Реферат.

Дипломная работа на тему: «Биохимические показатели крови человека при сальмонеллезной интоксикации» содержит 46 страниц печатного текста, таблиц, 8 рисунков, 59 использованных источников литературы, из них 10 иностранных.

Перечень ключевых слов: сальмонеллез, перекисное окисление липидов, циркулирующие иммунные комплексы, каталаза, молекулы средней массы, сывороточный альбумин, эндогенная интоксикация.

Объект исследования: сыворотка крови практически здоровых людей и больных сальмонеллезом г. Пензы.

Практическое применение: в здравоохранении.

Список сокращений.

ПОЛ – перекисное окисление липидов;

ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы;

ЧСА – человеческий сывороточный альбумин;

МДА – малоновый диальдегид;

ПЭГ – полиэтиленгликоль;

АОС – антиокислительная способность;

АТ – антитело;

АГ – антиген;

ИК – иммунный комплекс;

ЛПС – липополисахаридный комплекс;

МСМ – молекулы средней массы;

ТБК – тиобарбитуровая кислота;

ЭКА – эффективная концентрация альбумина;

ОКА – общая концентрация альбумина;

ТХУ – трихлоруксусная кислота;

ЦНС – центральная нервная система;

ц-АМФ – циклический аденозинмонофосфат;

АФК – активные формы кислорода;

LOOH, HOOH – гидроперекиси;

СОД – супероксиддисмутаза.

Содержание.

Введение

Успехи в борьбе с инфекционными заболеваниями в нашей стране общепризнанны. Вместе с тем в инфектологии еще остаются проблемы, имеющие серьезное социально-экономическое значение для всех стран мира. К их числу относятся острые кишечные инфекционные заболевания [1].

Сальмонеллез – группа острых кишечных инфекционных болезней, вызываемых бактериями рода Salmonella, характеризующихся значительным полиморфизмом клинического течения, частым наличием интоксикации, лихорадки, признаков поражения желудочно-кишечного тракта [2].

Крупные достижения отечественных и зарубежных исследователей, установивших патогенетическое значение нарушения биологической регуляции при острых кишечных инфекциях, дали новый импульс в изучении патогенеза сальмонеллеза [3].

Иммунная система представляет собой сложную многокомпонентную систему из быстроделящихся и покоящихся клеток. Она является высокочувствительной к воздействию токсинов бактерий. Это приводит к нарушению иммунорегуляторных процессов.

Наиболее информативными являются показатели состояний прооксидантно-антиоксидантного равновесия, которое при усилении действия на организм токсинов смещается в сторону активизации ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ.

ПОЛ – это фундаментальный универсальный молекулярный механизм, лежащий в основе устойчивости и адаптационных возможностей организма. В норме ПОЛ обеспечивает условие для жизненно важных функций клетки, в случае же интоксикации становится пусковым механизмом патобиохимических изменений в организме человека.

Целью моей дипломной работы является изучение биохимических показателей эндотоксикоза в динамике патологического процесса. В задачи исследования входило:

1. Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и активности каталазы в группе контроля, которую составили практически здоровые люди.

2. Определение содержания МДА, уровня холестерина, ЦИК, Ит, МСМ и активности каталазы у больных сальмонеллезом.

3. Исследование изменения изучаемых показателей у больных в зависимости от степени тяжести заболевания.

1. Обзор литературы

1. Биохимическая характеристика интоксикации при сальмонеллезной инфекции

Сальмонеллезы принадлежат к числу инфекционных заболеваний, весьма широко распространенных на всех континентах мира. Возбудителем сальмонеллезов являются микроорганизмы, принадлежащие к роду Salmonella, семейства кишечных Enterobacteriaceae.

Сальмонеллы – это мелкие бактерии вытянутой формы с закругленными концами длиной от 1 до 3 и диаметром 0,5-0,8 нм [4].

Сальмонеллез встречается чаще у жителей городов, чем сел, что связывается с лучшей регистрацией заболеваемости, наличием множественных детских учреждений, широким употреблением пищевых полуфабрикатов. Заболевание отмечается круглый год, но максимальное число регистрируется в теплое время года, что объясняется благоприятными условиями размножения сальмонелл в пищевых продуктах и реализации инфекции [5].

Таблица 1.1.1.

Статистические данные больных сальмонеллезом г. Пензы.

В возникновении сальмонеллеза ведущую роль играют живые бактерии, гибель которых в организме больного сопровождается развитием эндотоксинемии. Принято выделять два вида токсичных продуктов жизнедеятельности микробов-экзотоксии и эндотоксии. К экзотоксинам отнесены токсичные продукты жизнедеятельности бактерий, активно (при жизни) секретируемые в окружающую среду, а к эндотоксинам – те ядовитые для макроорганизма продукты жизнедеятельности, которые освобождаются только при лизисе микробной клетки [6].

Кроме токсина палочка имеет ряд антигенов клеточной стенки. О-антиген расположен на поверхности микробной клетки и представляет собой фосфолипидно-полисахаридный комплекс, включающий 60 % полисахарида, 20-30 % липида и 3-4,5 % гексозамина. Н-антиген определяется жгутиками. Поверхностные антигены клеточной стенки провоцируют типоспецифический антительный ответ, а глубинные – видоспецифический [6,7].

При сальмонеллезе развитие и тяжесть симптомов обусловлены интоксикацией и обезвоживанием. По мнению А.Ф. Билибина интоксикация – явление сложное, сводящееся к изменению нервнорефлекторной деятельности и гуморальной регуляции с обменными сдвигами. К.В. Бунин в основу синдрома интоксикации ставит воздействие токсина на :

1. падение артериального давления, снижение сократительной способности миокарда;

2. гормональную регуляцию водно-солевого обмена с изменениями биосинтеза гормонов в коре надпочечников с угнетением процесса их метаболизма;

3. функцию почек (снижение клубочковой фильтрации, повышение канальцевой реабсорбции воды, снижение концентрации очищения мочевины) [8].

Сальмонеллезная интоксикация возникает как результат патологии первичного ответа на инфекционный агент вследствие значительных потерь воды и электролитов с рвотой и жидким стулом. По мере увеличения дефицита воды и электролитов на первый план выступают симптомы обезвоживания и поражения ЦНС. Если процесс прогрессирует, обезвоживание нарастает, появляются признаки недостаточности кровообращения, которые при интоксикации имеют клинику шока. Частая рвота и понос – первые признаки интоксикации [9].

Обязательным условием развития заболевания являются наличие большого количества возбудителей и их токсинов, массовое проникновение антигенов в кровь. Наибольшей токсичностью отличается липид А, вызывающий следующие основные реакции: активацию лейкоцитов и макрофагов, стимуляцию выброса эндогенного пирогена, антогониста глюкокортикоидов, интерферона, интерлейкинов, подавление тканевого дыхания, активацию системы комплемента, тромбоцитов, факторов свертывания крови другие [10,11], [рис. 1.1.1].

Главной причиной развития шока при сальмонеллезе считается не повреждающее действие самих микробов или их токсинов, а своеобразный ответ организма на них. Под токсико-инфекционным шоком следует понимать экстремальное состояние организма, наступающее в результате действия токсичных субстанций возбудителей, патогенных иммунных комплексов на органы и ткани организма, сопровождающееся острым нарушением метаболизма в них [12].

Схематическое изображение липополисахаридов

стенок микробов.

Рис. 1.1.1.

С.А. Степанов с помощью аспирационной биопсии обнаружил в тонкой кишке больных сальмонеллезом изменение эпителия, острое воспаление слизистой оболочки, нарушение микроциркуляции и сосудистой проницаемости. К.Х. Ходжаев в эксперименте на крысах показал, что сальмонеллезная инфекция вызывает нарушение процесов тканевого дыхания и фосфорилирования. Состояние поджелудочной железы изучено Белянской Т.А. В острый период болезни отмечено снижение ферментативной активности панкреатического сока – уровень трипсина был снижен в 71 % случаев, липазы в 55 %, амилазы – в 66 %.

Таким образом эндотоксин вызывает активацию синтеза, преимущественно протеолитических ферментов, задержку экструзии секретируемых проэнзимов, что приводит к секреции и поступлению ферментов в лимфатическое и кровеносное русло [13,14].

При сальмонеллезе развивается обезвоживание, обусловленное потерей внеклеточной жидкости, а при тяжелом течении заболевания и части клеточной. Дегидратация в большинстве случаев имеет изотонический характер, сочетаясь с развитием сгущения крови, дефицитом электролитов, метаболическим ацидозом в капиллярной и венозной крови [15], [рис. 1.1.2].

2. Молекулярные механизмы развития эндогенной

интоксикации при сальмонеллезе

Явления интоксикации вызывают заболевания, сопровождающиеся повышенным распадом тканей, усиленными процессами катаболизма, недостаточностью функции печени и почек, снижением процессов микроциркуляции [16].

В ответ на действие первичного патогена, которым являются эндотоксины, сальмонелл, в организме развиваются типовые каскадные реакции, что лежит в основе современной концепции СЭИ.

На Международном симпозиуме в Санкт-Петербурге (1994 г) было дано определение этого синдрома как клинического синдрома с проявлением симптомов интоксикации при патологических состояниях неоднородных по этиологии и обуславливающих накопление в тканях и биологических жидкостях организма продуктов патологического обмена веществ, метаболитов, деструкции клеточных и тканевых структур, разрушения белковых молекул [17,18].

Шано В.П. с соавторами подчеркивает, что токсическое влияние липополисахаридной субстанции эндотоксина проявляется комплексом нарушений, обусловленных повреждением как циркулирующих клеток в кровотоке, так и эндотелиоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, следствием чего является выброс в кровоток ряда биологически активных веществ – цитокинов, интерлейкинов. Главной точкой приложения эндотоксина являются эндотелиальные клетки, активация их приводит к высвобождению простациклина, выделению эластазы, токсических метаболитов кислорода, факторов активации тромбоцитов и комплемента с высвобождением терминального комплекса комплемента, брадикинина с последующим формированием синдрома повышенной проницаемости капилляров. Это приводит к тому, что в очаг воспаления начинают входить компоненты крови, прежде всего фибриноген и тромбоциты. Фибрин способствует агрегации тромбоцитов, полимеризации фибрина и – возникновению тромбов. Следствием тромбоза являются нарушения микроциркуляции с последующей гипоксией, что приводит к дальнейшим повреждениям клеток в очаге воспаления. Метаболическим результатом этого является изменение аэробного метаболизма клеток на анаэробный, повышенное продуцирование лактата и протонов, снижение показателей рН [19].

Среди тканевых (клеточных) медиаторов воспаления важное место занимают простагландины. Исходными продуктами для биосинтеза простагландинов являются ненасыщенные жирные кислоты: линолевая, арахидоновая, пентаноевая. Наибольшее значение имеет в организме арахидоновая кислота, которая содержится в фосфолипидах клеточных мембран.

Простагландины вызывают сильное диуретическое и натрийуретическое действие, оказывают разнообразное действие на желудочно-кишечный тракт. Они могут стимулировать и тормозить сокращение и секреторную активность тонкой кишки, тормозят секрецию соляной кислоты слизистой оболочки желудка. Простагландины вызывают секрецию воды и электролитов в просвет кишки, вызывая диарею, повышают концентрацию ц-АМФ в слизистой оболочке тонкой кишки, влияют на прочность и упругость эритроцитарной мембраны [20, 21, 22, 49].

3. Показатели уровня эндогенной интоксикации

организма при сальмонеллезе

Анализируя данные литературы за последние десятилетия, можно сказать, что основными показателями интоксикации при сальмонеллезе являются ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, ИТ, МСМ и активность каталазы. При развитии интоксикации на фоне сальмонеллеза происходит активный хемотаксис нейтрофиллов в очаг воспаления, где они поглощая и переваривая чужеродный агент, изменяют свою метаболическую активность, характеризующуюся усилением поглощения кислорода, повышенной утилизацией глюкозы и гиперпродукцией АФК () [23, 24].

Перекисное окисление является универсальным механизмом взаимодействия кислорода со многими органическими субстратами, в том числе с липидами. Внедрение кислорода в молекулы окисленного субстрата приводит к образованию реакционно-способных промежуточных продуктов – свободных радикалов, гидроперекисей, которые в дальнейшем вызывают повреждение других классов соединений – белков, нуклеиновых кислот, углеводов (рис. 1.3.1).

Метаболизм супероксидного радикала в норме

и при патологии (Владимиров Ю.Я., 1998)

Рис. 1.3.1.

Накопленные к настоящему времени данные литературы позволяют сделать вывод о том, что свободнорадикальное окисление липидов при сальмонеллезной инфекции играет определенную патогенетическую роль [25, 50].

Установлено, что при развитии ПОЛ в биомембранах понижается содержание легкоокисляемых полиненасыщенных жирных кислот и изменяются физико-химические свойства: микровязкость, текучесть, мембранный потенциал, полярность внутренних областей мембран. Таким образом, изменяются транспортные свойства мембраны и активность ферментов [26].

Регуляция свободнорадикального окисления обеспечивается в клетке системой антиоксидантной защиты. Так, накапливающаяся в процессе ПОЛ перекись водорода обезвреживается с помощью каталазы, присутствующей во всех тканях организма. Каталаза (КФ 1.11.1.6.) представляет собой гемсодержащий фермент с молекулярной массой около 250000 Д, локализованный в пероксисомах клеток [27].

Митохондриальная каталаза участвует в оксидазном пути окисления, сопровождающемся запасанием энергии в виде АТФ. Блокирование транспорта электронов в дыхательной цепи приводит к стимуляции пероксисомального окисления. При потологиях, связанных с нарушением энергетических процессов, каталаза пероксисом может выходить из них и участвовать в окислении на мембранах эндоплазматического ретикулума [28, 53].

В работе Л.Б. Оконенко с соавторами о состоянии антиоксидантной системы судили по активности СОД, глутатионпероксидазы и каталазы, анализ данных выявил дефицит антиоксидантов [29, 30].

При инфекционном токсикозе в мембранах эритроцитов резко снижается содержание общих фосфолипидов, но увеличивается количество НЭЖК и лизофосфотидилхолина, что косвенно указывает на повышение активности фосфолилаз, которые избирательно разрушают липиды мембран. Холестерин подвергается как активному, так и пассивному обмену в мембранах эритроцитов [29]. Фермент лецитинхолестеролацил трансфераза превращает эфиры холестерина в свободный холестерин и тем самым регулирует уровень свободного холестерина в плазме, что способствует проникновению его в мембраны. Следовательно, инактивация этого фермента в результате гипоксии при эндотоксикозе ведет к повышению уровня эфиров холестерина в мембранах эритроцитов [31,32].

Наряду с уровнем МДА, активности каталазы и уровня холестерина для диагностики заболевания и его прогноза имеют значение и другие неспецифические показатели – ЦИК, Ит, МСМ.

Синтезирующиеся при формировании иммунитета специфические антитела обладают способностью взаимодействовать с антигенами возбудителей и тем самым вызывать нейтрализацию патогенных микробов и их токсинов. Эта реакция сопровождается образованием иммунных комплексов антиген – антитело [33, 34, 54, 55]. При патологических состояниях образование ИК выходит из под контроля, в результате чего развивается та или иная болезнь ИК [рис. 1.3.2.].

Патогенетические механизмы болезней иммунных

комплексов (Сура В.В., 1987)

Рис. 1.3.2.

В результате развития эндотоксемии при сальмонеллезе организм длительное время контактирует с избытком АГ как экзогенного (компоненты микробных клеток), так и эндогенного (компоненты разрушенных клеток самого организма) происхождения. Вместе с тем наблюдается угнетение системы комплемента, ответственного за лизис микробных клеток. В этих условиях значительного избытка АГ и недостаточности выработки АТ может привести к образованию ИК, которые способны откладываться в определенных тканях и вызывать острые воспалительные реакции. При значительных отложениях наблюдаются функциональные и морфологические повреждения органов и тканей [35].

Связываясь с клеточной мембраной ЦИК вызывают выделение в окружающую среду протеолитических ферментов и основных пептидов. Эти вещества повреждают протеогликановые компоненты тканей, действуют на базальную мембрану и вызывают некроз эндотелиальных клеток [36].

ЦИК наряду с продуктами ПОЛ вызывают нарушение проницаемости мембран, вплоть до их разрыва, что в конечном итоге может привести к гибели клетки. В результате появляются различные вещества пентидной природы. Из них наибольший интерес представляют молекулы средней массы.

Являясь олигопептидами с молекулярной массой 300-5000 Дальтон, они расцениваются как универсальный критерий эндогенной интоксикации и влияют на ее уровень и прогноз [37, 38].

МСМ образуются в организме под воздействием повреждающих эндогенных или экзогенных факторов различного генеза, являются промежуточными продуктами протеолиза. [39, 57].

Пристальное внимание исследователей к МСМ объясняется высокой биологической активностью их отдельных фракций, которые ингибируют гликолиз, глюконеогенез, пентозный цикл, синтез гемоглабина, нуклеиновых кислот, мембранный транспорт, дагоцитов, эритропоэз, микроциркуляцию, обладают иммунодепрессивным, цитотоксическим, нейро- и психотропным свойствами. Сейчас, квалификационная оценка степени тяжести состояния больных при сальмонеллезе немыслима без определения МСМ [40].

Установлено, что значительная часть циркулирующих в крови СМ не только растворена в плазме крови, но и связана с альбумином.

Человеческий сывороточный альбулин (ЧСА) – важнейший транспортный белок, осуществляющий перенос эндогенных метаболитов и ксенобиотиков в плазме крови, межклеточной жидкости, в лимфе.

Универсальность транспортной функции ЧСА обеспечивается его уникальной способностью связывать лиганды различной химической природы. Интенсивная лигандная нагрузка молекул альбулина приводит к изменению их структуры и связывающей способности. Такие модификационные формы ЧСА обнаруживаются при патологии [41].

О величине токсического действия вредных веществ можно судить по ЭКА, которая снижается после того, как токсические вещества займут центры связывания в молекуле альбулина, что приводит к снижению детоксикационных свойств организма. Изучение свойств альбулина является важным с точки зрения как диагностики, так и лечения [42].

2. Материалы и методы исследований

1. Материал исследований

Уровень интоксикации оценивался по изменениям в крови больных эффективной и общей концентраций сывороточного альбулина, малонового диальдегида, как одного из продуктов ПОЛ, уровня холестерина, ЦИК, МСМ и активности каталазы.

Для всех исследований бралась сыворотка крови. Исследовано 30 больных сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет. Для контроля набиралась группа 51 человека разного пола в возрасте от 20 до 46 лет.

Кровь бралась из локтевой вены, преимущественно натощак в количестве не менее 5 мл. Центрифугируем 1500 об/мин 10 минут. Для выполнения анализов сыворотки необходимо использовать сразу или заморозить и хранить при t=-20С.

2. Методы исследований

2.2.1. Определение МДА с тиобарбитуровой кислотой

(Конюхова В.С., 1989)

Об изменении интенсивности ПОЛ судим по изменению уровня вторичного продукта ПОЛ – малонового диальдегида.

Метод основан на том, что при высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с 2-ТБК, образуя окрашенный розовый триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 535 им.

Ход работы: К 0,2 мл сыворотки крови добавить 0,2 мл дистиллированной воды, 1 мл 0,6 % ТБК в ледяной уксусной кислоте. Кипятить 30 минут, охладить и добавить 1 мл 5№ КОН и 2 мл изопропанола. Центрифугируют при 6000 об/мин 20 минут. Колориметрируют при 535 нм и 580 нм против контроля, содержащего вместо плазмы воду.

Расчет: (мкМоль/л), где Е – оптическое поглащение изопропилового экстракта; 106 – коэффициент пересчета оптической плотности.

Пример расчета: больной Максимов С., 19 лет

концентрация МДА = (мкМоль/л).

2.2.2. Определение активности каталазы

(Королюк М.А., 1988)

Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс.

Ход определения: Реакция запускается добавлением 0,1 мл сыворотки крови к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.

Расчет: (мкат/л), где

Е – активность каталазы в мкат/л;

А – оптическая плотность холостой и опытной проб;

V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;

t – время инкубации, 600 сек;

К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный .

За единицу активности каталазы принимают то количество фермента, которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за 1 секунду при заданных условиях. Расчет активности каталазы ведут на 1 л сыворотки крови.

Пример расчета: больной Крайнов Т.В., 31 год.

(мкат/л)

2.2.3. Определение общего холестерина в сыворотке крови ферментативным методом «Фотокол»

(Творогова М.Г., 1995)

Определение основано на сопряженных реакциях, которые катализирует холестеринэстераза, холесериноксидаза и пероксидаза:

Эфиры холестерина холестерин + Ж.К.;

Холестерин + О₂ холестинон + Н₂О₂;

Н₂О₂ + хромогены Н₂О + окрашенный продукт.

Концентрация образующегося в ходе реакции окрашенного продукта пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Ход определения: Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при t = 37^oС. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и инкубировать 20 минут при t = 37^oС. Окрашенные пробы фотометрировать при 500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм или 10 мм относительно холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной температуре.

Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:

ммоль/л, где

Е_ОП и Е_К – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.

Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.

2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов

в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)

Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в 3,75 % ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.

Реактивы:

1. 0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры растворить в 1 л дистиллированной воды)

2. 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.

Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить 0,6 мл реактива №1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2 пробирки. В I добавить 2,7 мл раствора №1 (контроль). Во II добавить 2,7 мл раствора №2 (опыт). Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. На спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую плотность в кюветах при 450 нм.

Расчет: Высчитывают разность показателей оптической плотности, результат умножают на 1000 и получают количество ИК в 100 мл сыворотки. Ответ выражают в единицах оптической плотности. - количество ЦИК в 100 мл сыворотки.

Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.

Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.

Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:

усл. ед.

2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)

Метод основан на осаждении белков из исследуемой жидкости 10 % раствором ТХУ с последующем центрифугированием и определением абсорбции света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.

Ход работы: Сыворотку крови обрабатывают 10 % раствором ТХУ. В качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в 30 раз разведенный дистиллированной водой. Оптическая плотность его против воды составляет 0,1230,012 усл. ед. на волне 254 нм при 23-25С. Центрифигируем 3000 об/мин в течение 30 минут. К 0,5 мл надосадочной жидкости +4,5 мл дистиллированной воды. Измерение проводим на спектрофотометре в УФ свете при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине волны 254 нм для определения нуклеотидов. Уровень МСМ выражают в единицах, количественно равных показателям экстинции.

2.2.6. Определение показателей «эффективная концентрация

альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке крови человека флуоресцентным методом

(Миллер Ю.И., 1994).

Принцип метода:

Метод основан на специфическом взаимодействии флуоресцентных органических соединений с альбумином в сыворотке крови. В зависимости от условий этого взаимодействия интенсивность флуоресценции красителя из альбумина отражает различные свойства белка. Индекс ЭКА/ОКА не зависит от числа молекул альбумина в пробе и характеризует физико-химические свойства молекулы альбумина.

Состав набора:

Реактив I (4 ампулы по 5 мл). Предназначен для приготовления раствора используемого при разбавлении сыворотки крови. Он содержит антикоагулянт ЭДТА.

Реактив II (4 ампулы по 0,7 мл). Основным компонентом является специальное флуоресцирующее соединение, интенсивность флуоресценции которого в сыворотке крови пропорциональна концентрации сывороточного альбумина.

Реактив III (4 ампулы по 0,7 мл). Взаимодействие реактивов №2 и №3 с сывороткой позволяет определить ОКА.

Определение показателя ЭКА:

К 2,0 мл надосадочной жидкости добавить 0,025 мл реактива 2. Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции при длине волны возбуждения 420 нм и длине волны испускания 515 нм.

Определение показателя ОКА:

В ту же пробу добавить 0,025 мл реактива 3. Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции. Нормальные величины показателя ЭКА лежат в интервале нормальных значений ОКА от 40 г/л – 55 г/л.

Подготовка образцов крови к измерениям:

Буферный раствор: Содержимое ампулы с реактивом 1 перенести в 100 мл дистиллированной воды. Перемешать. 0,025 мл сыворотки крови добавить в пробирку, содержащую 5 мл раствора для разбавления крови. Для анализа берут жидкость 2,0 мл полученного образца.

Используют специализированный анализатор АКЛ-0,1.

3. Результаты исследования и их обсуждение

1. Определение показателей уровня интоксикации

в сыворотке крови практически здоровых людей

Нами было произведено исследование биохимических показателей – МДА, активность каталазы, уровень холестерина, ЦИК, МСМ, Ит в сыворотке крови 51 донора в возрасте от 20 до 46 лет. Сыворотка крови доноров была получена на ОСПК (областная станция переливания крови) г. Пензы.

Полученные результаты биохимических анализов были подвергнуты статистической обработке, согласно методам и приемам статистического анализа.

По данным комитета экспертов Международной федерации клинической химии по референтным величинам рекомендуется верхняя и нижняя границы нормы на уровне М1,96σ, состояние предболезни М2σ, состояние острой формы М3σ.

Об уровне процессов ПОЛ судили по концентрации вторичного продукта МДА. Содержание количества МДА составляет 3,610,07 мкМоль/л. Это значение близко к данным, найденным в литературе (табл. 3.1.1). У 48 человек значение содержания МДА входит в границы М1,96σ. У 3 человек (5 %) содержание МДА соответствует значению М2σ, что соответствует состоянию предболезни.

Активность каталазы у практически здоровых людей составила 16,70,15 мкат/л (табл. 3.1.1). При исследовании активности каталазы в группе доноров отклонений за пределы М1,96σ мы не наблюдали.

Уровень холестерина, определяемый нами у практически здоровых людей составил 4,450,68 ммоль/л (табл. 3.3.1.), показатели уложились в границу референтной величины М1,96σ.

Содержание ЦИК, определяемое нами в сыворотке крови практически здоровых людей составило 52,623,52 усл. ед. (табл. 3.1.1). 94 % людей по показателям ЦИК входит в границы нормы, а 6% находятся в состоянии предболезни.

Уровень МСМ у обследованных доноров в среднем составил 0,2800,01 усл. ед. Это значение близко к данным, найденным в литературе (табл. 3.1.1). При исследовании МСМ отклонений за пределы М1,96σ мы не наблюдаем.

У практически здоровых людей определена детоксикационная нагрузка сывороточного альбумина, т.е. определение общей и эффективной концентрации альбумина. Токсичность по альбумину составляет 0,130,01 усл. ед. (табл. 3.1.1). Все значения токсичности по альбумину вошли в границы М1,96σ.

Полученные нами данные не имели существенных отличий от значений этих показателей, имеющихся в литературе в сравнении с приложением 2.

Таблица 3.1.1.

Содержание биохимических показателей в сыворотке крови практически здоровых людей

2. Определение показателей уровня интоксикации

в сыворотке крови больных сальмонеллезом

Сыворотка крови больных исследовалась на базе центра госсанэпиднадзора г. Пензы. Исследования биохимических показателей велись в острую фазу заболевания и в период ранней реконвалесценции. Обследовано нами 30 больных сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет, с целью установления показателей, характеризующих эндотоксикоз: перекисное окисление липидов, уровень холестерина, Ит по сывороточному альбумину, циркулирующих иммунных комплексов, молекул средней массы и активности каталазы. Причем биохимические показатели крови в разгар заболевания отличались от показателей в период ранней реконвалесценции.

Таблица 3.2.1.

Биохимические показатели сыворотки крови

у больных сальмонеллезом

Так, в ходе исследования выявлено достоверное увеличение количества МДА в сыворотке крови больных сальмонеллезом на 99 % по отношению к контролю, т.е. возрастает в 2 раза. Данные наших исследований подтверждаются сведениями Л.Б. Оконенко, Л.Д. Мартыненко и другими. По данным этих авторов концентрация МДА при сальмонеллезе возрастает в 2-2,5 раза.

Как видно из таблицы (табл. 3.2.1), у больных наблюдается интенсификация ПОЛ.

Под воздействием сальмонеллезного токсина происходит нарушение липидных бислоев клеточных и субклеточных мембран. Накопление в крови первичных и вторичных продуктов ПОЛ идет не в силу количественных изменений в содержании фосфолипидов плазмы крови, а вследствие интенсификации их свободнорадикального окисления. Результатом инициации ПОЛ становится образование критических концентраций продуктов ПОЛ, которые токсичны для организма. Известно, что повышение ПОЛ может приводить к нарушению проницаемости мембран с последующей инактивацией мембранно-ассоциированных ферментных систем, выходом лизосомальных гидролаз в цитозоль, что вызывает повреждение ДНК т другие существенные изменения в структуре и функциональном состоянии клетки [29, 43, 51, 52].

Установлено, что при ряде инфекционных заболеваний развивается антиоксидантная недостаточность. Одновременно снижается актиность ферментов антиоксидантной защиты, в частности каталазы [44].

По нашим наблюдениям, активность каталазы снизилась на 22 % в острый период заболевания по отношению к контролю. В период ранней реконвалесценции показатель активности каталазы приближается к контролю (табл. 3.2.1).

Л.Б. Оконенко, Л.И. Волкова в своих работах отмечает угнетение каталазной активности. В острый период заболевания происходит резкое сокращение антиоксидантной обеспеченности организма [26, 29].

А.С. Волков указывает на то, что в процессе эндотоксикации метаболические расстройства приводят к гиперлипидемии. Это подтверждается данными наших наблюдений. Так, уровень холестерина в сыворотке крови больных сальмонеллезом в среднем составил 6,540,07 ммоль/л, что на 46,9% больше контроля (табл. 3.2.1).

Таким образом, гиперхолестеринемия характеризует патологию обмена липидов и липопротеидов [32,45].

В период ранней реконвалесуценции уровень холестерина приближается к контролю [рис. 3.2.1].

Приложение 2

Содержание биохимических показателей в сыворотке крови практически здоровых людей по данным литературы

Приложение 3

Биохимические показатели крови практически здоровых людей, n=51

Приложение 4

Биохимические показатели крови

больных сальмонеллезом в острый период, n=30.

Μ

7,19

100,63

6,54

13,09

0,550

m

0,196

4,04

0,07

0,16

0,02

σ

1,07

22,138

0,01

0,85

0,11

№ п/п

Ф. И. О.

Возраст

Пол

Дата анализа

№ истории болезни

МДА (мкМоль/л)

ЦИК

(усл. ед.)

Уровень

холестерина

ммоль/л

Активность каталазы

МСМ

(усл. ед.)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

1

М. А. М.

32

М

14.02.98.

160А02.8

3,84

54

3,77

15,8

0,225

2

Л. В. И.

37

М

14.02.98.

230А02.8

4,02

48

4,95

15,6

0,287

3

С. О. Е.

29

М

9.02.99

410А02.1

5,18

35

5,14

14,5

0,354

4

Б. В. И.

46

Ж

9.02.99.

182А02.1

3,03

96

4,24

16,1

0,268

5

Х. В. В.

28

Ж

11.07.98.

523А02.0

4,15

77

5,19

16,4

0,256

6

С. И. Е.

19

Ж

12.10.98.

728А02.8

5,96

68

3,96

15,7

0,358

7

М. О. И.

24

Ж

11.10.98.

615А02.8

3,19

58

3,39

14,9

0,280

8

К. Г. А.

32

М

3.03.98.

363А02.8

4,17

60

5,05

14,5

0,332

9

Д. И. Е.

39

М

3.03.98.

290А02.8

2,98

56

5,14

16,2

0,253

10

Е. Т. А.

17

Ж

3.03.98.

490А02.1

5,63

73

4,95

17,3

0,209

11

Р. О. А.

37

Ж

10.02.98

517А02.1

3,65

100

5,24

15,8

0,209

12

К. С. И.

39

М

10.02.98.

560А02.8

3,53

83

5,09

14,3

0,214

13

Ш. Г. В.

25

Ж

27.02.98.

393А02.8

4,12

69

3,77

17,6

0,272

14

Б. И. Р.

41

М

13.03.98.

102А02.8

3,68

75

4,24

17,1

0,353

15

П. О. К.

33

Ж

13.03.98.

280А02.8

4,16

81

3,77

15,3

0,386

16

К. И. И.

29

Ж

4.07.98.

432А02.1

2,93

63

5,05

17,7

0,232

17

Г. С. И.

31

Ж

4.07.98.

630А02.0

3,57

77

3,75

16,8

0,305

18

С. И. В.

47

М

4.07.98.

216А02.8

3,69

68

4,24

16,4

0,265

19

К. И. Б.

42

Ж

28.09.98.

390А02.8

4,12

100

3,92

15,9

0,413

20

П. О. А.

53

М

28.90.98.

575А02.8

3,95

64

4,16

16,8

0,294

21

С. И. П.

25

М

15.02.99.

721А02.8

3,17

73

5,33

14,3

0,562

22

Е. Т. С.

24

Ж

15.02.99.

470А02.8

2,50

72

4,81

14,9

0,531

23

З. О. Ю.

36

М

17.02.99

370А02.0

4,53

59

4,24

15,6

0,309

24

М. Л. А.

41

М

17.02.99.

182А02.0

4,41

43

5,02

16,3

0,265

25

Д. С. К.

22

Ж

6.10.98.

652А02.8

3,12

48

3,33

16,9

0,272

26

К. С. Д.

18

Ж

6.10.98.

713А02.8

3,03

66

5,91

15,7

0,239

27

Е. А. В.

43

М

11.10.98.

760А02.8

2,90

72

3,89

15,9

0,245

28

М. О. Р.

33

М

28.08.98.

535А02.8

4,77

73

4,74

16,2

0,179

29

П. З. Л.

30

Ж

7.12.98.

862А02.0

3,78

80

5,58

14,7

0,524

30

Е. В. В.

31

Ж

7.12.98.

718А02.8

4,27

77

3,68

13,9

0,355

Μ

3,87

68,9

4,65

15,84

0,31

m

0,15

2,8

0,7

0,19

0,02

σ

0,81

15,41

0,09

1,02

0,1

№ п/п

Ф. И. О.

Возраст

Пол

Дата анализа

ЭКА (г/л)

ОКА

(г/л)

ОКА

(%)

Ит

(усл. ед.)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1

К. В. И.

35

Ж

5.02.98.

42

54

78

0,28

2

К. Б. А.

39

М

5.02.98.

42

56

75

0,33

3

У. С. Б.

29

М

15.02.98.

44

59

74

0,35

4

И. И. И.

31

Ж

17.02.98.

38

49

77

0,29

5

К. В. Л.

34

М

17.02.98.

47

59

79

0,25

6

М. В. В.

40

М

17.02.98.

42

57

74

0,37

7

С. П. Б.

40

М

25.02.98.

42

55

76

0,31

8

Л. Е. В.

32

М

25.02.98.

43

54

80

0,26

9

Г. Т. Ю.

28

Ж

15.03.98.

44

59

75

0,35

10

А. И. А.

28

Ж

16.03.98.

45

55

82

0,22

11

Л. Л. Я.

40

Ж

16.03.98.

44

59

75

0,34

12

С. Б. И.

46

Ж

19.03.98.

40

51

78

0,27

13

С. И. В.

28

Ж

16.04.98.

42

58

72

0,38

14

М. А. И.

31

М

16.04.98.

42

56

75

0,34

15

Х. А. И.

37

М

22.04.98.

45

54

83

0,21

16

К. И. П.

30

М

22.04.98.

38

55

69

0,43

17

Р. И. И.

33

М

22.04.98.

38

49

78

0,29

18

И. И. А.

29

Ж

27.04.98.

44

55

80

0,25

19

И. В. А.

40

М

27.04.98.

42

57

74

0,36

20

М. И. В.

36

Ж

10.05.98.

43

57

75

0,32

21

С. В. Г.

32

М

10.05.98.

35

41

85

0,17

22

З. О. А.

32

М

12.05.98.

47

58

81

0,24

23

Я. В. В.

30

М

12.05.98

40

51

78

0,27

24

П. И. В.

31

М

17.05.98.

43

50

86

0,16

25

А. С. Б.

36

М

17.05.98.

42

56

75

0,33

26

С. А. И.

20

Ж

3.02.99.

43

54

80

0,26

27

М. И. В.

34

М

9.02.99.

42

58

72

0,38

28

Д. О. В.

37

Ж

9.02.99.

48

57

84

0,19

29

Т. С. Д.

22

М

16.02.99.

45

54

83

0,21

30

К. В. А.

28

М

9.04.99.

38

49

78

0,29

Μ

42,3

54,5

77,7

0,29

m

2,87

3,52

0,01

σ

17,6

24,12

0,07

№ п/п

Ф. И. О.

Возраст

Пол

Дата анализа

ЭКА (г/л)

ОКА

(г/л)

ОКА

(%)

Ит

(усл. ед.)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1

К. В. И.

35

Ж

5.02.98.

46

53

86

0,15

2

К. Б. А.

39

М

5.02.98.

34

41

84

0,16

3

У. С. Б.

29

М

15.02.98.

38

44

86

0,15

4

И. И. И.

31

Ж

17.02.98.

47

51

84

0,18

5

К. В. Л.

34

М

17.02.98.

42

51

86

0,16

6

М. В. В.

40

М

17.02.98.

36

40

89

0,11

7

С. П. Б.

40

М

25.02.98.

47

51

84

0,18

8

Л. Е. В.

32

М

25.02.98.

35

41

85

0,17

9

Г. Т. Ю.

28

Ж

15.03.98.

36

40

85

0,11

10

А. И. А.

28

Ж

16.03.98.

46

53

86

0,15

11

Л. Л. Я.

40

Ж

16.03.98.

39

44

88

0,12

12

С. Б. И.

46

Ж

19.03.98.

54

63

86

0,16

13

С. И. В.

28

Ж

16.04.98.

36

50

89

0,11

14

М. А. И.

31

М

16.04.98.

36

42

86

0,17

15

Х. А. И.

37

М

22.04.98.

44

52

85

0,18

16

К. И. П.

30

М

22.04.98.

48

56

86

0,16

17

Р. И. И.

33

М

22.04.98.

43

48

90

0,12

18

И. И. А.

29

Ж

27.04.98.

42

47

89

0,12

19

И. В. А.

40

М

27.04.98.

49

56

88

0,14

20

М. И. В.

36

Ж

10.05.98.

35

41

85

0,17

21

С. В. Г.

32

М

10.05.98.

47

52

90

0,10

22

З. О. А.

32

М

12.05.98.

43

49

88

0,13

23

Я. В. В.

30

М

12.05.98

44

49

90

0,11

24

П. И. В.

31

М

17.05.98.

46

51

90

0,11

25

А. С. Б.

36

М

17.05.98.

51

55

92

0,07

26

С. А. И.

20

Ж

3.02.99.

44

51

86

0,15

27

М. И. В.

34

М

9.02.99.

48

54

89

0,13

28

Д. О. В.

37

Ж

9.02.99.

42

49

86

0,17

29

Т. С. Д.

22

М

16.02.99.

48

57

84

0,18

30

К. В. А.

28

М

9.04.99.

45

54

83

0,20

Μ

43

50

84,3

0,15

m

2,16

3,8

0,01

σ

14,9

15,41

0,03