Calothrix sp. N181

Mackay et аl., 1984

Roberts, 2004

α-Гликозил-глицерат

Agmenellum quadruplicatum; Stenotrophomonas maltophilia; Methanohalophilus portucalensis Erwinia chrysanthemi

Roberts, 2004

Goude et al., 2004

α-Маннозил-глицерат

Dehalococcoides ethenogenes; Methanothermus fervidus; Pyrococcus furiosus; Rhodothermus marinus и R. obamensis; Methanohalophilus portucalensis; Thermus thermophilus; Dehalococcoides ethenogenes; Rubrobacter xylanophilus; Aeropyrum pernix; Pyrococcus sp.; Thermococcus sp.; Archaeoglobus fulgidus

Empadinhas et al., 2004

Santos and da Costa, 2002

Martins et all., 1999;

Goncalves et all., 2003

Анионные органические осмолиты, содержащие фосфатные или сульфатные группы

Сахароза

Synechocystis sp., Anabaena sp., Phormidium autumnale; Scytonema species;

Chroococcidiopsis sp. Sinorhizobium meliloti

Reed et al., 1986;

Hershkovitz et al., 1991;

Page-Sharp et al., 1999;

Desplats et all., 2005.

Na-карбамоил-L-глутамин-1-амид

Ectothiorhodospira marismortui

Oren et al., 1991.

Манносахароза

Agrobacterium tumefaciens

Smith et al., 1990

Гидроксиэктоин

Halomonas elongata; Chromohalobacter salexigens; Nocardiopsis halophila;

N. dassonvillei; Micrococcus halobius; Marinococcus halophilus,

Marinococcus sp. M52; Brevibacterium casei, B. iodinum, B. linens,

Streptomyces chrysomallus, S. griseolus; Salibacillus salexigens

Roberts, 2004

Frings et al., 1993

Severin et al., 1992

Эктоин как осмоактивное вещество впервые обнаружен Э. Галинским у фототрофной пурпурной бактерии Ectothiorhodospira halochloris (Galinski et al., 1985). По химической структуре эктоин может быть классифицирован как частично гидратированная иминокислота (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат).

Накопление эктоина показано для различных галофильных и галотолерантных Г⁺ и Г^- эубактерий, включая виды Nocardiopsis, Brevibacterium и Marinococcus, а также Halomonas, Pseudomonas и Vibrio (табл.1). Интересно отметить, что негалофильные эубактерии накапливают эктоин, транспортируя его из среды в гиперосмотических условиях (Jebbar et al., 1992, 2005; Peter et al., 1998, Malin and Lapidot, 1996).

2.1 Гены и ферменты биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина

Путь биосинтеза эктоина, является ответвлением в пути синтеза аминокислот аспартатного семейства. В этом пути аспартат-b-полуальдегид (AПA) превращается в L-2,4-диаминобутират (ДАБ) с участием ДАБ-аминотрансферазы, ДАБ ацетилируется в Ng-ацетил-2,4-диаминобутират (АДАБ) при участии ДАБ-ацетилтрансферазы. Циклизация АДАБ в эктоин катализируется эктоинсинтазой (Peters et al., 1990). Данный путь подтверждён энзиматически для фототрофа Ectothiorhodospira halochloris (Peters et al., 1990), гетеротрофов Halomonas elongata (Canovas et al., 1998), Halobacillus dabanensis (Zhao et al., 2006), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002) и морской бактерии Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997) (Рис. 1).

У Brevibacterium linens (Bernard et al., 1993), Brevibacterium epidermis DSM 20659 (Onraedt et al., 2004), Brevibacterium sp. (Nagata et al., 1998), Streptomyces parvulus (Inbar and Lapidot, 1988) путь биосинтеза эктоина начинается с глутамата. Кроме аспартата и глутамата, в качестве предшественника может использоваться аспарагин, как показано для Streptomyces griseus и Streptomyces clavuligerus (Malin and Lapidot, 1996).

Гены биосинтеза эктоина охарактеризованы у грамположительных умеренно галофильных бактерии Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002), Halobacillus dabanensis (Zhao et al., 2006), грамотрицательных бактерий Chromohalobacter salexigens (ранее Halomonas elongata DSM 3043) (Canovas et al., 1997) и Halomonas elongata (Canovas et al., 1998) и расположены в одном опероне ectABC, где ген ectА кодирует L-2,4-ДАБ-ацетилтрансферазу, а гены ectВ и ectС кодируют L-2,4-ДАБ-аминотрансферазу и L-эктоинсинтазу, соответственно. Таким образом, путь биосинтеза эктоина достаточно консервативен в отношении ферментов и организации ect-генов.

Рис. 1. Путь биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина у галотолерантных бактерий (по Peters et al., 1990; Galinski, 1995; Ventosa et al., 1998). EctA - ДAБ-ацетилтрансфераза, EctB - ДAБ-аминотрансфераза, EctC - эктоинсинтаза и EctD - эктоингидроксилаза.

Биосинтез гидроксиэктоина осуществляется непосредственным гидроксилированием эктоина эктоингидроксилазой (EctD). К настоящему моменту ген ectD идентифицирован у Streptomyces chrysomallus (Prabhu et al., 2004), Chromohalobacter salexigens (García-Estepa et al., 2006) и Salibacillus salexigens (Bursy et al., 2007).

Возможно, существует также альтернативный путь, в котором Ng-ацетил-ДАБ превращается в гидроксиэктоин через 3-гидрокси-Ng-ацетил-ДАБ без участия эктоина (Canovas et al., 1999). Но этот путь энзиматически не подтвержден.

Ферменты биосинтеза эктоина. Ферменты биосинтеза эктоина были очищены из H. elongata и частично охарактеризованы (Ono et al., 1999). 2,4-ДAБ-аминотрансфераза является гомогексамером с молекулярной массой субъединицы 44 кДа. ДAБ-аминотрансфераза является пиридоксальфосфат-зависимым ферментом, и требует присутствия ионов К⁺ для активности и стабильности, что обусловлено возможным наличием в белке специфических связывающих участков для этого иона. Зависимость от калия установлена для многих ферментов галофильных архей и эубактерий (Toney et al., 1995). ДАБ-аминотрансфераза H. elongata специфична к L-глутамату как донору аминогрупп, рН_opt - 8.6-8.7, К_м для L-глутамата 9.1 мМ, для D,L-аспартатполуальдегида 4.5 мМ. Изоэлектрическая точка рI = 6.2.

В настоящее время превращение аспартатполуальдегида в ДАБ известно у нескольких не синтезирующих эктоин бактерий - Xanthomonas sp. и Acinetobacter baumannii (Ikai and Yamamoto, 1997; Rao et al., 1969). ДАБ-аминотрансфераза из А. baumannii участвует в биосинтезе компонента клеточной стенки -1,3-диаминопропана. Этот фермент также специфичен к аспартатполуальдегиду как акцептору аминогрупп и L-глутамату как донору аминогрупп, обладает сходными с ферментом из H. elongata значениями рН оптимума, Км для ДАБ и 2-оксоглутарата (Ikai and Yamamoto, 1997). Однако, в отличие от ферментов из H. elongate и А. baumannii, ДАБ-аминотрансфераза из Xanthomonas sp., использует L-аланин как донор аминогрупп (Rao et al., 1969).

ДАБ-ацетилтрансфераза из H. elongata была очищена в 400 раз, однако в гомогенном состоянии фермент получить не удалось вследствие его нестабильности. Кинетические константы также не определены. Молекулярная масса фермента, определенная гель фильтрацией, составила около 45 кДа (Ono et al., 1999).

Эктоинсинтаза была очищена до гомогенного состояния в присутствии 1 мМ ДАБ и 2 М NaCl в качестве стабилизаторов. Фермент является гомодимером с молекулярной массой субъединицы 19 кДа, но в буфере с высокой осмолярностью (0.5 М NaCl), использовавшемся при гель-фильтрации, активность фермента не найдена. Поэтому неясно, действительно ли нативная эктоинсинтаза имеет молекулярную массу 35 кДа и является гомодимером, или имела место неспецифическая агрегация мономеров в присутствии высокой концентрации соли. Анализ аминокислотного состава эктоинсинтазы выявил повышенное содержание L-аспартата и L-глутамина. Фермент весьма специфичен к AДAБ, по-видимому, N-ацетильная группа в a-положении не участвует в циклизации молекулы. Изоэлектрическая точка фермента (рI) составила 4.2 - 4.4. Предполагается, что лимитирующим звеном биосинтетической последовательности эктоина является синтез ДАБ с участием ДАБ-аминотрансферазы. Это подтверждает факт отсутствия ДАБ в клетках H. elongata KS3 (Ono et al., 1998).

Все три фермента пути синтеза эктоина у H. elongatа имеют близкие параметры для проявления максимальной активности: рН 8.2 - 9.0, t = 15 - 20ºС и 0.4 - 0.5 М NaCl. Тем не менее, ДАБ-аминотрансфераза более активна в присутствии 0.01 - 0.5 М KCl, чем при тех же концентрациях NaCl (Ono et al., 1999). Оптимальные концентрации соли для активности трёх ферментов ниже, чем предполагалось исходя из галотолерантности H. elongata DSM2581, что, очевидно, связано с относительно низкой внутриклеточной концентрацией свободных ионов. Так, внутриклеточный уровень Na⁺ в клетках галофильных эубактерий Vibrio costicola и Brevibacterium sp., растущих в присутствии высокой концентрации NaCl, составлял 0.04 - 0.2 М (Gilboa et al., 1991; Nagata et al., 1995).

Недавно эктоингидроксилаза была очищена из Salibacillus salexigens и частично охарактеризована (Bursy et al., 2007). Фермент представляет собой мономер (М.м. 34 кДа) с оптимумами рН и температуры 7.5 и 32°C, соответственно. Эктоингидроксилаза S. salexigens является 2-оксоглутарат-зависимым ферментом и требует присутствия молекулярного кислорода в реакционной смеси. В активный центр эктоингидроксилазы входит одна молекула Fe(II), поэтому авторы отнесли данный белок к суперсемейству негемсодержащих Fe(II)- и 2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназ (EC 1.14.11). Максимальная активность фермента составила 13.8 Е/мг, K_м для эктоина и 2-оксоглутарата составили 3.5 ± 0.2 и 5.2 ± 0.2 мM, соответственно (Bursy et al., 2007).

Глава 3 Осмоадаптация аэробных метилотрофных бактерий

Аэробные метилотрофные бактерии используют метан (метанотрофы), его окисленные или замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии. Большинство коллекционных культур метанотрофов до конца 80-х годов были представлены нейтрофильными негалофильными штаммами, растущими при pH 6.5-7.5 и низкой солености (менее 0.5% NaCl). Исключение составляли морские метанотрофы, растущие при солености до 3% NaCl (Гальченко и др., 1986).

Первый солезависимый метанотроф Methylomicrobium pelagicum был выделен из Саргассова моря (Sieburth et al., 1987), но вскоре утерян, позднее, из образцов ила щелочных озер Тувы удалось выделить галотолерантный алкалофильный метанотроф Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, оптимально растущий при рН 9.0 в присутствии 4% NaCl с верхней границей галотолерантности при 9% NaCl (Хмеленина и др., 1996). Из гиперсоленого (14% NaCl) озера Сасык-Сиваш был выделен умеренно галофильный нейтрофильный метанотроф Methylomicrobium modestohalophilum 10S, растущий при pH 5.5-8.5 и солености от 0.2 до 9% (Калюжная и др., 1998), а также Methylohalobius crimeensis, устойчивый к 15% NaCl (Heyer et al., 2005), из содовых озер Южного Забайкалья были выделены пять штаммов облигатных метанотрофов Methylomicrobium buryatense, которые являются алкалотолерантыми галофилами (штаммы 4G, 5G и 6G) или галотолерантными факультативными алкалофилами (штаммы 7G и 5B) (Калюжная и др., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; 2008).

Первые галофильные метилобактерии были выделены из морских проб и представлены видами рода Methylophaga: М. marina, M. thalassica (Janvier et al., 1985), M. sulfidovorans (de Zwart et al., 1996), M. limanica (Доронина и др., 1997). Методом in situ гибридизации было показано широкое распространение бактерий рода Methylophaga в морских образцах (Janvier et al., 2003). Из лимана Азовского моря и засоленной почвы г. Алушта были выделены в чистые культуры умеренно галофильные метилобактерии, оптимально растущие в присутствии 3-6% NaCl, и рН 7.5-8.5 и классифицированные как виды нового рода Methylarcula: M. marina и M. terricola (Doronina et al., 2000). Из содовых озер Южного Забайкалья и Монголии были также выделены два В₁₂-зависимых изолята метилобактерий, оптимально растущих в присутствии 3-6% NaCl, рН 7.0-11.0 и температуре 25-29°С, идентифицированых как новые алкалофильные виды рода Methylophaga: М. alcalica и M. natronica (Doronina et al, 2003 a,b).

Исследования цитобиохимических особенностей солезависимых метанотрофов и метилобактерий показали, что у них реализуются различные механизмы осмоадаптации. У гало(алкало)фильных метилотрофов при повышении осмолярности измененяется химический состав мембран, в частности, возрастает относительное содержание отрицательно заряженного фосфатидилглицерина и понижение доли ФЭА (Khmelenina et al., 1999). В фосфолипидном пуле клеток метилобактерий в ответ на повышение солености возрастают уровни фосфатидилглицерина и кардиолипина на фоне снижения доли фосфатидилэтаноламина (Троценко и др., 2007). Подобный солезависимый ответ на повышение солености типичен для многих грамотрицательных галофильных и галотолерантных эубактерий (Imhoff and Thiemann, 1991). Известно, что отрицательно заряженный фосфатидилглицерин, а также цвиттерионный фосфатидилхолин обладают стабилизирующим действием на мембраны, формируя мембранный бислой, способствующий избирательной диффузии катионов. Таким образом, у метилотрофов реализуется общий для бактерий «пассивный» механизм поддержания ионного гомеостаза. У солезависимых метанотрофов рода Methylomicrobium, кроме того, выявлены дополнительные поверхностные гликопротеиновые слои (S-слои), полностью покрывающие клеточную стенку бактерий. Придавая клеточному конверту бактерий дополнительную прочность, что особенно актуально в случае изменяющегося осмотического давления среды, эти регулярные поверхностные структуры, возможно, также участвуют в осмоадаптации. Наряду с повышением ригидности клеточных конвертов все изученные солезависимые метилотрофы синтезируют низкомолекулярные осмопротекторные соединения.

Методом ЯМР в клетках исследованных галофильных и галотолерантных метанотрофов и метилобактерий выявлено присутствие эктоина, сахарозы и глутамата (Khmelenina et al., 1999; Троценко и др., 2007). Пул этих соединений увеличивался с повышением солености среды культивирования, причем внутриклеточная концентрация эктоина у Mm. alсaliphilum 20Z достигала 1.4 М, глутамата - 0.4 М в пересчете на внутриклеточную воду. Очевидно, противоионом для глутамата служит К⁺, поскольку их концентрации в цитоплазме были эквимолярны. Суммарное внутриклеточное содержание всех осмопротекторов у исследованных штаммов полностью уравновешивало осмолярность среды (Doronina et al., 2003 a,b).

Метилобактерии рода Methylophaga при росте на средах с низкими концентрациями NaCl (2-3%) накапливают только глутамат, а при увеличении солености среды до 10-12% основным осмопротектором является эктоин. Кроме того, у M. murata внутриклеточные концентрации глутамата и эктоина возрастали при снижении температуры культивирования.

Установлено, что последовательность реакций биосинтеза эктоина у метилотрофов идентична таковой у галофильных гетеротрофов и начинается реакцией трансаминирования L-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося L-2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией N-ацетил-L-2,4-ДАБ в эктоин. Эти реакции катализируются ДАБ-ацетилтрансферазой, ДАБ-аминотрансферазой, эктоинсинтазой (Рис.2). Полная нуклеотидная последовательность генов биосинтеза эктоина была определена у Mm. alcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica. Показано, что у данных бактерий гены синтеза эктоина организованы в четырехгенный оперон ectABCask, в состав которого входит дополнительный ген аспартаткиназы (ask) (Reshetnikov et al., 2006; Решетников, 2006). Гены ectABC метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z были амплифицированы и клонированы в плазмиду pHSG575. Клетки E. coli, трансформированные полученной плазмидой, накапливали эктоин и росли в присутствии 4% NaCl, что доказывает участие генов ectABC в биосинтезе эктоина (Reshetnikov et al., 2006).

Рис. 2. Путь биосинтеза эктоина и аминокислот аспартатного семейства у бактерий (Louis and Galinski, 1997)

У Mm. аlcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica гены биосинтеза эктоина сцеплены и составляют оперон ectABC-ask, в состав которого входит дополнительный ген аспартаткиназы (ask) (Рис З.). Наличие дополнительного гена ask, возможно, обеспечивает относительно независимый от основного метаболизма контроль синтеза предшественника эктоина – аспартилфосфата (Reshetnikov et al., 2006; Троценко и др., 2007).

Сравнение транслированных аминокислотных последовательностей белков EctА, EctB и EctС показало, что у метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z эти белки имеют большеe сходство с соответствующими белками из метилобактерий M. alcalica и M. thalassica (75-85% гомологии) и низкое сходство (36-63%) с соответствующими ферментами из других галофильных бактерий. Причем ферменты биосинтеза эктоина метилотрофных бактерий формируют единые кластеры на соответствующих филогенетических деревьях, включающих ферменты гетеротрофных галлофилов (Решетников, 2006).

Рис. 3. Организация генов биосинтеза эктоина. ectA – ДАБ-ацетилтрансфераза, ectB – ДАБ-аминотрансфераза, ectC – эктоинсинтаза, ectD – эктоингидроксилаза и ask – аспартаткиназа.

Достаточно высокое сходство нуклеотидных последовательностей генов ectА, ectB и ectС позволило выдвинуть гипотезу о высокой консервативности пути биосинтеза эктоина и распространении ect-генов среди бактерий посредством латерального переноса (Kuhlman and Bremer, 2002).

Способ получения эктоина реализован фирмой «Biomol» (Германия) с использованием гетеротрофной бактерии Halomonas elongata на среде с глюкозой, L-аминокислотами и 12%-ным NaCl. Умеренно галофильные метанотрофы при росте на среде с 6% NaCl способны накапливать до 20% эктоина, т.е. выше, чем у гетеротрофных продуцентов, растущих при 12% NaCl (Хмеленина с соавт., 2000; Khmelenina et al., 1999). Это позволяет рассматривать галофильные метилотрофы как потенциальные продуценты эктоина. Причины различий в уровнях осмопротектора могут быть в генетически детерминированных регуляторных механизмах биосинтеза эктоина. Так, синтез эктоина у галофильных метанотрофов происходит через биохимический путь, близкий таковому у гетеротрофных галофильных бактерий (Решетников и др., 2004; Reshetnikov et al., 2006). У Mm. alcaliphilum 20Z организация генов биосинтеза эктоина существенно отличается, поскольку они составляют четырехгенный кластер, включающий дополнительный ген аспартаткиназы. Это предполагает присутствие у облигатного метанотрофа специфической изоформы аспартаткиназы, которая, по-видимому, обеспечивает относительно независимый от основного конструктивного метаболизма синтез предшественников эктоина - аспартилфосфата и аспартилполульдегида.

Из вышеизложенного логически следует необходимость расшифровки полной нуклеотидной последовательности и сравнительное изучение генов синтеза эктоина у M. marina. Это позволит оценить степень дивергенции ect-генов у различных изолятов и проследить эволюцию этого биосинтетического пути. Кроме того, необходимость понимания принципов организации и регуляции генов и ферментов биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофов диктуется практическими задачами получения этого биопротектора, все более активно используемого в медицине, косметике и научной практике в качестве водоудерживающего средства, стабилизатора биомолекул и клеток.

Экспериментальная часть

Глава 4 Материалы и методы исследования

4.1 Культивирование бактерий

В работе использовали чистую культуру аэробной метилотрофной бактерии Methylarcula marina из коллекции лаборатории метилотрофии ИБФМ РАН. Methylarcula marina выращивали на среде “K” (табл. 2). Среду и раствор микроэлементов стерилизовали при 1 атм, 30 мин. Непосредственно перед засевом в качестве источника углерода вносили метиламин в конечной концентрации 1%. Культивирование проводили в колбах объёмом 750 мл, содержащих 200 мл среды. Инокулят добавляли в среду в соотношении 1:10 и встряхивали на роторной качалке (140 об/мин) при 26 °C.

Escherichia coli XL1-Blue, BL21(DE3) или S17-1 (штммы E. coli любезно предоставлены к.б.н. Ивашиной Т.В. ИБФМ РАН) выращивали при 37^oС на жидкой или агаризованной (1.5% агара “Difco”) средах “LB” (табл. 2) с разными концентрациями соли (0-5% NaCl) с добавлением при необходимости селективных антибиотиков: канамицина (Km) - 50 мкг/мл, ампициллина (Amp) - 100 мкг/мл или хлорамфеникола (Cm) - 25 мкг/мл.

Таблица 2. Питательные среды, использованные в работе.

	Компонент среды	Концентрация
“К”	КН2РО4 (NH4)2SO4 MgSO4×7H2O FeSO4×7H2O NaCl рН доводили до 7.4 Агар*	2.0 г/л 2.0 г/л 0.025 г/л 0.002 г/л 0.5 г/л 2%
“LB”	Бакто-триптон Дрожжевой экстракт NaCl КСl MgCl2×6H2O МgSO4×7H2O Глюкоза	20 г/л 5 г/л 0.584 г/л 0.186 г/л 2.03 г/л 2.463 г/л 3.6 г/л

4.2 Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка

Клетки в экспоненциальной фазе роста центрифугировали (30 мин при 6000 об/мин), дважды отмывали в буфере А (100 мМ трис-НCl, рН 8.0, содержащий 2.5 мМ MgCl₂ и 1.5% KCl) и ресуспендировали в том же буфере. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (Англия) мощностью 150 Вт при 20 Гц (3×1 мин с минутными перерывами) при охлаждении. Неразрушенные клетки отделяли центрифугированием при 4^oС (14000 об/мин в течение 30 мин).

Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури (Schacterle, Pollack, 1973) с использованием БСА в качестве стандарта.

4.3 Определение активности диаминобутиратацетилтрансферазы

Диаминобутиратацетилтрансферазу (ДАБАцТ) (НФ 2.3.1.-). Активность фермента определяли при 20°С по образованию 5-тио-2-нитробензойной кислоты (ε₄₁₂ = 13,6 мМ^-1 ×см^-1) в результате взаимодействия 5,5’-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ) с сульфгидрильными группами КоASH, образующимися в ходе реакции (Srere, 1969). Реакционная смесь (1 мл) содержала (мкмоль): Тris-HCl буфер - 100, рН 8.0, ДТНБ -0.1, ацетил-КоА - 1, КCl - 200 и L-2,4-диаминобутират (ДАБ) – 10. За единицу активности (Е) ДАБАцТ принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоль КoASH за 1 мин. Активность фермента определяли на регистрирующем спектрофотометре “Shimadzu UV-160” (Япония) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм. Активность фермента выражали как число наномолей образованой 5-тио-2-нитробензойной кислоты на 1 мг белка в мин.

4.4 Выделение и анализ осмопротекторов

Низкомолекулярные органические соединения экстрагировали из клеток, выросших при разной солёности среды (0 – 8% NaCl). 100-200 мг клеток (вес сырой биомассы) ресуспендировали в 2 мл метанола, выдерживали 1 ч при встряхивании. Суспензию центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Супернатанты высушивали в вакуумном испарителе, ресуспендировали в 0.5 мл 0.01 М раствора малеиновой кислоты в D₂О (или в дионизованной воде, для анализа на ВЭЖХ) и анализировали методом протонного резонанса, используя ЯМР-спектрометр высокого разрешения WP 80SY (“Bruker Spectrospin”, Швейцария) с рабочей частотой 80 Мгц. Содержание внутриклеточных метаболитов в образцах определяли сравнением интенсивности сигналов протонов метаболитов с интенсивностью сигналов протонов малеиновой кислоты как внутреннего количественного стандарта (Khmelenina et al., 1999).

Экстракция и количественное определение эктоина. Эктоин экстрагировали из клеток, выросших без соли (Methylobacterium extorquens) и при разной солёности среды (0 – 8% NaCl), когда анализировали накопление эктоина у Methylarcula marina. 100-200 мг клеток (вес сырой биомассы) ресуспендировали в 2 мл метанола, выдерживали 1 ч при встряхивании. Суспензию центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Супернатанты высушивали в вакуумном испарителе, ресуспендировали в дионизованной воде, для анализа на ВЭЖХ. Для количественного определения эктоина использовали модифицированный метод ВЭЖХ (Kuhlmann and Bremer, 2002). 20 мкл водного раствора образца наносили на колонку SGX NH₂ (3×150 мм, 5мкм; Чехия) и элюировали 80% ацетонитрилом (вода/ацетонитрил) со скоростью 1мл/мин. Регистрацию пиков проводили на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США) при 190 нм. В качестве стандарта использовали эктоин фирмы “Sigma”.

4.5 Молекулярно-биологические методы

Выделение геномной ДНК

Очистку хромосомной ДНК проводили модифицированным методом (Marmur, 1961). 1 г сырых клеток ресуспендировали в 9 мл TE-буфера (табл.3). К суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 1 мг/мл. Тщательно перемешивали и инкубировали 30 мин при 37 °С. Затем добавляли 50 мкл протеиназы К (концентрация 20 мг/мл) и инкубировали 30 мин при 37 °С. К суспензии добавляли 250 мкл 20% раствора додецилсульфат натрия (SDS) и инкубировали 60 мин при 65 °С. Далее к раствору добавляли 1.8 мл 5М NaCl и 1.5 мл 10% цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) в 0.7 М NaCl. Лизат выдерживали 20 мин при 65 ^оС.

В лизат добавляли равный объем хлороформа (используется смесь хлороформа и изоамилового спирта - 24:1). Тщательно перемешивали и центрифугировали при 10000 об/мин, 15 мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку. Добавляли равный объем фенола, тщательно перемешивали и повторно центрифугировали для разделения фаз. Верхнюю фазу, не затрагивая интерфазы, переносили в новую пробирку. К раствору добавляли равный объем смеси фенола и хлороформа, перемешивали, центрифугировали и отбирали верхнюю фазу. Добавляли равный объем хлороформа, раствор перемешивали и центрифугировали 15 мин при 10000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку и добавляли равный объем хлороформа, перемешивали и центрифугировали. Экстракцию хлороформом проводили несколько раз до просветления верхней фазы.

Для осаждения ДНК из верхней фазы добавляли 2.5 объема охлажденного 96% этанола и 0.1 объема 3 М ацетата калия, тщательно перемешивали и центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Осадок ДНК промывали последовательно 80% и 96%-ным растворами этанола и подсушивали на воздухе. ДНК растворяли в 0.5 мл ТЕ-буфера. Добавляли 10 мкл РНК-азы (10мг/мл) и инкубировали 1 ч при 37 ^оС. Повторяли экстракцию смесью фенола-хлороформа. ДНК из раствора осаждали добавлением 2.5 объема 96% этанола и 0.1 объем 3 М ацетат калия, перемешивали и центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин. Осадок ДНК промывали последовательно 80% и 96% растворами этанола и подсушивали на воздухе. Полученный осадок ДНК растворяли в 1 мл ТЕ-буфера. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре “Shimadzu UV-160” (Япония) при 260/280 нм. Растворы ДНК хранили при -20 ^оС

Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

Гидролиз ДНК различными эндонуклеазами рестрикции проводили, согласно инструкциям фирм “СибЭнзим” (Россия) и “Fermentas” (Литва), используя для каждой эндонуклеазы рекомендованный буфер и соответствующий температурный режим.

ДНК разделяли и визуализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, используя в зависимости от длины разделяемых ДНК 0.75% - 1%-ную агарозу и 1×ТВЕ буфер (табл. 3). Для оценки размеров фрагментов ДНК использовали ДНК-маркеры молекулярного веса “GeneRuler^™ 100bp DNA Ladder” (“Fermentas”).

Очистка фрагментов ДНК.

Освобождение фрагментов ДНК от компонентов реакции проводили двумя способами: непосредственно из реакционной смеси или из агарозного геля после электрофореза.

Для этого к реакционной смеси или вырезанной полоске геля, содержащей нужный фрагмент ДНК, добавляли 5 объемов 5 М гуанидинтиоцианата, 0.1 М Tris-НС1 (рН 7.0) и 15 мкл суспензии кварцевого порошка “Silica” (100 мг/мл). При использовании полоски геля суспензию “Silica” добавляли после полного растворения геля. Полученную смесь центрифугировали 2 мин при 5000 об/мин. Осадок трижды промывали 750 мкл промывочного буфера (60% этанол, 80 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-НС1 рН 7.0) и высушивали. Элюцию ДНК проводили в 50 мкл буфера (10 мМ Tris-HCl, рН 8.5). В отдельных случаях фрагменты ДНК выделяли из агарозы и очищали с использованием набора “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” (“Promega”, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Лигирование фрагментов ДНК.

Фрагменты ДНК после обработки соответствующей рестриктазой клонировали в вектор, раскрытый по тем же рестриктазам, либо ПЦР-фрагменты клонировали в вектор pZero-2, предварительно раскрытая по сайту EcorV .

Реакцию лигирования проводили в объеме 10 мкл, содержавшем 1×буфер для лигирования, 50-100 нг ДНК вектора и 3-5-кратный молярный избыток клонируемого фрагмента ДНК, 5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 (“СибЭнзим”). Лигирование по липким концам проводили в течение 4-16 ч при 14°С. По окончании реакции ДНК-лигазу инактивировали прогреванием при 70°С 15 мин. Лигазную смесь использовали для трансформации в клетки E. coli.

Лигирование в кольца фрагментов хромосомной ДНК. Фрагменты хромосомной ДНК M.marina, полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, лигировали сами на себя в объеме 0.5 мл. Лигирование проводили при 16°С в течение ночи с разведениями субстратной ДНК 0.1-0.5 мкг/мл и 5 ед. ДНК лигазы фага Т4. ДНК осаждали из лигазной смеси добавлением 2.5 объема этанола и 0.1 объёма 3М ацетата натрия, центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин, осадок промывали 80% и 96%-ным этанолом и растворяли в ТЕ-буфере. Полученную ДНК использовали в инвертированной ПЦР.

Получение компетентных клеток и их трансформация.

Получение компетентных клеток с применением CaCl₂.Ночную культуру клеток (0.1 мл) вносили в 10 мл среды LB и выращивали при интенсивном перемешивании при 37°С до середины логарифмической фазы (А₆₀₀= 0.4 – 0.6), охлаждали во льду 10 мин и центрифугировали (5000 об/мин, 5 мин при 4°С). Осторожно удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 750 мкл 100 мМ СаСl₂, выдерживали на ледяной бане 20 мин, центрифугировали в тех же условиях. После удаления супернатанта осажденные клетки ресуспендировали в 75 мкл 100 мМ СаСl₂ и распределяли по 10 мкл в предварительно охлажденные пробирки. Полученные компетентные клетки использовали для трансформации сразу, либо после хранения при 4 °С не более 12-24 ч.

Трансформация компетентных клеток. К компетентным клеткам (10 мкл) добавляли лигазную смесь или раствор ДНК объемом 1-5 мкл, помещали пробирки в лед на 30 мин, а затем быстро переносили в водяную баню 42 °С на 2 мин и охлаждали во льду 10 мин. Добавляли в каждую пробирку 800 мкл среды LB и инкубировали при 37°С 1 ч. Клетки осаждали центрифугированием(14000 об/мин, 4°С, 15-30 сек), сливали надосадочную жидкость, ресуспендировали клетки в её остатках (50-100 мкл) и высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей антибиотики, необходимые для селекции трансформированных клонов.

Выделение плазмид из рекомбинантных клонов.

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook and Russell, 2001). 3-4 мл ночной культуры E. coli, содержащей плазмиду, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин, ресуспендировали в 250 мкл раствора I (табл. 8) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 250 мкл свежеприготовленного раствора II (табл. 8), осторожно перемешивали до полного просветления лизата. К лизату добавляли 250 мкл 3 М ацетата калия, перемешивали, оставляли во льду на 20 мин и центрифугировали (14000 об/мин, 30 мин) при 4 °С. Надосадочную жидкость переносили в пробирки, добавляли равный объем фенола, тщательно перемешивали и повторно центрифугировали, водную фазу отбирали в новую пробирку. Добавляли равный объем смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали (14000 об/мин, 5 мин), водную фазу отбирали в новую пробирку. Затем добавляли равный объем смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали (14500 об/мин, 5 мин). Водную фазу переносили в новую пробирку и добавляли 0.7 объема изопропанола, инкубировали в течение 0.5-1 ч при -20 ºС. После центрифугирования осадок последовательно промывали 70%- и 96%-ным этанолом, высушивали и растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Добавляли РНКазу, свободную от ДНКазы, до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Затем в раствор добавляли 50 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1), центрифугировали (14500 об/мин, 5 мин), отбирали верхнюю фазу, добавляли равный объем хлороформа, повторно центрифугировали. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, приливали 2.5 объема этанола и 5 мкл 3 М ацетата натрия. Для полного осаждения плазмидной ДНК пробы выдерживали 10 мин при -20 °С и центрифугировали (14000 об/мин, 10 мин). Осадок дважды промывали 80% и 96%-ным этанолом и растворяли в 30 мкл воды. Выход плазмидной ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле.

Создание праймеров и ПЦР.

Конструирование праймеров осуществляли с помощью программного пакета “VectorNTI^®Advance v.9.0” и “OLIGO v.4.0”. Олигонуклеотиды синтезированы фирмой “Синтол” (Москва).

а) ПЦР с геномной ДНК проводили в термоциклере Hybaid (Англия) или Eppendorf (Германия). Реакционная смесь (30 мкл) содержала 50-100 нг ДНК, по 0.2 мM каждого из четырёх дНТФ, 1×ПЦР буфер (табл. 8), БСА 0.1 мг/мл, 40 пмоль каждого праймера (табл. 10) и до 3 ед. Taq-ДНК-полимеразы (“СибЭнзим”). Цикл амплификации состоял из денатурации ДНК при 94 °С - 2 мин, последующие 30 циклов: денатурации 94 °С – 30 с, отжига праймеров при 46-54 °С (в зависимости от праймера) – 30 с, и элонгации ДНК при 72°С - 2 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72°С, 4 мин.

б) Инвертированная ПЦР.

Для этой реакции в качестве матрицы использовали фрагменты хромосомной ДНК M.marina, полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, замкнутые в кольцо в предварительной реакции лигирования. Перед ПЦР полученную кольцевую ДНК прогревали 15 мин при 95 °С. В реакции использовали праймеры (по 20 пмоль каждый) и Taq-полимеразу, остальные компоненты реакции были те же, что в стандартной ПЦР. Реакцию (30 циклов) проводили в следующем режиме: при температура плавления 94 °С - 30 с; при температуре отжига 54 °С - 40 с; при температуре синтеза 72 °С - 4 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72 °С – 8 мин.

в) Векторетная ПЦР

Cтратегия векторетного ПЦР заключается в создании адаптеров (двухцепочечных молекул ДНК) используя комплементарные олигонуклеотиды (вектореты), с последующим отжигом друг с другом. Отжиг комплементарных последовательностей vect57 и vect53 (табл. 5) проводили при температуре 65°С в течении 5 мин с последующим охлаждением во льду. Для стабилизизации полученного адаптера в реакционную смесь добавили MgCI2 до концентрации 25 мМ и инкубировали при 65°С в течении 5 мин, затем охлаждали в течении 1 ч при комнатной температуре.

Для векторетной ПЦР хромосомную ДНК (10 нг) инкубировали в присутствии 20 ед. рестриктазы BamHI при 37°С с последующей инактивацией рестриктазы при 65°С 20 мин. Лигирование разрезанной хромасомной ДНК и адаптеров проводили в присутствии 50 ед. T4 Ligase при 16°С 12-16 ч. Праймер C20 и специфичный для гена ask праймер AskF использовали в ПЦР для амплификации гена ask. Праймер C20 и специфичный для гена ectA праймер ectF использовали в ПЦР для амплификации гена ectA.

г) Амплификацию генов биосинтеза эктоина из хромосомной ДНК (10 нг) проводили с использованием прямого и обратного праймеров (15 пмоль каждого) (табл. 10). Для амплификации полного гена ectA из M. marina использовали праймеры EAN и EAС, для гена ectB - ectBN и ectBC, для гена ectС - ectСN и ectСC и для гена ask – AskN и PET19Z или AskN и BglII. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего гены ectАВС, использовали праймеры Opr1 и Opr2. Реакцию проводили, используя смесь ДНК-полимераз Tag/Pfu в соотношении активностей 20:1. Остальные компоненты реакции были те же, что и в стандартной ПЦР.

Коньюгация.

Для коньюгации использовали штамм-донор E. coli S17-λpir, который предварительно трансформировали коньюгативной плазмидой pBSL-180:Pmax:ectABC (полученной на основе рBSL-180). 10 мл ночной культуры E. coli центрифугировали 3 мин при 5000 об/мин и промывали 5 мл стерильной среды “K”. Клетки ресуспендировали в 0.5 мл среды “K”. В качестве реципиента использовали штамм Methylobacterium extorquens AМ1. 50 мл культуры, выращенной до ОП₆₀₀=0.4, центрифугировали и промывали средой “K”. Клетки метилобактерий ресуспендировали в 0.5 мл среды “K” и смешивали с 0.5 мл суспензии клеток E. coli. Смесь переносили на агаризованную среду “К”, содержащую 0.2% Proteose peptone (“USBiological”, США), чашки инкубировали 24 ч при 28 °С. После инкубации клетки смывали с поверхности агара 2 мл стерильной среды “К”. Аликвоту суспензии 10-20 мкл растирали на селективной агаризованной среде “К”, содержащей 0.5% метанола и 30 мкг/мл канамицина. Чашки инкубировали до образования колоний (обычно 6 дней). Для удаления (присутствующих) клеток E. coli, трансконьюганты пересевали на агаризованную среду “К”, содержащую 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 30 мкг/мл канамицина.

4.6 Определение и анализ последовательностей нуклеотидов

Cеквенирование ДНК проводилось на фирме “Силекс” (Москва) с помощью “Big Dye Terminator Ready Reaction Kit” (“Applied Biosystems”, США) на автоматическом ДНК секвенаторе “DNA Sequencer ABI PRISM 310” (“Applied Biosystems”, США), в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Использовали 0.3-0.5 мкг ПЦР-фрагмента и соответствующий праймер. Для определения полной последовательности нуклеотидов в ДНК фрагментах, длина которых превышала 1000 п.н., на основе полученных последовательностей конструировали новые праймеры. Эти праймеры использовали затем для реакций секвенирования.

Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00, пакета программ VectorNTI^®Advance v.9.0, DNAStar v.4.04 и Clone Manager 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли посредством программы ClustalX (v1.62b) (Thompson et al., 1997) и GeneDoc. Филогенетический анализ осуществляли с помощью пакета программ PHYLIP v.3.6, используя программы SEQBOOT, PROTPARS и CONSENSE (Felsenstein, 2004).

4.7 Клонирование и экспрессия гена ectA

Ген ectA, содержащий сайт для рестриктазы Nco при инициирующем кодоне и сайт на 3’ конце фрагмента для HindIII, амплифицировали из геномной ДНК M. marina с использованием праймеров EctA(halN-N) и EctA(hal-C) (табл. 10). Фрагмент после обработки рестриктазами Nco и HindIII, содержащий ген ectA, лигировали в вектор pET28, с образованием вектора pETectA.

4.8 Выделение и очистка рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

Клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pETectA, выращивали в 0.5 л среды LB c Аmp (50 мкг/мл для pETectA) при 37 ºС до оптической плотности А₆₀₀ = 0.6-0.7, добавляли Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при 25 °С в течение 3 ч. Белок выделяли из суперпродуцента E. coli, как описано в протоколах фирмы “Quaigen” (Германия) с небольшими изменениями. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл лизисного буфера (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 20 мМ имидазола, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 10 мг/мл лизоцима) и разрушали ультразвуком (3×0.5 мин с минутными перерывами). Лизат клеток центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин и 4 °С, супернатант наносили на колонку, содержащую Ni²⁺-нитроацетат агарозу (“Quiagen”), объемом 5 мл. После промывки буфером (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 60 мМ имидазол) связанный белок элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 150 мМ имидазола. Белковый спектр отобранных фракций, объёмом 0.5 мл, идентифицировали методом SDS электрофореза по Лэммли. Фракция, содержащая целевой белок (EctA-His₆-tag), объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-НCl буфера, рН 8,0 (содержащий 50 мМ КCl для ДАБ-ацетилтрансферазы и концентрировали с помощью Microcon YM-10 (“Millipore”, США).

Гель-фильтрацию белка EctA_hal1-His₆, проводили на колонке c Ultrоgel AcA54 (1.5×90 см), уравновешенной буфером, содержащим 50 мМ Трис-НСl, pH 8.0, 0.2 M NaCl. Скорость элюции - 15 мл/ч. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор стандартных белков (“Sigma” и “Pharmacia”): ферритин (450 кДа), БСА (66 кДа), ОВА (45 кДа), ДНКаза (31 кДа), лизоцим (14 кДа), цитохром с (12 кДа). Выход белка определяли по поглощению при 280 нм на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США).

4.9 Определение физико-химических свойств ферментов

Определение рН- и температурных оптимумов ДАБ-ацетилтрансферазы.

При определении рН-оптимумов применяли буферные системы рН 6.0-9.0. Использовали следующие буферные растворы: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6.0-8.0; 100 мМ Трис-HCl буфер, рН 7.0 -9.0. Температурные оптимумы определяли в интервале температур от 5 до 35 ºС с использованием термоконтроллера “Shimadzu UV-160” (Япония).

Таблица 3. Буферы и растворы, использованные в работе.

Таблица 4. Плазмиды, использованные в работе.

Таблица 5. Праймеры, использованные в работе.

Результаты и обсуждение

Глава 5 Идентификация и характеристика генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерий Methylarcula marina

5.1 Накопление эктоина галотолерантным метилотрофом Methylarcula marina

Метанольные экстракты клеток галотолерантного метилотрофа Methylarcula marina анализировали методом ВЭЖХ на содержание эктоина. При увеличении солености среды в клетках M. marina возрастает содержание эктоина, причем максимальное содержание эктоина наблюдали при 8% NaCl (рис. 4). Рост M. marina замедляется при концентрации выше 6% NaCl. Снижение уровня эктоина в клетках, растущих при солености выше 8%, по-видимому, связано с накоплением других осмолитов.

Рис 4. Накопление эктоина клетками M. marina в ответ на солевой стресс NaCl, %

Следовательно, у M. marina эктоин является осмопротектором, т.е. соединением, ответственным за поддержание осмотического баланса между цитоплазмой и внешней средой. Далее представляло интересс изучить организацию генов биосинтеза данного осмолита у метилобактерии.

5.2 Идентификация генов, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина у M.marina

Для идентификации генов синтеза эктоина у M. marina был использован подход, основанный на ПЦР методологии. Проведенный ранне анализ опубликованных и представленных в GenBank данных свидетельствовал о том, что у исследованных видов галофильных и галотолерантных бактерий гены, кодирующие ДАБ-ацетилтрансферазу, ДАБ-аминотрансферазу и эктоинсинтазу, расположены в одном кластере в последовательности ectABC. В результате сравнения аминокислотных последовательностей этих белков у галофильных гетеротрофных бактерий Marinococcus halofilus DSMт20408, Halomonas elongatа DSM 2581, Cromohalobacter salexigens (ранее Halomonas elongatа DSM 3043), Bacillus pasteurii, Vibrio cholerae, Bacillus haldurans, Oceanobacillus iheyensis (GenBnk AP004594), Streptomyces coelincolor (GenBank AL591322), а также ectABC кластеров у метилотрофных бактерий (Mm. alcaliphilium 20Z, Mm. kenyense AMO1, M. alcalica M8 и M. thalassica MT), и анализа найденных гомологичных участков были выбраны наиболее консервативные последовательности. С учётом вырожденности и встречаемости кодонов в генах, кодирующих эти белки, мы использовали ранее разработанные и созданные новые вырожденные праймеры для их амплификации (Рис. 5). При конструировании праймеров предполагалось, что у M. marina гены биосинтеза эктоина находятся в одном кластере и расположены последовательно: ectA, ectB и ectC (Рис. 5).

Рис. 5. Схема расположения генов биосинтеза эктоина у M. marina и разработанных вырожденных праймеров (ectHal, Tra3, CR).

Нуклеотидные последовательности праймеров ectHal и Tra3-C_R представлены в табл. 5.

C использованием пары праймеров Tra3-C_R были получены ПЦР-фрагменты генов ectB и ectC общей длиной ~1000 п.н. (Рис. 5а). ПЦР-продукт клонировали в вектор рZero и секвенировали. На основе выявленной нуклеотидной последовательности был синтезирован праймер HalR, комплементарный этой последовательности. С использованием вырожденного праймера ectHal и HalR был получен ПЦР-продукт длиной ~1150 п.н. содержащий 3’-конец гена ectA и 5’-конец гена ectB (Рис. 5б). Это указывало на сопряженное расположение генов в кластере в первоначально предположенной последовательности – ectABC. Допуская, что, аналогично другим метилотрофам - Mm. alcaliphilium 20Z, M. alcalica M8 и M. thalassica MT (Решетников, 2006), вслед за геном ectC расположен ген, кодирующий специфическую аспартаткиназу, был сконструирован и синтезирован вырожденный праймер Rtn на ген ask. С использованием комплементарного праймера HalF на ген ectB и вырожденного праймера Rtn был амплифицирован фрагмент ДНК длиной ~1250 п.н. и секвенирован (Рис. 6с)

Таким образом, мы получили полные последовательности генов ectB и ectC, а также ~100 п.н. гена ectA и ~180 п.н. гена ask.

Рис. 6. Электрофорез ПЦР продуктов полученных с использованием праймеров:

a) Tra3-CR; б) ectHal-HalR и c) HalF-Rtn. M - маркер “ Gene RulerTM 100bp DNA Ladder plus”.

Секвенирование ПЦР-продуктов и анализ нуклеотидных последовательностей позволили объединить их в один фрагмент длиной ~2100 п.н., в котором обнаружены четыре открытые рамки считывания, среди которых ОРС, соответствующие генам ectA и ask, были неполными.

Рис. 7. Схема расположения ect-генов у M. marina и положение праймеров. Последовательности праймеров приведены в табл. 5.

Для идентификации недостающей последовательности гена ask была применена стратегия инвертированной ПЦР. Инвертированная (от англ. “inverse”), или обратная, ПЦР применяется для клонирования областей ДНК, непосредственно прилегающих к области с известной последовательностью. Данный подход удобен тем, что устраняется необходимость создания геномных библиотек и их последующего скрининга, что достаточно трудоёмко. Суть метода заключается в следующем: геномную ДНК фрагментируют расщеплением эндонуклеазами, не имеющими сайтов внутри известной последовательности. Полученные фрагменты лигируют при низкой концентрации ДНК в условиях, когда образуются преимущественно кольцевые молекулы. Полученные кольцевые молекулы ДНК используют в качестве матрицы в ПЦР, которую проводят с праймерами (Рис. 8, праймеры 1 и 2), соответствующими концевым областям известной последовательности, синтез с которых направлен в стороны с неизвестной последовательностью (Sambrook, Russell, 2001).

Рис. 8. Схема клонирования участков ДНК, прилегающих к фрагментам с известной последовательностью.

Для расщепления хромосомной ДНК M. marina была выбрана рестриктаза ApoI. В результате ПЦР с использованием праймеров Askn и Askg (комплементарные гену ask) и кольцевых молекул ДНК был получен фрагмент ~690 п.н. (рис. 9)

M

Рис. 9. Электрофорез продуктов инвертированной ПЦР, полученных с использованием кольцевых молекул ДНК M. marina и праймеров:

Hal-askR(inv) и Hal(inv)-askF, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Анализ нуклеотидной последовательности полученного фрагмента выявил внутренную область гена ask.

Для того, чтобы выявить полную последовательность гена ask, нами была использована стратегия векторетного ПЦР. Эта стратегия основывается на создании адаптора с известной последовательностью и с сайтом рестрикции. Созданный адаптор с выступающим 5’ концом (GATC), был получен из двух комплементарных олигонуклеотидов vect57 и vect53. Гидролизованная по рестриктазе BamHI тотальная ДНК M. marina (обладающая комплементарной последовательностью к липкому 5’ концу адаптора) была лигирована с адаптором, с последующей амплифицированией используя праймер на адаптор С20 и комплементароного праймера на тотальную ДНК (рис 10).

Рис. 10. Схема векторетного ПЦР-анализа

Используя комплементарный праймер AskF на ген ask и праймер C20 на адаптор, был амплифицирован фрагмент ДНК ~1400 п.н. и севенирован(Рис 11а). В результате секвенирования ПЦР-фрагмента и анализа нуклеотидных последовательностей получили фрагмент ДНК, кодирующий полную последовательность гена ask.

Для идентификации недостающей 5’ обасти гена ectA была использована векторетная ПЦР. Используя комплементарный праймер ectF на ген ectA и С20 на адаптор, был получен ПЦР-продукт длиной ~1300 п. н. (Рис 11б) и секвенирован. Анализ нуклеотидной последовательности выявил недостающую область гена ectA.

М М

А) ~1400 п.н. б) ~1300п.н.

Рис. 11. Электрофорез продуктов векторетной ПЦР, полученных с использованием тотальной ДНК M. marina и праймеров: a) на ген ask и праймеры AskF и C 20, б) на ген ectA и праймеры ectF и C 20, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Анализ нуклеотидной последовательности, вверх по направлению от гена ectA, выявил ОРС, кодирующую белок из 184 аминокислотных остатка, проявляющий гомологию (36% идентичности) с транскрипционным белком-репрессором биосинтеза эктоина EctR из Mm. alcaliphilium 20Z (Mustakhimov et al., 2010). Анализ транслированной аминокислотной последовательности обнаруженной ОРС выявил поворот спираль поворот (НТН) мотив, характерный для белков регуляторов MarR семейства. Возможно, данный белок из M. marina участвует в регуляции транскрипции генов биосинтеза эктоина, по механизму, аналогичному у галотолерантного метанотрофа Mm. alcaliphilium 20Z (Mustakhimov et al., 2010).

Таким образом, в результате секвенирования ПЦР-фрагментов и анализа нуклеотидных последовательностей был получен фрагмент ДНК (3304 п.н.), в котором обнаружены ОРС, соответствующие генам ectA, ectB, ectC и ask. Поскольку расстояния между этими генами небольшие (18, 5 и 7 п.н., соответственно), можно предположить, что гены биосинтеза эктоина у M. marina транскрибируются в составе одной полицистронной матричной РНК.

Анализ транслированых полученных нуклеотидных последовательностей показал, что ген ectC кодирует полипептид из 131 аминокислотных остатков с рассчитанной молекулярной массой 14.8 кДа. Аминокислотная последовательность EctC оказалась на 40-64% идентичной последовательностям эктоинсинтаз из других галофильных бактерий. Ген ectB кодирует полипептид из 430 аминокислот с рассчитаной молекулярой массой 45.2 кДа и на 36-71% идентичен ДАБ-аминотрансферазам из галофильных бактерий. Ген ectA кодирует полипептид из 181 аминокислот с расчитанной молекулярной массой 20,2 кДа c идентичный на 23-63%.

Рис. 12. Филогенетическое дерево белков EctABC, основанное на сравнении транслированных аминокислотных последовательностей генов ectABC у метилотрофных (подчеркнуты) и гетеротрофных галофильных бактерий. Дерево построено методом минимальной эволюции. В скобках указаны номера соответствующих генов в полных геномах бактерий, представленных в базе данных.

Рис 13. Филогенетическое дерево аспартаткиназ, основанное на сравнении транслированных аминокислотных последовательностях ask-генов, расположенных в эктоиновом кластере метилотрофов (подчеркнуты), и ask-генов, сопряженных с кластером ectABC, у других галофильных бактерий.

5.3 Интеграция генов биосинтеза эктоина из M. marina в негалофильный штамм Methylobacterium extorquens AM1

Для интеграции генов биосинтеза эктоина из M. marina в хромосому Methylobacterium extorquens АМ1 был выбран вектор, мини-транспозон pBSL-180. Кассета для интеграции, входящая в состав pBSL-180, содержала конститутивный промотор метанолдегидрогеназы Pmax и ectABC гены. Данный вектор был сконструирован следующим образом. ПЦР-фрагмент, содержащий промоторную область Pmax, амплифицировали с плазмиды pCM-160, используя праймеры PmaxF-PmaxR, и клонировали по сайтам EcoRI и BamHI в pBSL-180 с образованием вектора pBSL/Pmax. ДНК-фрагмент, кодирующий гены биосинтеза эктоина ectABC, был амплифицирован из M. marina с использованием праймеров Ect-operC(hal) и Ect-operN(hal). ПЦР-фрагмент клонировали по сайтам рестрикции EcoRI и HindIII в плазмиду pBSL/Pmax c образованием pBSL/Pmax/ectABC размером около 9 т.п.н. ( Рис 14)

Рис. 14. Схема клонирования генов биосинтеза эктоина(ectABC) из M. marina под промотором метанолдегидрогеназы(Pmax) в мини-транспозон pBSL-180.

Конструкцию pBSL/Pmax/ectABC трансформировали в клетки E. coli S-17(גpir). Полученные трансформанты E. coli использовали для конъюгации в дикий штамм M. extorquens AM1. Трансформанты M. extorquens, содержащие плазмиду pBSL180/Pmax/ectABC, выращивали на агаризованой минеральной среде К с метанолом и канамицином.

Наличие интегрированной кассеты Pmax/ectABC в хромосоме M. extorquens AM1 оценивали ПЦР с праймерами PmaxF и ectArev на Pmax и ectA (Рис 15).

M

~700 п.н.

Рис.15 Электрофорез ПЦР продуктов генов Pmax и ectA с использованием праймеров:

PmaxF и ectARev, M - маркер “ Gene RuleTM 100bp DNA Ladder plus”.

Трансформанты M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) выращивали на среде К с канамицином, клетки собирали центрифугированием. Экстракцию эктоина из клеток метанолом проводили в течение 2 ч. В полученных метанольных экстрактах количество эктоина анализировали методом ВЭЖХ на хроматографе высокого давления Prominence, оснащенным детектором SPD-20A (Shimadzu, Япония).

В полученных трансформантах M. extorquens AM1 (Pmax/ectABC) был обнаружен эктоин в концентрации 75 мкг на 100 мг сухих клеток (Рис. 16с), что свидетельствует об экспрессии генов ectABC с промотора Pmax.

А)

Б)

С)

Рис. 16 Анализ накопления эктоина используя метод ВЭЖХ: а) контроль эктоина (“Sigma”), б) дикий штамм M. extorquens AM1, с) рекомбинантный штамм M. extorquens AM1.

Глава 6 Клонирование, очистка и первичная характеристика рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы

6.1 Клонирование и экспрессия генa ectА из M. marina

Для конструирования продуцента ДАБ-ацетилтрансферазы ген ectА клонировали в экспрессирующий вектор pET28, определяющий синтез рекомбинантного белка с дополнительными 6 His на С-конце. Полученной плазмидой pETectA трансформировали E. coli BL21(DE3). В растворимой фракции лизата клеток E. сoli, после индукции ИПТГ, методом денатурирующего гель-электрофореза в присутствии SDS обнаружен белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе около 20 кДа (Рис. 17), которая согласуется c рассчитанной на основе аминокислотной последовательности (18.88 кДа).

Рис. 17. Электрофорез в 12.5%-ном SDS-ПААГ: 1 - маркерные белки; 2 – ДАБ-ацетилтрансфераза

В контрольных клетках E. coli (выращенных без индуктора) соответствующая белковая полоса отсутствовала. Очистку белка проводили методом аффинной хроматографии на Ni²⁺-NTA агарозе. В результате был получен гомогенный препарат EctA-His₆-tag (Рис. 16). Электрофоретическая подвижность белка EctA из M. marina соответствует молекулярной массе около 20 кДа, которая согласуется c теоретически рассчитанным значением 20.0 кДа. При гель-фильтрации полученного препарата на Ultrogel AcA54 пик активности белков соответствовал молекулярной массе 40 кДа, что соответствует молекулярной массе гомодимерной формы данного фермента.

Физико-химические свойства ДАБ-ацетилтрансферазы. Температурный оптимум фермента составил +15°C (Рис. 18). Фермент активен в диапазоне рН от 7 до 9 с оптимумом при рН 8 (Рис. 19).

Рис.18 Зависимость активности ДАБ-ацетилтрансферазы от температуры.

Рис.19 Зависимость активности ДАБ-ацетилтрансферазы от pH.

Ранее ДАБ-ацетилтрансфераза была частично охарактеризована у H. elongata (Ono et al., 1999), Mm. alcaliphilum 20Z (Reshetnikov et al., 2006), M. alcalica и M. talassica (Mustakhimov et al., 2008). Необычно низкий температурный оптимум – около 15ºС является главной отличительной особенностью этого фермета у M. marina по сравнению с ДАБ-ацетилтрнсферазами из выделенными из Mm. alcaliphilum 20Z, M. thalassica и M. alcalica. Общим свойством ферментов из вышеперечисленных метилотрофов и M. marina является близкая электофоретическая подвижность, соответствующая ~20 кДа (табл. 6). Однако, по некоторым свойствам ДАБ-ацетилтрансфераза из M. marina отличается от ферментов из Mm. alcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica, имеющих максимальные активности при температурах, соответственно, 20, 35, 30°C и рН 9.5, 9.0 и 8.5.

Таблица 6. Свойства ДАБ-ацетилтрансфераз галофильных бактерий.

Как показал анализ транслированных аминокислотных последовательностей, из ферментов синтеза эктоина (EctA, EctB, EctC), EctA имеет наиболее высокую степень дивергенции (25-80%), что коррелирует с различиями в свойствах этого фермента. Это также свидетельствует о том, что в процессе длительной адаптации M. marina к соответствующим условиям среды обитания ферменты биосинтеза эктоина, возможно, подвергались «вертикальной» эволюции, адаптируясь к экофизиологическим особенностям вида.

Итак, данная работа существенно дополняет представления о разнообразии генов и ферментов биосинтеза эктоина, демонстрируя на примере аэробных метилотрофов, что, наряду с высокой консервативностью пути биосинтеза эктоина у разных галофильных бактерий имеются различия в организации есt-генов и свойствах кодируемых ими ферментов. Дальнейшее изучение пути биосинтеза эктоина у галофильных метилотрофных бактерий на биохимическом и генетическом уровнях перспективно в плане расширения и углубления теоретических представлений о механизмах галоадаптации, а также для разработки биотехнологического процесса получения этого мультифункционального биопротектора.

Выводы

1. Используя методологию ПЦР (включая инвертированную и векторетную ПЦР), у галотолерантной метилотрофной альфа-протеобактерии Methylarcula marina определены нуклеотидные последовательности генов ectA, ectB, ectC, ask и предполагаемого гена-регулятора ectR. Обнаружено, что гены синтеза эктоина у Methylarcula marina локализованы в четырехгенном опероне ectABC-ask.

2. Клонированием и экспрессией гена ectA из M. marina в Escherichia coli получен элетрофоретически гомогенный препарат рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы. Определены некоторые физико-химические свойства рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы. Фермент является гомодимером с м.м. субединицы 20 кДа и проявляет максимальную активность при температуре 15°C и рН 8.0 .

3. Показано, что рекомбинантный негалофильный метилотрофный штамм Methylobacterium extorquens AM1, трансформированный плазмидой, содержащей гены ectABC из M. marina, синтезирует эктоин (75 мкг в 100 мг сухих клеток).

Список литературы

1. Гальченко В.Ф., Абрамочкина Ф.Н., Безрукова Л.В., Соколов Е.Н., Иванов М.В. (1988) Видовой состав аэробной метанотрофной микрофлоры Черного моря. // Микробиология. 57(2):305-311.

2. Доронина Н.В., Краузова В.И., Троценко Ю.А. Methylophaga limanica - новый вид умеренно галофильных аэробных метилобактерий // Микробиология. 1997. Т. 66. № 4. С. 528-533.

3. Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Лысенко А.М., Троценко Ю.А. Новые метанотрофные изоляты из содовых озер Южного Забайкалья // Микробиология. 1999. Т. 68. № 5. С. 689-697.

4. Решетников А.С., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Обнаружение генов биосинтеза эктоина у галотолерантных аэробных метилотрофных бактерий // Доклады Академии Наук. 2004. Т. 396. №6. С. 831-834.

5. Решетников А.С. (2006) Синтез эктоина аэробными метилотрофными бактериями: биохимические и генетические аспекты. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. ИБФМ РАН, Пущино.

6. Хмеленина В.Н., Старостина Н.Г., Цветкова М.Г., Соколов А.П., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Метанотрофные бактерии соленых водоемов Украины и Тувы // Микробиология. 1996. Т. 65. № 5. С. 736-743.

7. Хмеленина В.Н., Сахаровский В.Г., Решетников А.С., Троценко Ю.А. Синтез органических осмопротекторов галофильными и алкалофильными метанотрофами // Микробиология. 2000. Т. 69. № 4. С. 465-470.

8. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Ли Ц.Д., Решетников А.С. Умеренно галоалкалофильные аэробные метилобактерии. Микробиология, 2007, Т. 76, №3, С. 293-305.

9. Bayles D.O. and Wilkinson B.J. (2000) Osmoprotectants and cryoprotectants for Listeria monocytogenes. // Letters Appl. Microbiol. 30:23–27

10. Bernard T., Jebbar M., Rassouli Y., Himidi-Kabbab S., Hamelin J., and Blanco C. (1993) Ectoine accumulation and osmotic regulation in Brevibacterium linens. // J. Gen. Microbiol. 139(1):129-136.

11. Boch J., Kempf B., and Bremer E. (1996) Synthesis of osmoprotectant glycine betaine in Bacillus subtilis: characterization of the gbsAB genes. // J. Bacteriol. 178(17):5121-5129.

12. Brown A.D. (1976) Microbial water stress. // Bacteriol. Rev. 40(4):803-846.

13. Bursy J., Pierik A.J., Pica N., and Bremer E. (2007) Osmotically induced synthesis of the compatible solute hydroxyectoine is mediated by an evolutionarily conserved ectoine hydroxylase. // J. Biol. Chem. 282(43):31147-31155.

14. Canovas D., Borges N., Vargas C., Ventosa A., Nieto J.J., and Santos H. (1999) Role of Ng-acetyldiaminobutyrate as an enzyme stabilizer and an intermediate in the biosynthesis of hydroxyectoine. // Appl. Environ. Microbiol. 65(9):3774-3779.

15. Canovas D., Vargas C., Calderon M.I., Ventosa A., and Nieto J.J. (1998) Characterization of the genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine in the moderately halophilic bacterium Halomonas elongata DSM 3043. // Syst. Appl. Microbiol. 21(4):487-497.

16. Canovas D., Vargas C., Iglesias-Guerra F., Csonka L.N., Rhodes D., Ventosa A., and Nieto J.J. (1997) Isolation and characterization of salt-sensitive mutants of the moderate halophile Halomonas elongata and cloning of the ectoine synthesis gene. // J. Biol. Chem. 272(41):25794-25801.

17. Canovas D., Vargas C., Kneip S., Moron M-J., Ventosa A., Bremer E., and Nieto J.J. (2000) Genes for the synthesis of the osmoprotectant glycine betaine from choline in the moderately halophilic bacterium Halomonas elongata DSM 3043. // Microbiology (UK) 146(2):455–463.

18. Cosquer A., Pichereau V., Pocard J., Minet J., Cormer M., and Bernard T. (1999) Nanomolar levels of dimethylsulfoniopropionate, dimethylsulfonioacetate, and glycine betaine are sufficient to confer osmoprotection to Escherichia coli. // Appl. Environ. Microbiol. 65(8):3304-3311.

19. D’Souza-Ault M.R., Smith L.T., and Smith G.M. (1993) Roles of N-acetylglutaminylglutamine amide and glycine betaine in adaptation of Pseudomonas aeruginosa to osmotic stress. // Appl. Environ. Microbiol. 59(2):473-478.

20. da Costa M.S., Santos H., and Galinski E.A. (1998) An overview of the role and diversity of compatible solutes in Bacteria and Archaea. // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 61:117-153.

21. de Zwart J.M.M., Nelisse P.N., and Kuenen J.G. (1996) Isolation and characterization of Methylophaga sulfidovorans sp.nov.: an obligately methylotrophic, aerobic, dimethylsulfide oxidizing bacterium from a microbial mat // FEMS Microbiol. Ecol. 20(3):261-270.

22. Desmarais D., Jablonski P.G., Fedarko N.S., and Roberts M.I. (1997) 2-sulfotrehalose, a novel osmolyte in haloalkaliphilic archaea. // J. Bacteriol. 179(10):3146-3153.

23. Desplats P., Folco E., and Salerno G.L. (2005) Sucrose may play an additional role to that of an osmolyte in Synechocystis sp. PCC 6803 salt-shocked cells. // Plant Physiol. Biochem. 43:133–138

24. Doronina N.V., Darmaeva T.D., and Trotsenko Y.A. (2003a) Methylophaga alcalica sp. nov., a novel alkaliphilic and moderately halophilic, obligately methylotrophic bacterium from an East Mongolian saline soda lake. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53(1):223-229.

25. Doronina N.V., Darmaeva T.D., and Trotsenko Y.A. (2003b) Methylophaga natronica sp. nov., a new alkaliphilic and moderately halophilic, restricted-facultatively methylotrophic bacterium from soda lake of the Southern Transbaikal region. // Syst. Appl. Microbiol. 26:382-389.

26. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., and Tourova T.P. (2000) Methylarcula marina gen. nov., sp. nov. and Methylarcula terricola sp. nov.: novel aerobic, moderately halophilic, facultatively methylotrophic bacteria from coastal saline environments. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50(5):1849-1859.

27. Empadinhas N., Albuquerque L., Costa J., Zinder S.H., Santos M.A.S., Santos H., and da Costa M.S. (2004) A gene from the mesophilic bacterium Dehalococcoides ethenogenes encodes a novel mannosylglycerate synthase. // J. Bacteriol. 186(13):4075-4084.

28. Felsenstein J. (2004) PHYLIP: Phylogeny inference Package Version 3.6.: University of Washington, Seattle.

29. Frings E., Kunte H.J., and Galinski E.A. (1993) Compatible solutes in representative of the genera Brevibacterium and Corynebacterium: occurrence of tetrahydropyrimidines and glutamine. // FEMS Microbiol. Lett. 109(1):25-32.

30. Galinski E.A. (1995) Osmoadaptation in bacteria. // Adv. Microb. Physiol. 37:273-328.

31. Galinski E.A. and Trüper H.G. (1994) Microbial behaviour in salt-stressed ecosystems. // FEMS Microbiol. Rev. 15(2-3):95-108.

32. Galinski E.A., Pfeiffer H.P., and Trüper H.G. (1985) 1,4,5,6,-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic acid, a novel cyclic acid from halophilic phototrophic bacteria of the genus Ectothiorhodospira. // Eur.J.Biochem. 149(1):135-139.

33. García-Estepa R., Argandona M., Reina-Bueno M., Capote N., Iglesias-Guerra F., Nieto J.J., and Vargas C. (2006) The ectD gene, which is involved in the synthesis of the compatible solute hydroxyectoine, is essential for thermoprotection of the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens. // J. Bacteriol. 188:3774-3784.

1. Oren A. (1999) Bioenergetic aspects of halophilism. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63(2):334-348.

2. Østerås M., Boncompagni E., Vincent N., Poggi M.-C., and Le Rudulier D. (1998) Presence of a gene encoding choline sulfatase in Sinorhizobium meliloti bet operon: choline-O-sulfate is metabolized into glycine betaine. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(19):11394-11399.

3. Page-Sharp M., Behm C.A., and Smith G.D. (1999) Involvement of the compatible solutes trehalose and sucrose in the response to salt stress of a cyanobacterial Scytonema species isolated from desert soils. // Biochem. Biophys. Acta. 1472(3):519-528.

4. Peter H., Weil B., Burkovski A., Krämer R., and Morbach S. (1998) Corynebacterium glutamicum is equipped with four secondary carriers for compatible solutes: identification, sequencing, and characterization of the proline/ectoine uptake system, ProP, and the ectoine/proline/glycine betaine carrier, EctP. // J. Bacteriol. 180(22):6005-6012.

5. Peters R., Galinski E.A. and Trüper H.G. (1990) The biosynthesis of ectoine. // FEMS Microbiol. Lett. 71(1-2):157-162.

6. Pflüger K., Baumann S., Gottschalk G., Lin W., Santos H., and Müller V. (2003) Lysine-2,3-aminomutase and β-lysine acetyltransferase genes of methanogenic archaea are salt induced and are essential for the biosynthesis of N^ε-acetyl-β-lysine and growth at high salinity. // Appl. Environ. Microbiol. 69(10):6047–6055.

7. Pichereau V., Pocard J.A., Hamelin J., Blanco C., and Bernard T. (1998) Differential effects of dimethylsulfoniopropionate, dimethylsulfonioacetate, and other S-methylated compounds on the growth of Sinorhizobium meliloti at low and high osmolarities. // Appl. Environ. Microbiol. 64:1420–1429.

8. Poolman B. and Glaasker E. (1998) Regulation of compatible solutes accumulation in bacteria. // Mol. Microbiol. 29(2):397-407.

9. Prabhu J., Schauwecker F., Grammel N., Keller U., and Bernhard M. (2004) Functional expression of the ectoine hydroxylase gene (thpD) from Streptomyces chrysomallus in Halomonas elongata. // Appl. Environ. Microbiol. 70(5):3130-3132.

10. Rao D.R., Hariharan K., and Vijayalakshmi K. R. (1969) A study of the metabolism of L-αγ-diaminobutyric acid in a Xanthomonas species. // J. Biochem. 114(1):107-115.

11. Reed R.H., Borowitzka L.J., Mackay M.A., Chudek J.A., Foster R., Warr S.R.C., Moore D.J., and Stewart W.D.P. (1986) Organic solute accumulation in osmotically stressed cyanobacteria. // FEMS Microbiol. Rev. 39(1-2):51-56.

12. Reed R.H., Richardson D.L., Warr S.R.C., and Stewart W.D.P. (1984) Carbohydrate accumulation and osmotic stress in cyanobacteria. // J. Gen. Microbiol. 130:1-4.

13. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., and Trotsenko Y.A. (2006) Characterization of the ectoine biosynthesis genes of haloalkalotolerant obligate methanotroph ‘‘Methylomicrobium alcaliphilum20Z’’// Arch. Microbiol. 184:286–297

14. Roberts M.F. (2004) Osmoadaptation and osmoregulation in archaea: update. // Front. Biosci. 9:1999-2019.

15. Roberts M.F. (2005) Organic compatible solutes of halotolerant and halophilic microorganisms.// Saline Systems. V1:5.

16. Santos H. and da Costa M.S. (2002) Compatible solutes of organisms that live in hot saline environments. // Environ. Microbiol. 4(9):501-509.

17. Severin J., Wohlfarth A., and Galinski E.A. (1992) The predominant role of recently discovered tetrahydropyrimidines for the osmoadaptation of halophilic eubacteria. // J. Gen. Microbiol. 138(8):1629-1638.

18. Sieburth J.N., Johnson P.W., Eberhardt M.A., Sieracki M.E., Lidstrom M.E., and Laux D. (1987) The first methane-oxidizing bacterium from the upper mixing layer of the deep ocean: Methylomonas pelagica sp.nov. // Curr. Microbiol. 14(5):285-293.

19. Silva Z., Borges N., Martins L.O., Wait R., da Costa M.S. and Santos H. (1999) Combined effect of the growth temperature and salinity of the medium on the accumulation of compatible solutes by Rhodothermus marinus and Rhodothermus obamensis. // Extremophiles. V3, №2. p.163-172.

20. Sleator R.D. and Hill C. (2001) Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence. // FEMS Microbiol. Rev. 26(1):49-71.

21. Smith L.T. and Smith G.M. (1989) An osmoregulated dipeptide in stressed Rhizobium meliloti. // J. Bacteriol. 171(9):4717-4717.

22. Smith L.T., Smith G.M., and Madkour M.A. (1990) Osmoregulation in Agrobacterium tumefaciens: accumulation of a novel disaccharide is controlled by osmotic strength and glycine betaine. // J. Bacteriol. 172(12):6849-6855.

23. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmaugin F., Higgins D.G. (1997) The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. // Nucleic Acids Res. V.25, №24. p.4876-4882.

24. Toney M.D., Hohenester E., Keller J.W., and Jansonius N. (1995) Structural and mechanistic analysis of two refined crystal structures of the pyridoxal phosphate-dependent enzyme dialkylglycine decarboxylase. // J. Mol. Biol. 245(2):151-179.

25. Trüper H.G. and Galinski E.A. (1986) Concentrated brines as habitats for microorganisms. // Experientia. 42:1182-1187.

26. Ventosa A. and Nieto J.J. (1995) Biotechological applications and potentialities of halophilic microorganisms. // World J. Microbiol. Biotechnol. 11(1):85-94.

27. Waditee R., Tanaka Y., Aoki K., Hibino T., Jikuya H., Takano J., Takabe T., and Takabe T. (2003) Isolation and functional characterization of N-methyltransferases that catalyze betaine synthesis from glycine in a halotolerant photosynthetic organism Aphanothece halophytica. // J. Biol. Chem. 278(7):4932-4942.

28. Welsh D.T. (2000) Ecological significance of compatible solute accumulation by micro-organisms: from single cells to global climate. // FEMS Microbiol. Rev. 24(3):263-290.

29. Wohlfarth A., Severin J., and Galinski E.A. (1990) The spectrum of compatible solutes in heterotrophic halophilic eubacteria of the family Halomonadaceae. // J. Gen. Microbiol. 136:705-712.

30. Zhao B., Lu W., Yang L., Zhang B., Wang L., and Yang S.S. (2006) Cloning and characterization of the genes for biosynthesis of the compatible solute ectoine in the moderately halophilic bacterium Halobacillus dabanensis D-8T // Curr. Microbiol. 53:183–188.

31. Zhilina T.N. and Zavarzin G.A. (1990) Extremely halophilic, methylotrophic, anaerobic bacteria. // FEMS Microbiol. Rev. 87(3-4):315-322.