Курсовая Изучение экологических особенностей биологического мониторинга Калужской области по стабильности
Работа добавлена на сайт bukvasha.net: 2015-10-25Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
Министерство образования Российской Федерации
Калужский государственный педагогический университет
им. К.Э. Циолковского
Тема:
Изучение экологических особенностей биологического мониторинга Калужской области по стабильности
развития берёзы повислой
ВВЕДЕНИЕ
В современной практике экологических обследований чрезвычайно редко встречаются случаи влияния на окружающую среду лишь одного действующего фактора. При этом хорошо известно, что различные воздействия могут: взаимно ослаблять действие друг друга, в разной степени обезвреживаться средой в процессе самоочищения, создавать новые, вторичные, факторы воздействия, усиливать воздействие друг друга на живые объекты (синэргетный эффект).
Следовательно, для объективного заключения о качестве среды, необходима интегральная характеристика ее состояния.
Именно живые организмы несут наибольшее количество информации об окружающей их среде обитания, и отклик у них формируется в ответ на весь комплекс присутствующих воздействий, а не на каждое из них в отдельности.
Реакция живого организма позволяет оценить антропогенное воздействие на среду обитания в показателях, имеющих биологический смысл. (Захаров, Крысанов, 1996). Видами–биоиндикаторами называют виды по наличию, состоянию или поведению которых судят об изменениях в окружающей среде или ее характерных особенностях (Бурдин, 1985).
Одним из перспективных подходов для интегральной биоиндикационной характеристики качества среды является оценка состояния живых организмов по стабильности развития (гомеостазу развития). Снижение эффективности данных механизмов приводит к появлению незначительных, ненаправленных отклонений от нормального строения различных морфологических признаков, обусловленных нарушениями развития. Оценить такие изменения можно на основании анализа уровня флуктуирующей асимметрии (Waddington, 1957; Van Valen, 1962; Астауров, 1978; Захаров, 1987; Струнников, 1991; Захаров, 2001).
Среди всех биоиндикаторов растения наиболее удобны, т.к. они - основные продуценты, находятся на границе двух сред - почвы и воздуха, ведут прикрепленный образ жизни, доступны и удобны в сборе материала. Для биоиндикационной характеристики больших территорий лучше использовать древесные растения, так как травянистые растения в большей степени отражают микробиотопические условия (Захаров др., 2000а).
В качестве объекта исследования в данной работе использовалась берёза повислая (Betula pendula Roth.). Этот вид достаточно давно и успешно используется как вид-биоиндикатор качества среды (Чистякова, 1997; Константинов, Стрельцов, 1999; Захаров и др., 2000а,б); массовый и распространенный; входит в состав разнообразных биотопов (экосистем), его ареал включает степные и лесостепные зоны в Скандинавии, в Средней и Атлантической Европе, в Средиземноморье, на Балканах, Западной Сибири и на Алтае. Поднимается до высоты 2100-2500м.; обладает четкими и удобно учитываемыми признаками (Чистякова, 1997).
Необходимо учитывать, что использование березы в качестве вида-биоиндикатора полностью отражает только комплекс факторов наземных экосистем. Хотя исследования в Калужской области (Стрельцов и др., 1998;Стрельцов и др, 2000б) и в г. Каланинграде (Московской обл.) (Барсук и др.,1996) обнаружили тесную взаимозависимость экологического состояния рек и прилегающих наземных участков, необходимо учитывать специфику обследования и оценки водной среды, выбирая другие виды индикаторов.
Однако, целый ряд вопросов использования березы как вида-биоиндикатора остается нераскрытым. Недостаточно сведений о нарушении стабильности развития на экологической периферии ареала. Не изучены закономерности пространственного площадного распределения коэффициента асимметрии этого вида. Работы в этом направлении крайне малочисленны, особенно с использованием ГИС-технологий.
Учитывая, что биологическая система любого уровня организации является динамичной структурой во времени, а проведение биоиндикационных исследований позволяет провести лишь рекогносцировочную оценку, отражающую ситуацию в конкретный отрезок времени, то важное теоретическое и практическое значение имеют периодические наблюдения за изменением качества природной среды (биомониторинговые наблюдения) с оценкой именно биологических параметров. (Николаевский, 1981; Бурдин, 1985).
Биологический мониторинг, с точки зрения методологии, играет главенствующую роль среди всех типов экологического мониторинга, т.к. возникновение самой биосферы на Земле, ее развитие, устойчивость, возможность продолжения цивилизации зависят от деятельности биоты. В.И. Вернадский (1967)в учении о биосфере обосновал важное для мониторинга положение о том, что биота в процессе жизнедеятельности создает те биогеохимические круговороты материи и превращения энергии, благодаря которым обеспечиваются, с одной стороны, необходимые условия для жизни, с другой - автоматизм работы систем саморегуляции биосферы, обеспечивающих в конечном счете поддержание условий для продолжения жизни на Земле.
Крайне интересным и перспективным методом интерпретации биоиндикационных данных является применение ГИС-технологий. Работы в этом направлении крайне малочисленны, и тем более это относится к работам с использованием березы повислой (Шестакова и др., 1998; Шпынов, 1998; Емельянова, 2000; Стрельцов и др., 2001).
Актуальностью данных вопросов определена цель дипломной работы: используя биоиндикационный метод оценить качество среды территории Калужской области.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
1. Провести биомониторинг территории Калужской области по стабильности развития Березы повислой.
2. На основе полученных результатов оценить качество окружающей среды.
3. Выявить тенденции по изменению качества окружающей среды.
Актуальность темы
Рост численности населения и развитие техносферы существенно расширили область взаимодействия человека и природы. Действуя, не считаясь с законами живой природы и нарушая экологическое равновесие для удовлетворения своих потребностей, человечество, в конечном итоге, поставило себя в еще большую зависимость от состояния окружающей среды. Для выживания и дальнейшего развития человечества необходимы изучение Земли как целостной системы и формирование банка данных и знаний о процессах и элементах природной среды и общества в широком спектре их взаимодействия, анализ, оценка и прогнозирование динамики явлений и процессов, происходящих в окружающем мире с целью принятия экологически грамотных решений в сфере взаимодействия природы и общества (Экоинформатика, 1992).
В последние годы биологическая наука начинает занимать важное место в системе представлений о мониторинге состояния окружающей среды (Бурдин, 1985). Многие разделы биологии, и в первую очередь экология и физиология, используются для разработки теоретических и практических основ наблюдения за состоянием биологической компоненты окружающей среды. Усилия представителей разных биологических специальностей направлены на разработку организационных, пространственных и временных связей главных подсистем структуры биологического мониторинга как части единой информационно-оперативной службы управления качеством окружающей среды.
Наиболее успешно биологический мониторинг развивается в рамках двух тесно связанных направлений – диагностического и прогностического. В соответствии с целями и задачами биологического мониторинга сбор данных об уровне загрязнения биоты входит в компетенцию диагностического мониторинга, а все экспериментальные исследования осуществляются в рамках прогностического мониторинга.
Функциями мониторинга являются (Бурдин, 1985; с изменениями):
| | Мониторинг состояния окружающей среды | | |||||
| функции внутри системы | |||||||
| задачи | цели | ||||||
| наблюде-ние | выявление | анализ | модели-рование | оценка | прогноз | ||
| за состоянием окружающей среды | изменений окружа-ющей среды, свя-занных с деятель-ностью человека | наблюю-даемых измене-ний | изменений экологи-ческой ситуации | состояния окружа-ющей среды | предполагаемых изменений сос-тояния окружа-ющей среды | ||
Из двух указанных целей мониторинга «оценка» является основой для принятия тактических (оперативных) решений, «прогноз» – для принятия стратегических (долговременных). Оба вида мониторинга имеют самостоятельное значение и на ранних этапах внедрения могут существовать независимо. Однако только при взаимном дополнении данных, полученных при диагностическом и прогностическом мониторингах, может быть осуществлена полноценная программа мониторинга загрязнения среды.
Для обнаружения относительного уровня загрязнения среды в рамках диагноза используют организмы-биоиндикаторы, к которым предъявляется ряд требований. Главной задачей этого вида мониторинга является измерение уровня загрязнения биоты выбранного региона с определенной периодичностью. Экспериментальную основу прогностического мониторинга составляет биотестирование, с помощью которого определяются скорости накопления загрязняющих веществ, а также их выведения и деградации.
Основу биологического мониторинга составляют наблюдение, оценка и прогноз состояния биотической составляющей биосферы, затронутой и незатронутой антропогенной деятельностью.
Можно утверждать, что на стыках ряда наук – биологии, геофизики, географии и др. – родилось новое научное направление, которое не может целиком принадлежать лишь одной из традиционных дисциплин.
Дальнейшее развитие теоретических и методологических вопросов мониторинга диктуется необходимостью существенно повысить уровень практической значимости результатов, получаемых в процессе реализации программ мониторинга. Особенно это относится к таким разделам, как биологический, экологический и фоновый мониторинг.
Мониторинг антропогенных изменений лежит в основе наблюдений, оценки и прогноза состояния преобразованной и искусственной окружающей среды, равно как и фоновый мониторинг, с помощью которого осуществляется наблюдение и оценка фонового состояния биосферы, прогноз и выявление тенденций изменения этого состояния (Захаров, 1999).
Особую актуальность данной теме придает то, что пространственный анализ по интегральным показателям с последующей картографической оценкой параметров здоровья среды, пока очень редко применялся. Известно всего несколько публикаций на эту тему.
Глава 1. Флуктуирующая асимметрия как биоиндикационный параметр
Ввиду того, что цель работы - изучение особенностей показателя флуктуирующей асимметрии листовой пластинки березы повислой Betula pendula Roth. и возможностей его использования для биоиндикационной оценки качества среды изучаемой территории, в данной главе представляется необходимым рассмотреть следующие вопросы:
1. Явление флуктуирующей асимметрии как один из типов асимметрии;
2. Использование анализа флуктуирующей асимметрии для целей биоиндикации;
3. Использование анализа флуктуирующей асимметрии листовой пластинки березы повислой Betula pendula Roth. для целей биоиндикации.
Необходимо отметить, что основные положения теории флуктуирующей асимметрии разрабатывались с использованием в большей части зоологического материала. Работы с ботаническими объектами крайне малочисленны и основная их часть появилась за последние несколько лет.
1.1. Явление флуктуирующей асимметрии как один из типов асимметрии
1.1.1.
Флуктуирующая асимметрия и различные типы асимметрии
Явление симметрии в природе, как вид согласованности отдельных частей, который объединяет их в единое целое – одно из наиболее общих явлений, свойственное неживой и живой материи на разных уровнях организации
(Вейль, 1968). Анализу этого явления в живом мире посвящено большое количество работ, затрагивающих разные аспекты: философский (Урманцев, 1974;Готт, Хоменко, 1977; Никонов, 1977; Петухов, 1981, Толстопятенко, 1993,1994), общебиологический (Ludwig, 1932; Гаузе, 1940; Касинов, 1973; Neville, 1976), конкретные проявления у различных организмов (Danforth, 1924; Colyer, 1951; Yamaguchi, 1977; Vermeij, 1977; Dunham, 1981; Govind, 1984) и т.д.
Ввиду того, что данная работа посвящена анализу листовой пластинки березы повислой Betula pendula Roth., ограничим рассмотрение симметрии билатеральным типом этого явления, характерным для подавляющего большинства листовых пластинок растений (Урманцев, 1960; Урманцев, 1961). Подобная ограниченность форм симметрии листьев растений ярко демонстрирует принцип сформулированный П.Кюри: рост наклонно и по горизонтали порождает единственную плоскость симметрии (Curie, 1908).
Ввиду различных причин (эволюционные приспособления, особенности онтогенетического развития) в строении живых тел возникают различные отклонения от строгой билатеральной симметрии – называемые асимметрией.
Наиболее распространенной и часто используемой в настоящее время является классификация Ван Валена (Van Valen, 1962), предложившего все многообразие проявлений асимметрии разделить на три основных типа:
1. Направленная асимметрия – при этом типе в норме какая-либо структура развита больше на одной стороне, причем сторона проявления генетически строго детерминирована. Подобный тип асимметрии, как правило, является результатом приспособлений, выработанных в ходе филогенеза: сердце млекопитающих, размер клешней у некоторых видов крабов, строение тела камбалообразных, из растений – листовые пластинки бегоний, липы (Boycott et al., 1930; Bantock et al., 1973;Dunham, 1981; Policansky, 1982).
2. Антисимметрия – при данном типе асимметрии отмечается отрицательная связь проявления признака на разных сторонах билатеральной структуры – признак проявляется только на правой или только на левой стороне, причем, генетически обусловлен сам факт различий, а не сторона проявления. Данное явление отмечено у некоторых видов брюхоногих моллюсков, гетерохелия у ряда видов крабов (Przibram, 1911; Bond, 1920; Dahlberg, 1943).
3. Флуктуирующая асимметрия – этот тип асимметрии есть следствие несовершенства онтогенетических процессов (Ludwig, 1932). Это незначительные, ненаправленные отклонения от строгой билатеральной симметрии.
1.2. Характеристика флуктуирующей асимметрии как общебиологического явления
1.2.1. Характерные черты флуктуирующей асимметрии
Флуктуирующая асимметрия крайне широко распространенное явление.
Им охвачены практически все билатеральные структуры у самых разных живых существ. Понятно, что не возможно подвергнуть анализу известные признаки всех билатерально - симметричных структур, но у исследованных флуктуирующая асимметрия регистрировалась (Захаров, 1987). Более того, это явление имеет место даже при иных типах асимметрии, в этом случае она представляет собой отклонения не от строгой симметрии, а от определенной средней симметрии.
По форме выражения она представляет собой незначительные отклонения от строгой билатеральной симметрии, а наблюдаемые отклонения, скорее могут быть отнесены к случайным нарушениям развития, чем к направленным изменениям. Соответственно, эти незначительные отклонения не несут функциональной значимости, и находятся в пределах определенного люфта, допускаемого естественным отбором.
Флуктуирующая асимметрия есть проявление внутрииндивидуальной изменчивости, т.е. характеризует различия между гомологичными структурами внутри одного индивида. Подобный тип изменчивости широко распространен у растений, где в пределах одного индивида, можно провести разносторонний анализ метамерных структур, например листьев (они наиболее часто используются для этих целей)(Семериков, Глотов, 1971; Глотов и др., 1975; Семериков, 1975). Но важно отметить, что если уровень флуктуирующей асимметрии является характеристикой индивидуума, а значит, можно оценивать различие разных групп особей по среднему уровню различий между сторонами, то данное явление (флуктуирующая асимметрия) может рассматриваться и с позиции надиндивидуальной (популяционной) изменчивости.
С позиций изменчивости как способности к изменению, наблюдаемое при флуктуирующей асимметрии несходство проявления признака между сторонами, не может быть объяснено ни генотипическими, ни средовыми различиями.
Это есть результат случайной изменчивости развития. Представления об этом виде изменчивости были впервые сформулированы Б.Л. Астауровым (Астауров, 1927; Astauroff, 1930), а далее развиты в ряде работ (Mather, 1953; Thoday,1958; Reeve, 1960). Само выявление этой формы изменчивости связано, в первую очередь, с исследованием именно флуктуирующей асимметрии.
Рассматривая основные черты флуктуирующей асимметрии, можно выделить три основные особенности (по различиям между двумя сторонами тела):
незначительность – определяется природой этого явления (случайная изменчивость развития), а значит, если эти различия случайны, то они должны быть незначительны. Возникающие существенные различия между сторонами, обычно элиминируются отбором. Если этого не происходит, а появление этих различий постоянно, то можно говорить об их адаптивном характере, и они не могут быть случайны.
ненаправленность – также следствие причин, описанных в предыдущем абзаце. Эта черта свидетельствует о взаимогашении случайных разнонаправленных различий между сторонами у отдельных особей. В пользу этого свидетельствует факт безуспешной попытки ведения отбора на направленность асимметрии у признаков с флуктуирующей асимметрией проявления на примере Drosophila melanogaster (Левотин, 1978).
независимость проявления – исходя из случайности нарушений развития признака, зависимость в появлении различий слева или справа должна отсутствовать. Это неизменно имеет место, если все фенотипическое разнообразие в рассматриваемой группе особей является следствием случайных нарушений развития, в достаточно однородных, с точки зрения генотипа и среды, условиях (Астауров, 1927,1930). Анализ таких гетерогенных группировок, как природные популяции, выявил наличие всех переходов от сильной положительной связи между сторонами до ее полного отсутствия или слабой отрицательной, что является вполне естественным при флуктуирующей асимметрии, так как в общее фенотипическое разнообразие исследуемых признаков происходит вклад других форм изменчивости (Guthrie, 1925; Plunkett, 1926; Timofeeff–Ressovsky,1934; Zakharov, 1981).
1.2.2. Влияние различных факторов на уровень флуктуирующей асимметрии
Несмотря на отсутствие генетической детерминированности различий
между левой и правой стороной при флуктуирующей асимметрии, выявлена ее чувствительность к общей коадаптированности генома. В эксперименте, при разных типах скрещиваний выявлено, что при близкородственном скрещивании и при отдаленной гибридизации величина флуктуирующей асимметрии возрастает. Если при инбридинге это следствие перехода многих локусов в гомозиготное состояние (Mather, 1953; Lewontin, 1956, 1958), то при скрещивании разных форм, имеют значение межгенные взаимодействия (Dobzhansky, 1950;Dobzhansky, Levene, 1955). Также нарушение общей коадаптированности генома отмечено при накоплении генетических дефектов при таких заболеваниях человека, как заячья губа, волчья пасть, синдром Дауна (Sofaer, 1979; Barden,1980). Анализ разных генетически детерминированных морф в природной популяции показал их равноценность по уровню флуктуирующей асимметрии, за исключением тех случаев, когда морфа имеет гибридное происхождение, что также вызывает нарушение коадаптированности генома (Зюганов, 1978; Захаров, Зюганов, 1980).
Выяснение влияния уровня гетерозиготности популяции на уровень флуктуирующей асимметрии показало, что определяющей оказывается не гетерозиготность как таковая по всем локусам, а по тем из них, которые связаны с какой-либо характеристикой (например, быстрым и медленным ростом) опосредованно влияющей на асимметричность (Leary et al., 1983, 1984; Рубан, Захаров, 1984).
Зависимость рассматриваемого показателя от средовых воздействий, говорит о том, что забуференность развития действительна лишь в определенном диапазоне условий и оказывается менее действенной в необычных условиях среды. В серии работ, выполненных на растениях, было показано, что если общая стабильность развития контролируется генотипом, то сами по себе различия между левой и правой половинами листа ненаправлены и независимы, и их нельзя свести ни к генотипическим, ни к средовым различиям (Jinks, Mather, 1955; Kojima et al., 1955; Paxman, 1956; Sueoka, Mukai, 1956; Roy, 1963; Sakai, Shimamoto, 1965a,b; Graham et. al., 1993; Freeman et al., 1994).
Влияние половых различий на уровень флуктуирующей асимметрии не выявлено, даже на фоне существенных половых различий по анализируемым признакам (Staley, Green, 1971; Zakharov, 1981; Leary et al., 1983; Pankakoski, 1985).
Анализ медленно и быстрорастущих группировок особей в популяциях (Поляков, 1975; Mitton, Grant, 1984) выявил существенное различие между ними по уровню флуктуирующей асимметрии. Более высокий уровень асимметрии у медленно растущих индивидуумов, можно рассматривать как следствие пониженной стабильности развития по сравнению с быстро растущими (Рубан, Захаров, 1984).
Популяционная динамика данного показателя во времени (различия между поколениями) оказалась зависимой от стабильности изменений численности особей. У видов с небольшими скачками численности от поколения к поколению показатель флуктуирующей асимметрии является весьма стабильной популяционной характеристикой (при условии, что разные поколения развиваются в неизменных условиях) (Mason et al., 1967; Fox, 1975; Zakharov, 1981). Иная ситуация у видов, численность которых значительно изменяется в течение популяционных циклов. Исследования, проведенные на обыкновенной бурозубке, (Sorex araneus) (динамика численности которой подвержена четкому четырехлетнему циклу, и максимально достигает 70-кратного размера (Шефтель, 1983))показали увеличение уровня флуктуирующей асимметрии у особей, родившихся в год максимальной численности, и уменьшение асимметричности у их потомков при спаде численности (Захаров и др., 1984).
Индивидуальное развитие организма обеспечивается сложным регуляторным аппаратом, «защищающим нормальное формообразование от возможных нарушений, как со стороны уклонений во внутренних факторах, так и со стороны изменений в факторах внешней среды» (Шмальгаузен 1982). Раскрытию механизмов этого регуляторного аппарата и формам его фенотипического проявления посвящен ряд работ (Waddington, 1940, 1942, 1953, 1957; Шмальгаузен, 1940, 1968). Данный механизм фигурирует под несколькими синонимичными названиями: стабильность развития, гомеостаз развития, гомеорез (стабилизированный поток). Т.е., подразумевается, что развитие проходит по определенному пути (креоду), и при высокой стабильности, развитие канализировано, т.е. за счет буферных механизмов протекает одинаково, несмотря на некоторые генетические и средовые воздействия. Переключение развития на другой креод происходит при достижении порогового уровня генотипического или средового воздействия.
Основными показателями стабильности развития являются нарушения развития и онтогенетический шум. Если собственно нарушения развития, фенодевианты, представляющие собой существенные изменения морфологии, обычно встречаются в природных популяциях с частотой не выше нескольких процентов, то онтогенетический шум оказывается операциональным критерием оценки в природных популяциях (Захаров, 1987). Онтогенетический шум (Waddington, 1957), случайная спонтанная изменчивость развития (Астауров,1978) или реализационная изменчивость (Струнников, 1991) наиболее четко и просто может быть оценен по флуктуирующей асимметрии билатеральных структур. Преимущество подхода состоит в том, что при этом известна заданная норма, т.е. то, что должно быть при отсутствии воздействий, - симметрия, отклонения от которой в ходе развития и представляют собой онтогенетический шум (Захаров, 2001).
1.2. Практические использование флуктуирующей асимметрии
для целей биоиндикации
1.2.1. Возможность использования флуктуирующей асимметрии как параметра биоиндикации
Анализ флуктуирующей асимметрии, как показателя одной из наиболее общих характеристик индивидуального развития, крайне перспективный биоиндикационный метод. Принципиальным преимуществом такого онтогенетического подхода является возможность выявления изменений состояния организма при разных видах загрязнения, когда ни по показателям биоразнообразия (на уровне сообществ), ни по популяционным показателям изменения обычно не наблюдаются (Захаров, Крысанов, 1996а).
Несмотря на то, что при оценке уровня флуктуирующей асимметрии данный подход использует ограниченное число морфологических признаков, это можно считать вполне оправданным, т.к. нарушение стабильности развития проявляется в асимметричности различных, даже не скоррелированных между собой признаков (Захаров, 1987). Эта особенность позволяет ограничиться анализом лишь признаков морфологии, что особенно важно в условиях заповедников.
Важной характеристикой данного метода, подчеркивающей его универсальность, является возможность его использования в отношении представителей разных групп живых существ, т.к. причинная обусловленность различий в значении признаков на двух сторонах тела при флуктуирующей асимметрии оказывается принципиально сходной в отношении различных морфологических структур у самых разных видов.
Правда, такая универсальность в выборе объекта не исключает воздействия различных биологических особенностей вида-биоиндикатора на исследуемый показатель, которые необходимо учитывать для получения корректных результатов, отражающих влияние исследуемого воздействия.
Например, необходимо учитывать гибридогенное происхождение вида-индикатора, что сказывается на коадаптированности генома и снижает стабилизированность развития (Зюганов, 1978; Sofaer, 1979; Barden, 1980; Захаров,Зюганов, 1980).
Исследуемая территория не должна совпадать с географической или экологической периферией ареала. Снижение стабильности развития является индикатором ухудшения состояния организма в этих условиях. Например, при исследовании прыткой ящерицы (Lacerta agilis) нарушение стабильности развития было обнаружено на южной периферии ареала (Захаров, 1987). Важно отметить, что условия экологической периферии ареала могут возникать в разных частях ареала и в силу естественных причин. Особенно ярко это проявляется у растений. Например, для березы повислой (Betula pendula) было показано, что в затененных условиях стабильность развития существенно ниже, чем на освещенных участках (Чистякова, 199
В некоторых случаях существенным является принадлежность исследуемых особей к разным возрастным группам. Например, существует достаточно сложная связь между календарным возрастом, процессами роста и морфогенеза в постнатальный период, которая должна учитываться при анализе выборок из природных популяций (Шварц, 1980; Zakharov, 1992). Так у полевок ситуация осложняется различиями в скоростях роста зверьков разных когорт и функционально-физиологических группировок (Оленев, 1991). В ряде работ, отмечено уменьшение уровня флуктуирующей асимметрии с возрастом у лабораторных мышей и крыс (Siegel et al., 1977; Parker, Leamy, 1991), красной полевки (Васильев и др., 1996), хлопкового хомяка и белохвостого оленя (Novak et al.,1993), косули (Markowski, 1993). С другой стороны, флуктуирующая асимметрия одонтометрических признаков по мере старения животных может возрастать (Suchentrunk, 1993). А вот у растений, на примере березы повислой (Betula pendula), различия между возрастными состояниями по уровню флуктуирующей асимметрии в одном местообитании оказались статистически незначимы(Глотов и др., 2001).
В работах на мышевидных грызунах отмечается также разница в «работоспособности» различных признаков. Состояние природных популяций, подвергающихся антропогенным воздействиям, чаще и успешнее оценивают с помощью неметрических признаков (Parsons, 1992; Захаров, Кларк, 1993), в то время как теоретическому анализу феномена флуктуирующей асимметрии в лабораторных условиях обычно подвергаются мерные показатели (Palmer, 1994).
1.2.2. Применение оценки уровня флуктуирующей асимметрии как индикатора различных антропогенных воздействий
1.2.2.1. Оценка воздействия антропогенных факторов на стабильность развития одного или нескольких близких видов-индикаторов
К настоящему моменту накоплено много данных, убедительно доказывающих чувствительность уровня флуктуирующей асимметрии к различным по происхождению антропогенным воздействиям.
Одни из самых первых сведений о чувствительности флуктуирующей асимметрии к химическому загрязнению антропогенного происхождения были получены Валентайном с соавторами (Valentine et al., 1973). Ими анализировались три вида рыб (Paralabrax nedulifer, Leuresthes tenuis, Amphistichus argenteus) из разных семейств обитающих вдоль Калифорнийского побережья.
Выборки были взяты для временного и пространственного анализа. В ходе работы выявлено, увеличение асимметрии у южных берегов Калифорнии, наиболее густо населенного и промышленно развитого района, характеризующегося повышенным уровнем загрязнения среды различными токсикантами. Временной анализ показал большую асимметричность у молодых особей, чем у более старших, что также согласуется с данными о динамике загрязнения. Несмотря на то, что, по мнению самого автора, полученные данные необходимо рассматривать как ориентировочные, в дальнейшем в экспериментальных исследованиях была продемонстрирована четкая зависимость возрастания уровня флуктуирующей асимметрии у рыб при повышении концентрации ДДТ (Valentine,Soule, 1973).
Сравнение выборок большеротого американского черного окуня (Micropterus salmoides) из различных водоемов Южной Каролины показало, что максимальные значения асимметрии характеризуют выборку рыб из водоема, имеющего высокий уровень загрязнения ртутью (Ames et al., 1979).
У трехиглой колюшки (Gasterosteus aculeatus) проводилось сравнение асимметрии числа боковых пластин из двух рек в Латвии. Эти реки расположены недалеко друг от друга и представляют водоемы одного типа, но в одну из них производится сток вод целлюлозно-бумажного комбината. Полученные результаты свидетельствуют о многократном возрастании асимметрии в загрязненном водоеме (Захаров, 1981б).
В другой работе было проведено сравнение выборок из одной и той же популяции до и после начала интенсивного антропогенного воздействия на примере серого тюленя (Halichoerus grypus) Балтийского моря. Были исследованы коллекционные черепа до 1940 года и после 1960 года. По данным шведских исследователей, интенсивное загрязнение Балтийского моря у побережья Швеции началось в 50-х – 60-х годах, что привело к резкому возрастанию уровня таких поллютантов, как ДДТ и ПХБ в теле балтийских тюленей после
Позже в лабораторных условиях произведена оценка воздействия полихлорбифенилов на американских норок Mustela vison (Borisov et al.1997). Если в контроле стабильность развития у мертворожденных норок была существенно ниже (высокая асимметрия), чем у живорожденных, то в опыте при интоксикации, и те и другие имели сходный уровень нарушений развития. Таким образом, нарушение стабильности развития имеет место при ухудшении состояния организма в силу различных причин, но не является причиной его гибели.
Однако, вероятно успех планируемого исследования может зависеть от вида-биоиндикатора, адекватно отражающего индицируемый вид воздействия.
Так у двух видов грызунов из загрязненного нефтеотходами района Техаса, уровень флуктуирующей асимметрии морфометрических показателей не отличался значимо от контроля (Owen, McBee, 1990).
Крайне интересны работы, посвященные индицированию радиоактивного загрязнения. Например, проводилось изучение флуктуирующей асимметрии восьми краниометрических признаков у восточноевропейских полевок из двух естностей, находящихся в зоне влияния Тоцкого радиоактивного следа, и контрольной популяции. Среднепопуляционные обобщенные показатели были остоверно выше в импактных популяциях, чем в контрольной. Вероятно, нарушения онтогенетического гомеостаза у полевок из зоны радиоактивного следа являются результатом загрязнения радионуклидами (в первую очередь, плутонием), которое привело к облучению многих поколений полевок в течение более чем 40 лет. Полученные результаты дают новые основания для использования флуктуирующей асимметрии мерных признаков млекопитающих в качестве индикатора антропогенного воздействия (Гилева, Нохрин, 2001).
В ряде работ предпринималась попытка индицирования комплексной антропогенной нагрузки без выделения ведущего фактора (Чистякова, 1996а;
Венгеров, 1997; Константинов, 1997; Чубинишвили, 1998; Мокров, Гелашвили, 1999; Захаров, 2000б; Устюжанина, Стрельцов, 2001). Например, сравнивались выборки домового воробья (Passer domesticus), собранных в двух точках: центральная усадьба Воронежского заповедника и в Коминтерновском районе города Воронежа (близость крупных предприятий, магистраль с интенсивным движением автотранспорта). В результате, показатель флуктуирующей асимметрии во второй выборке оказался значительно выше по сравнению с заповедником на достоверном уровне. (Венгеров, 1997).
1.2.2.2. Комплексный подход к оценке воздействия антропогенных факторов на стабильность развития живых организмов различных систематических групп
Как уже отмечалось, причинная обусловленность различий в значении признаков на двух сторонах тела при флуктуирующей асимметрии оказывается принципиально сходной в отношении различных морфологических структур у самых разных видов. Эта характеристика данного метода, подчеркивающая его универсальность, предоставляет возможность его использования в отношении представителей разных групп живых существ. С этих позиций были бы крайне интересны данные о реакции на один тип воздействия различных видов в природных популяциях. Данной задачей была объединена серия работ по изучению различных антропогенных воздействий (химическое загрязнение, ионизирующее и неионизирующее радиационное загрязнение, комплексное антропогенное воздействие) на стабильность развития нескольких видов-биоиндикаторов (Захаров и др., 2000б). Данные исследования проводились в семи административных областях России, где получена сходная картина изменения стабильности развития в зависимости от степени воздействия какого-либо антропогенного фактора.
Например, при рассмотрении результатов оценки воздействия Новгородского производственного объединения «Азот» на уровень стабильности развития живых организмов точки отбора биоиндикационных проб учитывали воздействие предприятия, производящего атмосферные выбросы, сброс биологически очищенных сточных вод и условно чистых стоков в р.Волхов.
При оценке наземных экосистем использовались 4 вида растений: карагана древовидная (Caragana arborescens), клен остролистный (Acer platanoides), сныть обыкновенная (Aegopodium podagraria), кипрей узколистный (Epilobium angustifolium); 2 вида беспозвоночных: обыкновенная златоглазка (Chrysopa peria); черный садовый муравей (Lasius niger); 5 видов мелких млекопитающих: мышь-малютка (Micromys minutus), рыжая полевка (Clethrionomys glareolus), малая мышь (Apodemus uralensis), полевая мышь (Apodemus agrarius), обыкновенная бурозубка (Sorex araneus).
При оценке водных экосистем использовались: стрекоза-стрелка (Coenagrion puella), золотой карась (Carassius carassius), травяная лягушка (Rana temporaria).
Несмотря на существенные систематические различия между исследованными видами, принадлежность к разным трофическим уровням, жизненным стратегиям, особенности миграционной активности и т.д., обнаруженный эффект улучшения стабильности развития при отдалении от предприятия прослеживается у всех проанализированных биологических объектов по подавляющему большинству использованных параметров.
1.2.2.3. Площадная оценка территорий по уровню флуктуирующей асимметрии с использованием ГИС-технологий
Новым, интересным и крайне важным подходом в исследованиях, включающих большие массивы информации, является применение географических информационных систем – ГИС (Коновалова, Капралов, 1997). Ряд исследовательских работ экологического направления выполнен с использованием ГИС технологий. (Васин, 1993; Сергеев и др., 1998; Шестакова и др., 1998; Шпынов,1998; Емельянова, 2000; Стрельцов и др., 2001).
Площадной анализ территорий по уровню флуктуирующей асимметрии, позволяет выделить участки с нарушением стабильности развития живых организмов, а значит территории с ухудшением качества среды. Подобный подход дает ряд преимуществ, в частности позволяет произвести экологическое районирование территории (Шпынов, 1998). Такая работа проведена на территориях г. Калуги, Калужской области, г. Калиниграда, г.Дубны (Барсук, 1996; Стрельцов, Шпынов, 1998; Стрельцов и др., 1997 а, б, в; 1998; 1999 а, б; 2000 а,б).
Интересные данные получены при проведении сравнительной биоиндикационной оценки городской среды по состоянию здоровья детей (учет экопатологий) и оценке стабильности развития растений (8 видов травянистых и древесных растений) с использованием ГИС-технологий. В ходе работы выявлены сходные временные и пространственные тенденции к улучшению стабильности развития растительных организмов и снижению детской заболеваемости (Емельянова, 2000; Стрельцов и др., 2001).
1.2.3. Сравнение оценки стабильности развития живых организмов по уровню флуктуирующей асимметрии и другими методами
Исходя из теории флуктуирующей асимметрии, получаемая характеристика морфогенетических процессов, как отражение общего состояния организма, должна коррелировать с другими показателями гомеостаза развития (иммунологическими, цитогенетическими и физиологическими). Подобные работы были проведены в зоне радиоактивного следа после катастрофы на Чернобыльской АЭС на территории Брянской области (Захаров, Крысанов, 1996 б).
Для проведения исследования были выбраны семь площадок с нарастающим уровнем радиационного загрязнения с плотностью загрязнения 137Cs от 0,25 до 32,49 Ки/км2 и .-фоном от 15 до 220 мкР/ч. Исследования проводились с привлечением нескольких видов из разных систематических групп: растения, рыбы, земноводные, мелкие млекопитающие.
Растения. Исследования проводились на березе повислой (Betula pendula Roth.), подробно результаты по этому виду будут рассмотрены ниже, в специальном разделе, так как они представляют особый интерес для настоящего исследования.
Рыбы. Анализу подвергались два вида: золотой крась (Carassius carassius) и серебряный карась (Carassius auratus). Анализ стабильности развития, проводившийся по уровню флуктуирующей асимметрии и частоте фенодевиантов пяти меристических признаков, показал возрастание уровня асимметрии и числа существенных отклонений от нормы в строении различных морфологических структур в водоемах с повышенным загрязнением (Захаров и др., 1996).
Земноводные. Для анализа использовались лягушки гибридного комплекса Rana
esculenta
(R
.
lessonae
,
R
.
esculenta). Оценка уровня флуктуирующей асимметрии, проводившейся по 13 признакам, свидетельствует о существенном нарушении стабильности развития лягушек в точке повышенного радиационного загрязнения (Чубинишвили и др., 1996а). Оценка у исследуемых особей цитогенетического гомеостаза показала увеличение уровня цитогенетических нарушений (увеличение частоты эритроцитов с микроядрами) по мере увеличения радиационного загрязнения (Чубинишвили, 1996б). Анализ иммунограмм в точке с повышенным радиоактивным загрязнением выявил наличие признаков активизации работы всех звеньев иммунной системы, что проявилось в изменении индекса напряженности (Исаева, Вязов, 1996а). Составленные лейкограммы периферической крови лягушек позволяют выявить морфологические изменения, характерные при хроническом действии радиационных факторов. Причем, степень выраженности этих изменений была наибольшей в точке с повышенным радиационным фоном (Чернышева, Старостин, 1996а).
Млекопитающие. Использовались фоновые виды мелких млекопитающих: рыжая полевка (Clethrionoys glareolus), обыкновенная бурозубка (Sorex araneus), полевая мышь (Apodemus agrarius), желтогорлая мышь (Apodemus flavicollis), мышь-малютка (Micromys minutus), полевка-экономка (Microtus oeconomus). Оценка стабильности развития по унифицированной интегральной системе морфогенетических показателей, включающая 10 краниологических признаков, выявила сходные тенденции у всех исследуемых видов и по уровню асимметричности и по частоте фенодевиантов. Несмотря на некоторые различия в реакции разных видов, отмечена согласованность в увеличении исследуемых показателей в радиационно загрязненной точке (Захаров и др., 1996).
Оценка других показателей гомеостаза развития (иммунологических, цитогенетических и физиологических) проводилась только у рыжей полевки
(Clethrionoys glareolus) как наиболее массового вида. Общая оценка иммунного статуса выявила максимальные отклонения в точке с наибольшим радиоактивным загрязнением (Исаева, Вязов, 1996б). Морфологические исследования клеток периферической крови выявили комплекс цитоморфологических изменений (нейтропия, появление атипичных форм), которые обычно регистрируются в радиобиологических экспериментах при хроническом действии на организм малых доз ионизирующих излучений (Чернышева, Старостин, 1996б). Оценка функциональной активности иммунной системы так же показала существенные изменения в серии точек с нарастанием радиационного загрязнения (Пронин и др., 1996). Оценка гельминтозной инвазии показала увеличение вдвое зараженности цестодами на участках с повышенным радиационным загрязнением (Пельгунов, 1996).
Проведенная работа, по комплексной оценке нарушения стабильности развития с привлечением различных методов оценки уровня гомеостаза, выявила скоррелированность ответа у разных видов живых организмов на воздействие радиационного загрязнения (Захаров, Крысанов, 1996).
Подобным комплексным подходом было оценено воздействие химического загрязнения и электромагнитного загрязнения (Захаров и др., 2000). Кроме того, установлена скоррелированность уровня флуктуирующей асимметрии с собственно популяционным показателем - успехом размножения (Zakharovet al., 1991).
1.3. Использование анализа флуктуирующей асимметрии листовой пластинки березы повислой Betula pendula Roth. Для целей биоиндикации
Как уже отмечалось, работы по оценке уровня стабильности растений с использованием анализа флуктуирующей асимметрии немногочислены и основная их доля появилась за последние несколько лет. В публикациях есть данные об использовании различных видов растений: травянистых и древесных.
Интерес к использованию березы повислой (Betula pendula Roth.) возрос в последнее время, после рекомендации этого вида Центром экологической политики как модельного для оценки стабильности развития, цикла работ по оценке качества среды на территории г. Калуги и Калужской области и оценке качества среды в Воронежском регионе. (Чистякова и др., 1996а,б; Захаров, Чистякова, Кряжева, 1997; Чистякова, 1997; Чистякова и др., 1997; Чистякова, 1997; Константинов, 1997; Шестакова и др, 1998; Константинов и др., 1999а,б, 2000; Мокров, Гелашвили, 1999; Захаров и д.р., 2000а, 2001а,б; Стрельцов и др., 1997а, б, в, 1998, 1999 а, б, в, г, 2000 а, б, 2001).
Одной из первых работ, где береза повислая использовалась в качестве индикатора химического загрязнения среды была проведена в г.Чапаевске Самарской области (Чистякова, 1997; Кряжева и др., 1996; Чистякова и др., 1996а). В ходе этой работы была предпринята попытка оценить стабильность развития березы в серии выборок, из точек, находящихся на разном удалении от источника химического загрязнения. Этот город - бывший центр по производству химического и других видов оружия (Федоров, 1994). В результате, различные методы оценки уровня флуктуирующей асимметрии (дисперсия асимметрии, величина среднего относительного различия между сторонами на признак) показали сходные результаты. Максимальные значения получены в наиболее загрязненной точке, подвергающейся одновременному воздействию двух химических предприятий и общего антропогенного пресса города, несколько меньше – в зонах воздействия каждого из предприятий и минимальные– в контроле.
Имеются данные о локализации территорий выхода метана из подземных полостей в почву на территории подземного хранилища газа КУПХГ в Калужской области, с использованием анализа флуктуирующей асимметрии у березы повислой, с применением ГИС-технологий (Стрельцов, Логинов, Константинов, 1999). Изучаемая территория покрывалась сеткой точек отбора биоиндикационных проб, плотностью 3 точки на 1км2 (всего 39 точек). Картографическая обработка полученных данных по коэффициенту флуктуирующей асимметрии, позволила локализовать территории с повышенными значениями коэффициента, совпавшие впоследствии с территориями повышенного содержания метана в почвенном воздухе.
Так же имеются данные об индикации химического загрязнения с использованием березы после железнодорожной аварии на разъезде Мыслец Шумерлинского района Чувашской Республики, произошедшей 14. мая 1996г. По официальным данным в почву попало 187 т. жидкого фенола, 897 т. нефтепродуктов, 60 т. полиэтиленовой крошки с первичной площадью загрязнения 9000м2. Ситуация была осложнена вспыхнувшим пожаром, возникшим от поврежденных линий электропередач. Оценка уровня стабильности развития березы проводилась на следующий год в семи точках, расположенных на разном удалении от места аварии в северо-западном направлении (преобладающем направлении ветра после аварии).
По уровню флуктуирующей асимметрии выборки разделились на три группы: минимальные значения в четырех выборках, удаленных от места аварии на 1км, 2,5км, 6км,
Параллельно проводился анализ наземных экосистем по уровню флуктуирующей асимметрии, цитогенетическому гомеостазу, иммунному статусу трех видов мышевидных грызунов. Полученные данные согласуются с результатами оценок стабильности развития березы (Захаров, 2000).
В ряде работ выявлено нарушение стабильности развития березы при радиационном воздействии. В рассмотренной ранее комплексной работе (Захаров, Крысанов, 1996) по оценке влияния на уровень флуктуирующей асимметрии различных видов живых организмов радиоактивного загрязнения на территории Брянской области (см. пункт 1.2.3.), использовалась береза повислая. Выборки производились из четырех точек в градиенте возрастания радиационного загрязнения. Увеличение уровня флуктуирующей асимметрии оказалось скореллировано с возрастанием уровня радиации (Чистякова, Кряжева, Захаров, 1996). Подобные результаты по биоиндикации березы радиоактивного загрязнения получены автором (см. гл. 3) и другими исследователями (Шпынов, 1998; Власов и др., 2001).
В работе Чистяковой с соавторами (1997) выявлена зависимость уровня флуктуирующей асимметрии березы от степени воздействия неионизирующей радиации (облучение электромагнитными волнами радиодиапазона). В качестве источника электромагнитного излучения использовался радар. Исследования проводились на территории Жуковской опытной станции Калужской области.
В работе отмечена зависимость между режимом работы радара и изменением уровня флуктуирующей асимметрии. Если работа радара начиналась после завершения интенсивного формирования листовой пластинки березы (с июня по август), то увеличения уровня флуктуирующей асимметрии не отмечалось, тогда как в случае работы радара с апреля по август захватывается период формирования листа, что приводило к увеличению коэффициента флуктуирующей асимметрии. Сходные данные о влиянии электромагнитного излучения трансформаторной подстанции были получены и с участием автора на территории Калужской области (Стрельцов и др., 2000а).
Оценка комплексного антропогенного воздействия с использованием березы проводилась в ряде работ (Мокров, Гелашвили, 1999; Недосекин, 2001; Глотов, 2001). Суть данного подхода заключается в сравнении территорий с высокой антропогенной нагрузкой (как правило, городская среда) с контролем.
В этом отношении особый интерес вызывает работа, проведенная на территории города Москвы (Захаров и др., 2001). В данной работе показана скоррелированность изменений показателей флуктуирующей асимметрии у различных видов живых организмов, обитающих в условиях жесткого антропогенного воздействия. Анализу подвергались растения (береза повислая), рыбы, земноводные, мелкие млекопитающие. Оценка наземных экосистем с использованием березы и мышевидных грызунов выявила сходную реакцию на антропогенное воздействие – повышение асимметричности. Эти данные являются еще одним доказательством универсальности выбранного подхода.
Для контроля результатов оценки стабильности развития у березы, получаемых по анализу асимметричности листа (морфологический подход), в рассмотренных выше работах Чистяковой и Захарова с соавторами (работы по оценке уровня радиации в Брянской области, воздействия химического загрязнения в Самарской области, воздействия неионизирующего излучения радара, воздействию химического загрязнения после железнодорожной аварии) параллельно использовался физиологический подход (проводилась оценка процессов фотосинтеза). Применяемая методика индукции быстрой флуоресценции хлорофилла, позволяет получить характеристику работы фотосинтетического аппарата. Во всех без исключения перечисленных работах при увеличении воздействия изучаемого фактора, нарушение стабильности развития березы сопровождалось увеличением уровня флуктуирующей асимметрии и снижением уровня фотосинтетической активности.
Глава 2.
Материал и методы
2.1. Расположение наблюдательных точек
Материал для оценки экологического здоровья наземной природной части территории Калужской области был собран в 45-ти стационарных точках, составляющих постоянный каркас системы регионального мониторинга (Рис.1). Расположение этих точек на территории области определено разработанной системой регионального экомониторинга и является неизменным на протяжении ряда лет;
Оценка территории Калужской области была проведена с использованием наиболее технологичного, распространенного, хорошо изученного, методически отработанного, удобного и зарекомендовавшего себя вида – березы бородавчатой (betula pendula), всего собрано более 2300 экземпляров листьев.
2.2. Сбор и обработка биологического материала
Сбор и обработка первичного биологического материала проводились в строгом соответствии с утвержденной на федеральном уровне методикой (Методические…, 2003) и учебно методическим пособием «Здоровье среды».
2.3. Математические расчеты
Математическая обработка первичных замеров производилась на персональных компьютерах «Pentium-4» с использованием стандартных пакетов программ, дополненных авторской компьютерной программой "AsCa". Результаты математической обработки – исходный материал для экологического анализа – коэффициенты флуктуирующей асимметрии. Сами расчеты коэффициента асимметрии проводились по формуле, которая используется при оценке величины асимметрии по нескольким размерным признакам как интегральный показатель: среднее относительное различие между сторонами на признак (Захаров, Крысанов, Пронин, 1996):
,
где,
,
k – число признаков.
Глава 3. Результаты и обсуждения
3.1. Анализ каждой выборки по 10 деревьям
Таблица: Сравнительный анализ коэффициента флуктуирующей асимметрии каждого дерева по сравнению со средним значением
Материал и методы
2.1. Расположение наблюдательных точек
Материал для оценки экологического здоровья наземной природной части территории Калужской области был собран в 45-ти стационарных точках, составляющих постоянный каркас системы регионального мониторинга (Рис.1). Расположение этих точек на территории области определено разработанной системой регионального экомониторинга и является неизменным на протяжении ряда лет;
Оценка территории Калужской области была проведена с использованием наиболее технологичного, распространенного, хорошо изученного, методически отработанного, удобного и зарекомендовавшего себя вида – березы бородавчатой (betula pendula), всего собрано более 2300 экземпляров листьев.
2.2. Сбор и обработка биологического материала
Сбор и обработка первичного биологического материала проводились в строгом соответствии с утвержденной на федеральном уровне методикой (Методические…, 2003) и учебно методическим пособием «Здоровье среды».
2.3. Математические расчеты
Математическая обработка первичных замеров производилась на персональных компьютерах «Pentium-4» с использованием стандартных пакетов программ, дополненных авторской компьютерной программой "AsCa". Результаты математической обработки – исходный материал для экологического анализа – коэффициенты флуктуирующей асимметрии. Сами расчеты коэффициента асимметрии проводились по формуле, которая используется при оценке величины асимметрии по нескольким размерным признакам как интегральный показатель: среднее относительное различие между сторонами на признак (Захаров, Крысанов, Пронин, 1996):
где,
k – число признаков.
Глава 3. Результаты и обсуждения
3.1. Анализ каждой выборки по 10 деревьям
Таблица: Сравнительный анализ коэффициента флуктуирующей асимметрии каждого дерева по сравнению со средним значением
| № выборки | кол-во значений выше среднего | кол-во значений ниже среднего |
| 1 | 4 | 6 |
| 2 | 5 | 5 |
| 3 | 5 | 5 |
| 4 | 3 | 7 |
| 5 | 4 | 6 |
| 6 | 4 | 6 |
| 7 | 3 | 7 |
| 8 | 6 | 4 |
| 9 | 6 | 4 |
| 10 | 3 | 7 |
| 11 | 4 | 6 |
| 12 | 4 | 6 |
| 13 | 5 | 5 |
| 15 | 4 | 4 |
| 18 | 3 | 7 |
| 19 | 6 | 4 |
| 20 | 6 | 4 |
| 21 | 4 | 6 |
| 22 | 3 | 7 |
| 23 | 3 | 7 |
| 24 | 5 | 5 |
| 25 | 3 | 7 |
| 26 | 3 | 7 |
| 27 | 3 | 7 |
| 28 | 5 | 5 |
| 29 | 4 | 6 |
| 30 | 4 | 6 |
| 31 | 5 | 5 |
| 32 | 4 | 6 |
| 33 | 4 | 6 |
| 34 | 5 | 5 |
| 36 | 6 | 4 |
| 37 | 3 | 7 |
| 38 | 5 | 5 |
| 39 | 6 | 6 |
| 40 | 5 | 5 |
| 41 | 6 | 4 |
| 42 | 6 | 4 |
| 43 | 4 | 6 |
| 44 | 6 | 4 |
| 45 | 7 | 3 |
