Интегративные механизмы

Введение

Эксперименты, выполненные на беспозвоночные внесли существенный вклад в понимание клеточных и молекулярных механизмов нейронной сигнализации. Благодаря простой нервной системе, беспозвоночные, такие как мухи, пчелы, муравьи, черви, улитки и ракообразные, являются удобными объектами для изучения того, каким образом в нервной системе происходит интеграция информации и формирование целенаправленного поведения.

Наглядным примером является ЦМС пиявки. У пиявки можно различить отдельные нейроны, изучить их биофизические свойства, проследить контакты нейронов и определить роль идентифицированных нейронов в интегративных поведенческих актах, таких как рефлексы плавания или уклонение от препятствий. ЦНС пиявки состоит из 21 стереотипного ганглия, в каждом из которых находится около 400 нейронов. Индивидуальные сенсорные нейроны, мотонейроны и интернейроны могут быть идентифицированы как визуально, так и электрофизиологически. Каждая механосенсорная клетка в ганглии, реагирующая на прикосновение, давление или болевую стимуляцию, иннервирует определенную зону поверхности тела. Сенсорные клетки передают информацию к вставочным и двигательным нейронам через химические и электрические синапсы. После повторной стимуляции с физиологической частотой передача в сенсорных нейронах блокируется в точках ветвления аксонов. Это связано с тем, что тонкие аксоны в местах ветвления образуют дочерние отростки, большие по размерам, чем материнская ветвь. Этот механизм способен обеспечить временную изоляцию чувствительных клеток. Изучая нейронные связи беспозвоночных, можно, кроме того, изучать, каким образом отдельные нейроны образуют синаптические контакты во время развития нервной системы или в процессе регенерации нейронов после повреждения.

Клеточные механизмы интеграции и поведения у пиявок, муравьев и пчел

Муравьи и пчелы способны к сложным поведенческим реакциям. Это представляет для исследователя заманчивую возможность, изучая поведение этих беспозвоночных, понять принципиальные механизмы интеграции информации в нервной системе. Так, можно проследить связь между поведением животного и физиологической активностью мозга, рассмотрев при этом, как себя ведут отдельные идентифицированные нейроны. Анализируя путь, пройденный муравьем или пчелой, можно попытаться понять всю систему от свойств фоторецепторов до нейронных сетей, которые в целом обеспечивают подобное поведение. Например, пустынные муравьи мигрируют на длинные дистанции в поисках пищи. Во время поиска муравей движется зигзагом, «маятникообразно», однако после того, как источник пищи найден, муравей разворачивается и следует по направлению к гнезду наикратчайшим путем. Его ЦНС учитывает все движения вправо и влево, выполненные муравьем во время поиска пищи, рассчитывает его текущее положение относительно исходной точки и находит кратчайший путь к ней. Это возможно только при помощи точных координат, рассчитанных на основе поляризованного света солнца. Глаз пустынного муравья содержит особую группу фоторецепторов, способных воспринимать поляризованный свет. Эти фоторецепторы обеспечивают ЦНС информацией, необходимой для учета движений в пространстве и расчета нового вектора движения. Муравьи и пчелы являются примером того, как нервная система беспозвоночных при помощи относительно небольшого количества нейронов способна выполнять довольно сложные расчеты. Благодаря большому разнообразию нервных систем беспозвоночных, они являются излюбленным объектом для изучения клеточных механизмов поведения.

В этой книге мы не раз обращались к нейронам беспозвоночных для того, чтобы проиллюстрировать фундаментальные механизмы нейронной сигнализации. Так, например, при помощи большого по размерам аксона кальмара и его гигантского синапса были открыты универсальные законы проведения потенциала действия и принципы синаптической передачи. Клетки других беспозвоночных были использованы для того, чтобы проиллюстрировать пассивные электрические свойства мембран и механизмы ингибирования синаптической передачи.

Выбор беспозвоночных в качестве объектов исследований часто связан с методическими проблемами. Ряд технических проблем может быть проще разрешен с использованием нервной системы беспозвоночных. Во-первых, поскольку индивидуальные нервные клетки у них достаточно большие, то их можно использовать как для электрофизиологических, так и для молекулярно-биологических экспериментов. Во-вторых, хотя у беспозвоночных выработка определенного типа поведения требует определенных усилий, но оно всегда высокостереотипно, воспроизводимо и довольно легко может быть проанализировано. В-третьих, благодаря генетическим манипуляциям, плодовая мушка (Drosophifa melanogaster) и нематода Caenorhabditis elegans сыграли большую роль в изучении механизмов развития нервной системы. Эти механизмы остались настолько консервативными в процессе эволюции, что гены, кодирующие рецепторы или ионные каналы, имеют поразительно сходные последовательности у мух, червей и высших позвоночных. Например, у человека, так же как у дрозофилы или пиявки, гомеобоксные гены ответственны за развитие сегментов туловища, основных отделов мозга и специализированных органов, таких как глаза.

В то же самое время надо подчеркнуть, что любопытство исследователей при изучении нервной системы беспозвоночных не ограничивается только изучением тех принципов, которые в дальнейшем можно использовать для понимания организации нервной системы высших животных или человека. То, каким образом пиявка осуществляет плавательные движения, муравей ориентируется в пространстве, пчела «танцует», сверчок «поет» или мухи летают, все это является само по себе удивительно интересной проблемой.

От нейрона к поведению и обратно

Беспозвоночные предоставляют возможность проследить путь развития нейрона от рождения отдельной клетки до образования отростков и формирования связей. На подходящем беспозвоночном с большими нейронами можно проанализировать биофизические свойства отдельных клеток и наблюдать, как формируется координированное поведение всего организма. Аналогично можно изучать реакции на молекулярном уровне в клетках при изменении поведения животного в ответ на внешние влияния и заложенные внутренние программы. Подобного рода анализ возможен благодаря тому, что поведенческие реакции беспозвоночных высокостереотипны и осуществляются при участии относительного небольшого числа нейронов, в то время как подобные реакции у млекопитающих требуют участия тысяч нейронов.

Каждый вид нервной системы беспозвоночных имеет определенные преимущества для изучений той или иной проблемы. Нейронные сети, ответственные за элементы координированного поведения, такие как позные рефлексы, кормление, суточные ритмы, реакции избегания и плавание, были изучены на речных раках и улитках. ЦНС насекомых была использована для изучения различных проблем, включая развитие и регенерацию НС, полет и перемещение по земле, ориентацию в пространстве и коммуникация при помоши звуков. Количество видов беспозвоночных и спектр решаемых проблем настолько велики, что практически невозможно сделать общий обзор данной темы. К примеру, написано большое количество монографий о моллюске Aplysia, пиявках, морской улитке Hermissenda, речных раках и изолированных культурах нервных клеток беспозвоночных.

Для дальнейшего обсуждения мы выбрали нервные системы трех беспозвоночных. Пиявка, с ее примитивным поведением, стереотипным строением и функциями ЦНС и небольшим количеством нервных клеток, позволяет детально изучить свойства, связи и функции отдельных нервных клеток. У пчел же и муравьев изучение начинается с их коллективного поведения, что позволило подробно исследовать механизмы, позволяющие данным насекомым ориентироваться в пространстве, используя поляризованный свет и магнитные поля.

Интеграция информации отдельными нейронами в ЦНС пиявки

Со времен Древней Греции и Рима пиявки использовались врачами для лечения больных, страдающих такими заболеваниями, как эпилепсия, стенокардия, туберкулез, менингит и геморрой — довольно неприятное лечение, которое почти всегда приносило больше вреда, нежели пользы несчастным жертвам. К XIX веку использование медицинских пиявок приняло такой масштаб, что они практически исчезли в Западной Европе. Поэтому Наполеон был вынужден импортировать около 6 миллионов пиявок в год из Венгрии для лечения своих солдат. Эта «мания» хирудотерапии принесла свои определенные плоды: использование пиявок в медицине способствовало изучению их размножения, развития и анатомии. В конце XIX века основатели экспериментальной эмбриологии, такие как, например, Уитман, выбрали именно пиявку для того, чтобы проследить судьбу ранних эмбриональных клеток. Аналогичным образом их НС была тщательно изучена плеядой выдающихся анатомов, включая Рамон--и-Кахаля, Санчеса. Гаскелла, Дель Рио Хортега, Одури и Ретциуса. Затем интерес к пиявкам упал и вновь появился в I960 году, когда Стивен Куффлер и Давид Поттер¹⁶⁾ впервые применили современные нейрофизиологические методики для изучения свойств ее НС. Это способствовало началу интенсивного изучения ее развития, биофизики и молекулярной биологии, нервных связей и поведения.

Нервные клетки муравьев и пчел меньше по размеру и более трудны для изучения. Тем не менее, используя высокоточные наблюдения и эксперименты, можно раскрыть клеточные и интегративные механизмы, лежащие в основе их поведения. Именно таким образом стало возможно анализировать механизмы восприятия информации, используемые при решении задач высокой сложности муравьями и пчелами. Такой задачей является обнаружение удаленной цели и затем поиск кратчайшего пути обратно к гнезду. Системный подход к клеточной нейробиологии возможен только при подобного рода анализе: от поведения к мозгу, от целого мозга к отдельному нейрону. В следующих главах, которые посвящены сенсорным механизмам, восприятию и двигательной координации в ЦНС млекопитающих, мы вновь увидим, что отправной точкой в исследованиях клеточных механизмов является именно поведение (например, локация источника звука в пространстве).

Ганглии пиявки: полуавтономные единицы

Тело и НС пиявки сегментировано и состоит из большого числа стереотипных повторяющихся единиц (сегментов), которые имеют сходное строение. Каждый сегмент иннервируется стереотипно устроенным ганглием, все ганглии имеют близкое строение. Даже специализированный головной и хвостовой «мозг» состоит из слившихся ганглиев, и в нем легко прослеживаются многие свойства, характерные для сегментарного ганглия.

Каждый ганглий состоит примерно из 400 нейронов, которые имеют определенную форму, размер, расположение и ветвление (branching pattern). Ганглий иннервируетопределенную зону тела посредством парных нервов, а также соединяется с соседними и удаленными частями НС посредством дополнительных пучков волокон (коннектив). Интеграция информации осуществляется последовательно на следующих хорошо различимых этапах:

Рис. 1. ЦНС пиявки. (А) ЦНС пиявки представлена цепочкой из 21 сегментарного ганглия, головного и хвостового ганглия («мозг»). Каждый сегмент тела образован пятью круговыми кольцами; центральное кольцо содержит нервные окончания сенсорных органов, чувствительных к свету и прикосновению (сенсиллы). (В) Нервная цепочка находится в вентральной части тела, в брюшной лакуне. Ганглии, соединенные друг с другом пучками аксонов (коннектив). парными корешками иннервируют стенку тела. Мышцы образуют три основных слоя: циркулярный, косой и продольный. Кроме того, имеются дорзовентральные мышцы, сокращение которых уплощает пиявку, а также мышечные волокна непосредственно под кожей, образующие при сокращении складки.

1. Каждый сегментарный ганглий получает информацию от кольцевидного участка тела, который им регулируется.

2. Соседние ганглии влияют друг на друга посредством прямых связей.

3. Координированная работа всей нервной трубки и всего червя регулируется терминальными ганглиями, расположенными на обоих концах тела.

Наверное, самое привлекательное в изучении пиявок — это то, как нервный ганглий выглядит под микроскопом, когда отдельные нейроны хорошо различимы и имеют удивительно сходное строение от сегмента к сегменту, от особи к особи, от вида к виду (рис. 1). Глядя на это скопление клеток, расположенных в строгом порядке, нельзя не удивиться: каким образом они, эти отдельные клетки, образуют «мозг» и способны регулировать движение животного, остановки, уклонение от препятствий, спаривание, кормление и чувствительность? Кроме эстетического удовольствия от препарата, можно получить и интеллектуальное, раскрывая структуру связей и логику хорошо организованной НС на основе свойств отдельных клеток.

Прежде чем узнать, каким образом пиявка осуществляет свои движения, необходимо изучить отдельные клетки: их свойства, соединение и функции.

Наблюдения за экзоцитозом и эндоцитозом в живых клетках

Аналогичные эксперименты были проведены с использование высоко флуоресцентных меток для маркировки рециклированных везикул. Внедренная Бетцом и коллегами, эта методика дает то важное преимущество, что кругооборот везикул можно наблюдать в живом препарате по вызываемым стимуляцией накоплению и высвобождению метки. Эти исследования позволили обнаружить, что в нормальных физиологических условиях полный цикл экзоцитоза обратного захвата и формирования новых синаптических везикул занимает менее 1 минуты; восстановление же после более интенсивной стимуляции происходит медленнее. Более того, было показано, что захват флуоресцентных меток в пресинаптические бутоны культивируемых гиппокампалъных нейронов происходит квантовым образом, причем размер каждого кванта соответствует захвату одной синаптической везикулы. Такого рода квантовый захват происходит в течение секунд после начала стимуляции, предполагая что одиночные события экзоцитоза и эндоцитоза очень близко связаны. Эта методика позволяет анализировать квантовое высвобождение из отдельных пресинаптических бутонов без регистрации постсинаптических ответов. Поскольку регистрирующие электроды не нужны, эти оптические методы оказываются весьма удобными при исследовании пресинаптической функции и долговременной пластичности.

Многообещающим подходом для исследований экзоцитоза везикул является использование не нейрональных секреторных клеток, например, клеток молочной железы и хромаффинных клеток, в которых экзоцитоз больших и плотных секреторных гранул может быть исследован одновременно с помощью световой микроскопии, электрофизиологической регистрации и амперометрии, которая позволяет детектировать амины, выделяемые этими клетками. Слияние одиночных гранул с плазматической мембраной может быть зарегистрировано пэтч-электродом в виде увеличения электрической емкости клетки, которое возникает при добавлении мембранных гранул к клеточной поверхности; обратный же захват мембраны при эндоцитозе приводит к уменьшению емкости. Алмерс с соавторами в экспериментах на хромаффинных клетках добавили электрод из угольного волокна внутрь пэтч-электрода, чтобы измерить высвобождение катехоламинов, содержащихся в гранулах. Высвобождение обычно детектировалось одновременно с увеличением емкости, как это можно было бы предположить в случае экзоцитоза и включения гранулярной мембраны в плазматическую. Однако примерно 15 % событий высвобождения сопровождались кратковременным и неполным увеличением емкости. В этих случаях экзоцитоз, по всей видимости, происходил через маленькое, открываемое на короткое время отверстие (fusion роге), которое затем быстро закрывалось, позволяя грануле отойти обратно в цитоплазму без включения ее в наружную мембрану. Такие события типа «поцеловал и убежал» (kiss and run) могут позволить освобождаться маленьким молекулам, например, катехоламинам, чей запас может быть быстро восстановлен, но задерживать при этом большие белки, потеря которых может быть восполнена только путем синтеза абсолютно новых гранул в аппарате Гольджи.

Изменения емкости, связанные с высвобождением множественных квантов, были измерены в одиночных нервных окончаниях, выделенных из ЦНС позвоночных. Пока еще технически невозможно регистрировать изменение емкости, связанные со слиянием одиночных синаптических везикул. Хотя полное слияние синаптических везикул с пресинаптической мембраной явно происходит во время интенсивной стимуляции, остается неясным, может ли происходить в нормальных физиологических условиях высвобождение по механизму «поцеловать и убежать»

Литература

1. Пенроуз Р. НОВЫЙ УМ КОРОЛЯ. О компьютерах, мышлении и законах физики.

2. Грегори Р.Л. Разумный глаз.

3. Леках В.А. Ключ к пониманию физиологии.

4. Гамов Г., Ичас М. Мистер Томпкинс внутри самого себя: Приключения в новой биологии.