленый, оранжевый золотой). Иногда русские названия цветов заменяют на немецкие, например: метилблау, генцианвиолет. В других случаях названия носят отвлеченный, исторически сложившийся характер, например: пиронин, фуксин, сафранин, флороглюцин, судан III. Иногда название красителя не соответствует полученной окраске, например, синий тиониндает фиолетово-красное окрашивание. Довольно редко применяются химические номенклатурные названия красителей, например: диметиламинобензальдегид, 8-амино-1-нафтол-5-сульфокислота.

Различают основные (щелочные), кислотные и нейтральные красители. Основные красители избирательно окрашивают базофильные клеточные структуры (то есть структуры с кислотными свойствами). Кислотные красители избирательно окрашивают ацидофильные или оксифильные клеточные структуры (то есть структуры со щелочными свойствами). Нейтральные красители окрашивают и базофильные, и ацидофильные структуры.

Наименее токсичные красители используются для прижизненной окраски клеток. Эти красители обычно применяют в виде водных растворов, например: метиленовый синий(концентрация от 1 : 1000 до 1 : 10000), трипановый синий (0,5%-ный р-р), нейтральный красный (от 1 : 50000 до 1 : 200000).

Красители для фиксированных клеток могут использоваться в чистом виде (водные или спиртовые растворы, концентрация от 0,1% до 1%), например: эозин, фуксин. Часто используют смеси красителей, например, смесь Романовского–Гимза (содержит метилен–азур, метиленовый фиолетовый, метиленовый синий и эозин), окраска по Маллори (последовательное использование кислотного фуксина S, а затем смеси 

анилинового синего и оранжевого золотого G), азур–эозин, метилблау–эозин.

Однако чаще краситель образуется в ходе его приготовления. Например, широко известное вещество растительного происхождения гематоксилин становится красителем только после его окисления до гематеина. Для окрашивания ядер и хромосом широко используются красители в сочетании с органическими кислотами. Рассмотрим методики приготовления некоторых наиболее простых красителей.

Приготовление 2%-ного ацетофуксина. 1 грамм основного фуксина растворяют в 50 мл 40%-ной уксусной кислоты при подогревании на водяной бане.

Приготовление 1%-ного ацеторсеина. К 1 грамму орсеина добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и настаивают около 12 часов. Затем смесь нагревают до кипения и добавляют 50 мл дистиллированной воды. Затем нагревают до кипения и охлаждают, повторяя эту процедуру 10 раз. Через сутки краситель фильтруют. Перед окрашиванием на 9 частей красителя добавляют 1 часть 1 н. HCl.

Приготовление 4%-ного ацетокармина. Раствор готовят в термостойкой колбе с водяным холодильником. 4 грамма ацетокармина смешивают с 100 мл 50%-ной уксусной кислоты и кипятят 1 час. Через сутки краситель фильтруют. Аналогичным образом приготавливается ацетолакмоид.

Вместо уксусной кислоты часто используют другие органические кислоты, например, 40%-ную молочную кислоту.

Все красители после приготовления фильтруют и хранят в темном прохладном месте. Время окрашивания препаратов зависит от температуры (обычно от 20 минут до 1 суток). При нагревании или кипячении время окрашивания сокращается.

Кроме окрашивания органическими красителями отдельные структуры можно выделить, используя их импрегнацию  серебром и другими металлами.
1.2 Постоянные препараты

Постоянные препараты готовятся по специальным методикам, обеспечивающих их хранение в течение десятков лет. К постоянным препаратам относятся мазки, тотальные препараты и срезы. Мазки используются при изучении клеток крови, культур микроорганизмов, изолированных тканевых клеток. Тотальные препараты представляют собой отдельные прозрачные и тонкие объекты (от англ total – целиком, полностью). Однако в большинстве случаев для изготовления препаратов используются достаточно толстые образцы тканей, которые служат для изготовления срезов.

Учебные срезы можно сделать вручную, с помощью бритвы. Однако качественные срезы с заданной толщиной 10...22 микрометра обычно изготавливают с помощью специальных приборов – микротомов. Такие 

срезы часто называют микротомными препаратами. Для получения более тонких срезов (0,01...0,05 мкм, или 10...50 нанометров) используют ультрамикротомы.

Кратко рассмотрим основные этапы приготовления микротомных препаратов.

1.Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата. При этом учитывают следующие моменты:

- забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа;

- забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;

- толщина кусочков не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка;

- обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее.

2.Фиксация материала
. Сразу после окончания фиксации производится промывка материала или водой (после водных фиксаторов), или 80%-ным спиртом (после спиртовых фиксаторов). Количество смен промывных жидкостей – не менее 3. Время – до 24 часов. Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке. Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей.

3. Обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации. Параллельно происходит уплотнение материала. Последовательное перемещение материала через ряд растворов называется проводка. После водных фиксаторов используется 8 смен спирта: 20%, 40%, 80%, две смены по 96%, две смены по 100%. После спиртовых фиксаторов – 4 смены спирта : две смены по 96% и две смены по 100%. В каждой смене материал выдерживается по 1 часу.

4. Просветление
. Это пропитывание материала растворителем парафина – ксилолом (бензолом, хлороформом). Образец помещается на 1 час последовательно в каждый из последующих растворов: 3 части спирта + 1 часть ксилола, затем 2 части спирта + 2 части ксилола, затем 1 часть спирта + 3 части ксилола, затем две смены ксилола.



5. Заливка в парафин
. Это замещение ксилола парафином. Образец помещают в смесь ксилола и парафина при температуре 55...57 градусов и оставляют в термостате при этой температуре до полного испарения ксилола (от нескольких часов до нескольких суток). Затем при температуре 55...57 градусов производится проводка через парафин I (6...12 часов), парафин II (6...12 часов) и заливка в парафин III. Парафины I, II, III отличаются только чистотой: парафин III – это окончательная среда, которая должна обладать наибольшей чистотой. В итоге получаются парафиновые блоки, в которых заключены образцы материала. Эти блоки можно резать в любом направлении.

6. Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии – монтируется на специальные сеточки.

7. Окрашивание
 срезов. Парафиновые срезы наклеивают на чистое предметное стекло. В качестве клея можно использовать смесь белка куриного яйца с глицерином (в соотношении 1 : 2) с добавлением антисептика (тимола или фенола). Обычно производят депарафинирование срезов. Для этого стекла с наклеенными срезами проводят через ксилол, спирты убывающей концентрации (100%, 96%, 80%, 70%) и дистиллированную воду. Время нахождения в каждой среде – 2...3 минуты. Далее окрашивают согласно методикам. Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе. Методы окраски гистологических структур очень разнообразны и выбираются в зависимости от задач исследования.

Гистологические красители (по химической природе) подразделяют на кислые, основные и нейтральные. В качестве примера можно привести наиболее употребительный краситель гематоксилин, который окрашивает ядра клеток в фиолетовый цвет, и кислый краситель — эозин, окрашивающий цитоплазму в розово-желтый цвет. Избирательное сродство структур к определенным красителям обусловлено их химическим составом и физическими свойствами. Структуры, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называются оксифильными, а окрашивающиеся основными —базофильными. Например, цитоплазма клеток чаще всего окрашивается оксифильно, а ядра клеток – окрашиваются базофильно.

Структуры, воспринимающие как кислые, так и основные красители, являются нейтрофильными (гетерофильными). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет.



Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрастируют солями урана, свинца и других металлов, после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препаратами.

8. Обезвоживание и просветление окрашенных срезов. Выполняется путем проводки через спирты возрастающей концентрации, а затем через ксилол.

9. Заключение в среды
 (заливка). Для длительного хранения препаратов их необходимо заключить в среду, предохраняющую препарат от окисления воздухом и от поражения грибками. Для заливки используются специальные смолы (канадский бальзам, пихтовый бальзам), которые растворяют в ксилоле до консистенции жидкого меда. Каплю такого раствора наносят на срез и покрывают покровным стеклом.

Для ускоренного приготовления препаратов обезвоживание окрашенных срезов не производят, а для заливки используют глицерин–желатину. Для приготовления этой среды 15 г чистого (белого) желатина растворяют в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, добавляют 100 г глицерина и 2 капли фенола.

В ряде случаев для приготовления срезов используются замораживающие микротомы. Замораживающей жидкостью служит жидкая углекислота. На замораживающем микротоме можно резать фиксированный и нефиксированный материал. Достоинство замораживающих микротомов в том, что не требуется длительной проводки образцов через различные среды.


2.Приготовление препаратов для электронной микроскопии

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное отличие заключается в том, что гистологический препарат для световой микроскопии может длительно храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата фотографируются, а изучение структур производится уже на электроннограммах.

Из тканей жидкой консистенции (кровь, костный мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.

Из ломких паренхиматозных органов (печень, почки и другие) изготавливаются препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.

И наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливаются пленочные препараты путем растягивания или раздавливания между двумя стеклами, также с последующей фиксацией, окраской, заливкой в смолы и дальнейшем изучении.




3.Изготовление препаратов для трансмиссионной микроскопии

Для фиксации материала обычно используют осмиевую кислоту. Для заливки обезвоженного препарата используют различные смолы (а не парафин). Для изготовления сверхтонких срезов (толщиной 20...100 нм) используется ультрамикротом с алмазными или стеклянными ножами. Вместо окрашивания органическими красителями используется импрегнация образца солями свинца, урана, осмия. Часто вместо импрегнации производят напыление поверхности образца тяжелыми металлами.

Для изучения мембран используются более сложные методики приготовления препаратов. Например, вначале образец ткани замораживается при температуре менее 100^О. Затем образец раскалывается острым ножом. При этом часто трещина проходит параллельно плоскости мембраны. В результате обнажаются ранее скрытые структуры, например, интегральные белки.

Затем создается реплика скола. Вначале в вакууме производится возгонка льда. На поверхность скола наносится слой углерода, а на эту реплику из углерода напыляется тяжелый металл. Биологические структуры растворяются в сильной кислоте. Получившаяся поверхность является точной копий биологической структурой.

Электроны, прошедшие через образец, фокусируются и направляются на флуоресцентный экран, на котором и формируется видимое изображение.



Содержание

Введение

1.Изготовление препарата для световой микроскопии

1.1 Временные препараты

1.2 Постоянные препараты

2.Приготовление препаратов для электронной микроскопии

3.Изготовление препаратов для трансмиссионной микроскопии

Список литературы



Список литературы

1. 
   http://www.morphology.dp.ua – Гистология. mp3 – Введение, методы исследования в гистологии.
   
2. 
   Мяделец О.Д. – Гистология, цитология и эмбриология человека. Часть II. Частная гистология. Витебск. 2001.